高转移卵巢上皮性癌基因表达谱中差异表达基因与染色体拷贝数变异的相关性

上传者：刘力夫
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高转移卵巢上皮性癌基因表达谱中差异表达基因与染色体拷贝数变异的相关性

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．临床研究．

高转移卵巢上皮性癌基因表达谱中

差异表达基因与染色体拷贝数

变异的相关性

应莉莎许沈华苏丹牟瀚舟顾琳慧朱赤红刘祥麟

【摘要】目的采用基因芯片技术研究高转移卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞株ＨＯ．８９１０ＰＭ和正常卵巢上皮组织基因表达谱的差异表达基因及其与染色体拷贝数变异的相关性。方法利用全基因组表达谱心Ｈ－片、单核ｆ｛：酸多态性（ＳＮＰ）扫描芯片分别检测高转移卵巢癌和正常卵巢上皮组织之间的差异表达基因以及染色体拷贝数变异情况，并采用生物信息学方法对检测结果进行相父性分析。筛选部分染色体片段和差异表达基因，用荧光原佗杂交技术和实时荧光定量ＰＣＲ技术进行验证。结果通过对表达谱芯片和ＳＮＰ扫描芯片整合分析显示，高转移卵巢癌细胞中有３７９个ＳＮＰ位点，共３８５个差异表达基因（其中有６个ＳＮＰ位点发现各有２个基因）。这些ＳＮＰ位点染色体拷贝数扩增的有２４０个，缺失的有１３９个。染色体定位分析发现，３８５个差异表达基闲散在分布于各条染色体上，其中３号染色体最多，有３４个（占８．８％，３４／３８５）；其次是２、９、１０、１和１１号染色体分别有３３个（８．６％）、２８个（７．３％）、２７个（７．Ｏ％）、２５个（６．５％）、２４个（６．２％）；６和１２号染色体各有２３个（６．０％）；４和５号染色体各有２２个（５．７％）；这１０条染色体占总数的６７．８％（２６１／３８５）。基因的功能分类：３８５个差异表达基因属于酶及其调控子基因的最多（９９个，占２５．７％），其次是信号传导基因（５４个，占１４．０％），第３类是核酸结合基因（５０个，占１３．０％），第４类是蛋白结合基因（３６个，占９．４％）；以上４大类共占差异表达基因总数的６２．１％（２３９／３８５）。结论肿瘤的转移是多基冈共同作用的结果。４大类（酶及其调控子、核酸结合、蛋白结合、信号传导）差异表达基因是今后研究卵巢癌转移相关的重要基因。１…２３４…５６９、１１和１２号染色体是值得关注的转移相关位点所在的染色体。

【关键词】卵巢肿瘤；细胞系，肿瘤；寡核苷酸序列分析；基凶表达谱；多态性，单核苷酸；染色体

Ｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｍｅｔａｓｔａｓｉｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｇｅｎｅｓａｎｄｉｔｓｃｏｐｙｎｕｍｂｅｒｓｖａｒｉａｔｉｏｎｉｎｈｉｇ州ｙｍｅｔａｓｔａｔｉｃｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｏｖａ—ａｎｃａｎｃｅｒ玎ⅣＧＬ／一ｓｈａ，ＸＵＳｈｅｎ—ｈｎａ，Ｊｓ“Ｄａｎ，ＭＯＵＨａｎ－ｚｈｏｕ，ＧＵＬｉｎ—ｈｕｉ，ＺＨＵＣｈｉ一｜ＩｌＤ，Ｗ，ＬｌＵＸｉａｎｇ—ｌｉｎ．ＺｈｅｊｍｎｇＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ．ＺｈｅｊｉａｎｇＣａｎｃｅｒＨｏｓｐｉｔａｌ．Ｈａｎｇｚｈｏｕ３ｌ００２２，ＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＸＵＳｈｅｎ．ｈｕａ．Ｅｒｎａｉｌ：ｓｈｅｎｈｕａｘｕ＠ｈｏｔｍａｉｌｃｏｒｎ

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｏｆｔｈｅｍｅｔａｓｔａｓｉｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｇｅｎｅｓａｎｄｉｔｓｃｏｐｙｎｕｍｂｅｒｓｖａｒｉａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｈｉｇｈｌｙｍｅｔａｓｔａｔｉｃｈｕｍａｎｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｏｖａｒｉａｎｃａｎｃｅｒｅｅｌｌｌｉｎｅＨＯ－８９１０ＰＭ．Ｍｅｔｈｏｄｓ

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ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０５２９－５６７ｘ．２００９．０２．０１２

基金项目：国家自然科学基金（３０４７１８１９）

作者单位：３１００２２杭州，浙江省肿瘤医院肿瘤研究所

通信作者：许沈华，Ｅｍａｉｌ：ｓｈｅｎｈｕａｘｕ＠ｈｏｔｍａｉＬｃｏｍ

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（７．３％），２７（７．０％），２５（６．５％），２４（６．２％）ｏｆｔｈｅｍｌｏｃａｔｅｄａｔｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ３，２，９，１０，１ａｎｄ

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【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｏｖａｒｉａｎｎｅｏｐｌａｓｍｓ；Ｃｅｌｌｌｉｎｅ，ｔｕｍｏｒ；Ｏｌｉｇｏｎｕｅｌｅｏｔｉｄｅａｒｍｙｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ；

Ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｉｎｇ；Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ

单核苷酸多态性（ＳＮＰ）是指在基因组水平，由ｃＲＮＡ，同时完成ｃＲＮＡ的生物素标记。将ｃＲＮＡ产于单个核苷酸变异引起的ＤＮＡ序列多态性。当前，物片段化（３５—２００ｂｐ），制成杂交液，分别注入高转ＳＮＰ的筛选及其检测正成为广泛关注的焦点。由于移卵巢癌细胞株和正常卵巢上皮组织芯片中，在杂ＳＮＰ分布广泛、数量多且相对稳定地存在于染色体交炉ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＯｖｅｎ６４０中杂交１６ｈ。染色后扫上。易于自动化、高通量的检测分析，已成为第３代描芯片，获取基因表达的荧光信号强度值，用预先选分子遗传标记…。全基因组ＳＮＰ扫描芯片可检测定的内参照基因（即管家基因）获取信号进行均衡染色体拷贝数变异，全基因组表达谱芯片可检测差和修正。采用ＧＣＯＳｌ．３软件对扫描图像进行数字异表达基因，但目前应用这两种高通量的芯片联合化处理，计算荧光信号的强度和检测值。以荧光信分析方法发表的研究论文不多旧引。本研究采用全号强度比值的对数（ｓｉｇｎａｌｌｏｇｒａｔｉｏ，ＳＬＲ）作为表达基因组ＳＮＰ扫描芯片和全基因组表达谱芯片技术，谱芯片分析的判定标准，与正常卵巢上皮组织比较，筛选、分析高转移卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞株和表达量差异在２倍及以上的基因（即ＳＬＲ≥１或正常卵巢上皮组织基因表达谱的差异表达基因及其ＳＬＲ一１）为差异表达基因；其中，ＳＬＲ≥１的基因与染色体拷贝数变异的相关性，探索卵巢癌转移相为表达上调，ＳＬＲ≤一１的基因为表达下调。并采用

生物信息学方法对检测结果进行相关性分析。

能，从分子水平了解卵巢癌转移的机制，为卵巢癌的２．全基因组ＳＮＰ扫描芯片检测高转移卵巢癌诊断、治疗提供分子标记和靶基因。的染色体拷贝数变异：采用全基因组ＳＮＰ扫描芯片

１０Ｋ

材料与方法２．０（美国Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ公司产品），该芯片包含

１００００多个ＳＮＰ检测位点，分布在全部的同源染色

一、主要材料体上，两个ＳＮＰ位点间距的平均值为２６ｋｂ。

高转移卵巢癌细胞株ＨＯ－８９１０ＰＭ是浙江省肿从高转移卵巢癌细胞株中提取ＤＮＡ进行多重

ＰＣＲ扩增，生物素标记后与ＳＮＰ扫描芯片杂交，染

色后扫描芯片。采用ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧＴＹＰＥ４．０软件从

杂交信号中收集杂合子或纯合子基因型信号。使用

染色体拷贝数分析工具（ＣＮＡＴ）３．０鉴别染色体拷

片，镜下观察，均为正常卵巢上皮组织。贝数扩增与缺失，参照组为１００个不同人种的个

二、方法体一ｊ。与正常卵巢上皮组织的染色体拷贝数比较，１．全基因组表达谱芯片检测高转移卵巢癌的比值＞１３的基因为染色体拷贝数扩增，比值≤１的基

因为染色体拷贝数缺失。

３．荧光原位杂交技术验证２ｑ３７．１的染色体拷

０００多个基因。贝数变异：根据表达谱芯片和ＳＮＰ扫描芯片的结用ＴＲＩｚｏ｜法分别提取高转移卵巢癌细胞株和果，采用荧光原位杂交（ＦＩＳＨ）技术对染色体２ｑ３７。１正常卵巢上皮组织的总ＲＮＡ。纯化后，各自取等量片段进行验证。将生物素标记的２ｑ３７．１染色体探

针（由北方基因组中心提供）与高转移卵巢癌细胞

的染色体杂交，通过荧光显微镜观察高转移卵巢癌

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（ＧｅｎｅＣｈｉｐＩＶＴｌａｂｅｌｉｎｇｋｉｔ）进行体外转录合成细胞该染色体区的拷贝数（杂交信号的位置和数关的基因群在染色体的定位和拷贝数变异及其功瘤医院肿瘤研究所建立的体外培养细胞株’引。正常卵巢上皮组织取自５例因卵巢囊肿而切除卵巢的患者，手术切除后立即取一部分剪碎后浸没于ＲＮＡ保护剂中，一８０℃保存备用；另一部分制作病理切差异表达基因：采用全基因组表达谱芯片Ｕ１３３Ａ２．０（美国Ｍｆｙｍｅｔｒｉｘ公司产品），该微阵列芯片含有１８ＲＮＡ备用。以ｒ１７．（ｄＴ）２４为引物，进行反转录实验。纯化后的双链ｃＤＮＡ，使用探针制备试剂盒

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量），共分析３０个以上的细胞。

４．实时荧光定量ＰＣＲ技术检测ＣＯｋ６Ａ３基因

的表达水平：筛选定位于２ｑ３７染色体区的胶原质Ⅵ

型ａ３（ＣＯＬ６Ａ３）基因，采用实时荧光定量ＰＣＲ（ｒｅａｌ

ｔｉｍｅ

ＰＣＲ）技术从转录水平进行验证，检测其表达水

平。分别提取高转移卵巢癌细胞株和正常卵巢上皮组织的总ＲＮＡ，逆转为ｃＤＮＡ进行荧光定量

ＰＣＲ扩增。引物序列如下：ＣＯＬ６Ａ３基因上游引物

为５７．ＡＣＡＧＣＧＡＴＧＡＴＧＴＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＴ．３’，下游引物为５７一ＴＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＧＧＴＣＴＧＣＧＴＴｃｒｒｒ－３’；内参照基因磷酸甘油醛脱氢酶（ＧＡＰＤＨ）上游引物为

５７一ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ．３

７，下游引物为

５’．ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡ耵１ｃ．３’。利用融解曲线软件分析扩增产物的特异性。以ＧＡＰＤＨ为内参照，根据实时定量ＰＣＲ的相对定量公式２“们“钊分别计算ＣＯＬ６Ａ３基因在高转移卵巢癌细胞株和正常卵巢上皮组织中的相对含量。每个样本重复２次。

结

果

一、两种芯片的杂交结果

表达谱芯片比较结果显示，高转移卵巢癌细胞与正常卵巢上皮组织存在２倍及以上差异表达的基因共有４７４３个，其中表达上调的基因（ＳＬＲ≥１）有２５８０个基因，表达下调的基因（ＳＬＲ≤一１）有２１６３个。

ＳＮＰ扫描芯片比较结果显示，高转移卵巢癌细胞与正常卵巢上皮组织比较，共有３５１８个ＳＮＰ位点存在染色体拷贝数扩增或缺失。

将表达谱芯片和ＳＮＰ扫描芯片的结果进行整合分析发现，有３７９个相同的ＳＮＰ位点，共３８５个差

异表达基因（其中有６个ＳＮＰ位点发现各有２个基

因）。这些ＳＮＰ位点染色体拷贝数扩增的有２４０个，缺失的为１３９个。染色体定位分析发现，所有３８５个差异表达基因散在分布于各条染色体上，

其中３号染色体最多，有３４个（占８．８％，３４／３８５），

其次是２、９、１０、１和１１号染色体分别有３３个（８．６％）、２８个（７．３％）、２７个（７．０％）、２５个（６．５％）、２４个（６．２％），６和１２号染色体各有２３个（６．ｏ％），４和５号染色体各有２２个（５．７％）。这１０条染色体上的差异表达基因占总数的６７．８％（２６１／３８５）。这些差异表达基因大多分布于染色体短臂，有２４１个（占总数的６２．６％，２４１／３８５）。见表１。

二、差异表达基因的功能分类结果

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甜注：…Ｐ’表示染色体长臂，“ｑ”表示染色体短臂

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从３８５个差异表达基因的功能分类看，属于酶

及其调控子基因的最多（９９个，占２５．７％）；其次是

信号传导基因（５４个，占１４．０％）；第３类是核酸结合基因（５０个，占１３．Ｏ％）；第４类是蛋白结合基因（３６个，占９．４％）；以上４大类共占差异表达基因总数的６２．１％（２３９／３８５）。还有功能未知的基因６４个，占１６．６％。见表２。

三、部分差异表达基因及其染色体定位分析

结果

通过表达谱芯片和ＳＮＰ扫描芯片的整合分析显示，共３８５个差异表达基因可能与卵巢癌的转移相关，本研究重点分析了表达差异较大（ＳＬＲＩ＞６和ＳＬＲ～＜一６）的基因及其染色体的定位，结果见表３。

四、ＦＩＳＨ技术的验证结果

正常卵巢上皮细胞２ｑ３７．１染色体片段分布于母本和父本的２条染色体上，应有４个杂交信号。ＦＩＳＨ实验发现，高转移卵巢癌细胞的该区段染色体杂交信号只有２个，表明该区段染色体的拷贝数在高转移卵巢癌细胞株中减少，与ＳＮＰ扫描芯片的结果相一致。见图１。

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表２高转移卵巢癌差异表达基因的功能分类

表３高转移卵巢癌的差异表达基因

及其染色体定位

五、实时荧光定量ＰＣＲ的验证结果

ＣＯＬ６ＡＢｍＲＮＡ的表达在高转移卵巢癌细

胞中明显下调，相对含量为０．００２，而在３份正

常卵巢组织中的相对含量分别为１．１７０、１．７６０、

１．３２０。图１高转移卵巢痈细咆的ＦＩＳＨ杂交Ｉ冬｛．町见２ｑ３７．１染色体片段在高转移卵巢癌细胞中的２个杂交信号（Ｔ）讨论本研究通过表达谱芯片和ＳＮＰ扫描芯片的整合分析，发现共有３８５个差异表达基因可能与卵巢癌的转移相关。这些基因分布于各条染色体上，但以３、２、９、１０、１、１１、６、１２、４和５号染色体居多，占总数的６７．８％。Ｆｉｓｈｍａｎ等。纠采用比较基因组杂交技术分析原发性和继发性卵巢癌的细胞，发现ｌｑ、２ｐ、２ｑ、３ｑ、６ｑ、８ｑ、１２ｐ、１８ｑ和ｘ染色体异常较常见，其中与本研究相同的有１、２、３、６和１２号染色体。Ｕｒｚｕａ等［８］采用比较基因组杂交技术分析鼠的人卵巢癌模型，发现１９、１５、５、４、７、８、９、１１、１２、１７、２２和ｘ染色体异常较常见，其中与本研究发现相同的有两种高通量芯片检测的方法可以得到比较全面的数据信息。综合本研究以及其他对卵巢癌的高通量研究，１、２、３、４、５、６、９、１ｌ和１２号染色体拷贝数的变异可能与卵巢癌的转移密切相关，是值得关注的研究重点。同时，本研究也再次证实，肿瘤的发生是一系列分子结构或成分变化的结果，是多种肿瘤相关基因表达失常或肿瘤抑制基因失活所致。肿瘤转移能力的获得，同肿瘤的发生、发展一样，是多基因的结构、功能和表达改变积累的结果。基因的遗传多态性是造成个体对肿瘤易患性不同的重要原因，同时也正由于这些重要基因的遗传变异导致肿瘤的发生、发展和转移。肿瘤的侵袭转移除了需要黏附反应和蛋白水解应，如对趋化因子的反应，肿瘤细胞有特异性表达的（ＣＸＣＬｌ２）及趋化因子ＣＣ配体８（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ

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ＣＣ－５、４、９、１１和１２号染色体。由此看出，本研究采用作用外，肿瘤细胞活跃的运动能力也是其中一个重要因素。肿瘤细胞能对多种不同的刺激物产生反趋化因子受体。本研究发现，趋化因子ＣＸＣ配体１２

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８，ＣＣＬ８）在高转移卵巢癌细胞株中表

达下调，其ＳＬＲ值分别为一８．９和一３．９。与蒋玉萍

等一。报道的ＣＸＣＬｌ２及其受体ＣＸＣＲ４对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭能力均有影响的结果相一致。同时，Ｐｏｒｃｉｌｅ等。１０１研究也指出，ＣＸＣＬｌ２与卵巢癌细胞的运动、侵袭密切相关，其可能通过激活表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）信号通路促进卵巢癌细胞的增殖和运动。

在本研究中，我们采用ＦＩＳＨ技术和实时荧光定量ＰＣＲ技术验证了两种芯片的杂交结果。与正常染色体相比，高转移卵巢癌细胞中２ｑ３７．１染色体片段的拷贝数减少。ＣＯＬ６Ａ３基因位于２ｑ３７染色体，其ＳＬＲ值为一６．７，实时荧光定量ＰＣＲ结果显示，ＣＯｋ６Ａ３ｍＲＮＡ的表达在高转移卵巢癌细胞中下调，低于正常卵巢上皮组织。ＣＯＬ６Ａ３基因属于细胞外基质结构分子，其编码的ａ３链是Ⅵ型胶原３条Ｏｔ链之一。Ⅵ型胶原主要分布在细胞外周，以无定形状态围绕在细胞周围，是细胞外基质的重要组成成分ｌｌ¨。细胞外基质的降解是恶性肿瘤浸润和转移机制之一¨２｜，本研究的结果支持了这一理论。

综上，采用两种高通量的芯片分析、筛选高转移卵巢癌细胞都有差异表达的相同基因，使实验的可靠性更有说服力。４大类（酶及其调控子、核酸结合、蛋白结合、信号传导）差异表达基因是今后研究卵巢癌转移相关的重要基因。１、２、３、４、５、６、９、１１和１２号染色体是值得关注的转移相关位点所在的染色体。这些异常基因是否可以作为卵巢癌转移治疗的靶点有待进一步的深入研究。

志谢感谢北方基因组中心分子遗传室王小维和王燮在ＦＩＳＨ检测过程中提供的技术支持

参考文献

［１］曹亚．肿瘤分子生物学研究进展．国外医学?生理、病理科

学与临床分册。２００５，２５：１＿４．

［２］ＧａｒｒａｗａｙＬＡ，ＷｉｄｌｕｎｄＨＲ，ＲｕｂｉｎＭＡ，ｅｔａＬ

Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｃ

ａｎａｌｙｓｅｓｉｄｅｎｔｉｆｙＭＩＴＦ∞ａｌｉｎｅａｇｅｓｕｒｖｉｖａｌ

ｏｎｃｏｇｅｎｅ

ａｍｐｌｉｆｉｅｄ

ｉｎ

ｍａｌｉｇｎａｎｔｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ，２００５，４３６：１１７．１２２．

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