分子生物学实验讲义

上传者：潘晓涛
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上传时间：2015-04-28
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分子生物学实验讲义

分子生物学实验 (基因工程部分) 实训一植物组织中DNA的提取（CTAB法提取植物基因组DNA）

授课教师：谢正林

CTAB法提取植物基因组DNA

【实验背景】

高等动物，高等植物的基因组相当庞大，一些物种的特定基因组包括了该物种生长，发育，繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量，因而对真核细胞基因组的结构，组成，以及表达调控的研究是至关重要的，而提取要求是获得纯度高和收得率高。

【实验目的】

1、掌握植物材料基因组DNA的CTAB法提取分离基本原理的方法；

2、掌握微量移液枪、液氮研磨、微量试管、高速离心机等使用操作技术。

【实验原理】

植物组织采用液氮研磨达到细胞破碎，细胞内容物采用CTAB分离蛋白质、多糖，再有苯酚、氯仿、异戊醇混合液萃取纯化，RNA由RNA酶消化，分离出的DNA由无水乙醇沉淀分离

【材料仪器】

材料：幼嫩的植物材料1.0g左右（红叶石楠）

仪器：移液枪、电子天平、恒温水浴箱、高速离心机、EP管、液氮、研磨等。

【实验试剂】

抽提缓冲液（2×CTAB溶液）：2％CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）、20mmol/LEDTA、1.4mol/L NaCL、1％β-巯基乙醇、

0.1％PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、100mmol/L Tris-HCl（pH=8.0） TE: 10Mm Tris-HCl（pH=8.0），1mM EDTA

其他试剂：液氮、RNA酶、氯仿、异戊醇、CTAB、无水乙醇、苯酚、EDTA等

【实验操作】

取1.0g植物材料，双蒸水洗净，并用滤纸吸干植物材料剪成0.5cm左右碎片，放入预冷的瓷研磨中。加入液氮速冷，研磨成细粉（越细越好）。

转入加有抽提缓冲液3.0ml的5ml离心管

60℃水浴保温1小时（不时转动试管）

分装成2个2.mlEP管，15,000 rpm，离心10分钟

取上清转入另一个新的离心管，加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），混合均匀抽提至水乳胶融状。

15,000 rpm离心5分钟

上清液转移到另一离心管中，加入0.8-1.0倍体积预冷异戊醇，-20℃保温30分钟－1小时，缓缓混匀DNA成絮状折出

15,000 rpm，离心5分钟，弃上清

DNA沉淀用冰冷的70％乙醇洗2次

挥发尽乙醇后，用200μl TE缓冲液溶解DNA，-20℃冻存。

【注意事项】

1、使用新鲜、幼嫩的材料，材料应适量。

2、如果样品容易呈粘稠状，可能含有较多的多糖。

3、如果样品溶液呈棕色，可能含有较多的酚类物质。

4、操作过程中避免剧烈振荡，器件、器皿和试剂需要高温灭菌。

【思考题】

1、为什么要用新鲜、幼嫩的植物组织材料？

2、为什么在操作过程中避免剧烈振荡？

3、为什么器件、器皿和试剂需要高温灭菌？

4、如何提高提取植物组织DNA的产量？

苯酚：作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。

氯仿：也可使蛋白质变性并加速有机相与液相分层。

异戊醇：有助于消除抽提过程中产生的气泡。

CTAB法原理 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来