蕺菜属资源rDNA+ITS序列分析

四川农业大学

硕士学位论文

蕺菜属资源rDNA ITS序列分析

姓名：赵欢

申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学

指导教师：吴卫

20080601

蕺菜属资源ｒＤＮＡＩＴＳ序列分析

研究生：赵欢

导师：吴卫教授

摘要

蕺菜为三自草科蕺菜属（ＨｏｕｔｔｕｙｎｉａｃｏｒｄａｔａＴｈｕｎｂ．）植物，具清热解毒、消痈排脓、利尿通淋等功能。四川省为蕺菜的主要产区之一。据《中国植物志》和《四川植物志》，蕺菜属植物仅蕺菜ＨｏｕｔｔｕｙｎｉａｃｏｒｄａｔａＴｈｕｎｂ．１种：２００１年，

Ｚ．Ｙ．Ｚｈｕ祝正银和张士良在峨眉山发现蕺菜属新种峨眉蕺菜Ｈｏｕｔｔｕｙｎｉａｅｍｅｉｅｎｓｉｓ

ｅｔＳ．Ｌ．Ｚｈａｎｇ。该种在峨眉、乐山等地俗称白侧耳根，也作蔬菜和鱼腥草药用。

四川和重庆地区的蕺菜资源分布很广，遗传多样性较大，存在１１种不同细胞型和２种不同化学型。本研究对四川和重庆地区的２３份蕺菜属资源的核糖体ＤＮＡ（ｒＤＮＡ）ＩＴＳ区序列进行分析，探讨其与蕺菜细胞型和化学型间关系。得到以下主要结果：

１．对２３份蕺菜属资源进行ｒＤＮＡＩＴＳ序列分析，得到１４７条ＩＴＳ序列，长度范围为６７０－－一６８４ｂｐ。其中，ＩＴＳｌ的长度变异范围为２３１－－一２４５ｂｐ，５．８ＳｒＤＮＡ和ＩＴＳ２的长度均分别为１６４ｂｐ、２７５ｂｐ。ＧＣ含量在所测材料中为５５．５％－－一５６．９％，平均值为５６．４％；其中，ＩＴＳｌ区的变化范围为５４．７％＂－５６－３％，ＩＴＳ２区为５８．９％～６０．４％，其平均值分别为５５．８％和５９．８％；５．８ＳｒＤＮＡ为５１．２％～５２．８％，平均值５１．８％。

２在所测２３份蕺菜属资源材料的ＩＴＳ区（含５．８ＳｒＤＮＡ）的１４７条序列中，共有４８个信息位点和１３６个变异位点，分别占总序列的７．０２％和１９．９％。其中ＩＴＳｌ具有２２个信息位点和５６个变异位点，分别占３．２２％和８．１９％；ＩＴＳ２有１６个信息位点和４０个变异位点，分别占２．３４％和５．８５％；５．８ＳｒＤＮＡ有８个信息位点和１６个变异位点，分别占１．１７％和２．３３％。

３．除Ｗ０１．１６、Ｗ０１．１００、和Ｗ１００．３７的个别序列外，其余每份材料的各ＩＴＳ序列长度均相同。Ｗ０１．１６、Ｗ０１．１００和Ｗ１００．３７的个别ＩＴＳ序列长度的变异均位于ＩＴＳｌ，ＩＴＳ２和５．８ＳｒＤＮＡ均无长度上差异。Ｗ１００．３７的ＩＴＳｌ长度在所测序列中变化范围最大，为２３１－一２４５ｂｐ。其中，以Ｗ０１—３７．７的ＩＴＳｌ长度最短

（２３ｌｂｐ）。

４．所有蕺菜材料细胞型（包括八Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，ＧＨ，Ｉ，Ｊ和Ｋ）内ＧＳ值分别为０．００５６、０．００４０、０．００９６、０．００７７、０．００９１、０．０１３７、０．００９２、０．００６９、０．００９３、０．００５８和Ｏ．００８９，平均值为０．００８２。以染色体数目为８２的细胞型类内ＧＳ值最大（０．０１３７），其次是染色体数目为７２的细胞型（０．００９６），染色体数目为５４的细胞型内ＧＳ最小（Ｏ．００４０）。

５．比较这１１种不同细胞型的ＩＴＳ序列可发现ｉ５．８ＳｒＤＮＡ序列高度保守，而ＩＴＳｌ和ＩＴＳ２核苷酸序列变化较大。细胞型内ＩＴＳ序列变异比细胞型间变异小。染色体数目小于７２的材料比染色体数目大于或等于７２的材料变异位点数目少。进一步分析发现，不同细胞型蕺菜材料类间ＧＳ值以染色体数目为３６和８２的细胞型间最大，为０．０１４９：以染色体数目为３６和５４的细胞型间最小，为０．００５１。

６．以白苞裸裸蒴ＡＦ２０３６２８为外分类群，根据蕺菜属资源ＩＴＳ序列遗传相似系数，采用邻接法（ｎｅｉｇｈｂｏｒｉｎｇｍｅｔｈｏｄ）进行聚类分析发现，基于ｒｒＳ序列划分的类群与细胞型间存在一定关系，所有供试材料的ＩＴＳ序列可分为５类。其中，Ａ类包括除ｗ０１．９９，ｗ０１—４５和ｗ０１．７１＃ｂ的所有材料，Ｂ类材料染色体数大于或等于７２：Ｗ０１—８１—１、Ｗ０１．８１．３和Ｗ０１．８１．４分别单独聚为一类。试验结果还表明，基于ＩＴＳ序列划分的类群与化学型间也存在一定关系。

７．聚类图表明，同一份材料的几个不同ＩＴＳ序列往往分布在不同的大类中，故利用ｒＤＮＡＩＴＳ序列不能将２３份不同材料全部区分开，且峨眉蕺菜Ｗ０１．８６与染色体数目为３６的蕺菜材料Ｗ０１．９、Ｗ０１．２２和Ｗ０１－４８在ＩＴＳ序列上无显著差异。试验结果还表明，蕺菜属资源根据ｒＤＮＡＩＴＳ区划分的类群同地理分布间相关不明显。关键词：蕺菜，种质资源，系统发育，ＩＴＳ，分子标记，细胞型，化学型

ＰｈｙｌｏｇｅｎｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｏｆＨｏｕｔｔｕｙｎｉａＴｈｕｎｂ．ｂａｓｅｄｏｎｉｎｔｅｒｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｓｐａｃｅｒ（ＩＴＳ）ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｎｕｃｌｅａｒｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡ

ＺｈａｏＨｕａｎ

ＤｉｒｅｃｔｅｄＢｙＤｒ．ＷｕＷｅｉ

Ａｂｓｔｒａｃｔ

ＨｏｕｔｔｕｙｎｉａｃｏｒｄａｔａＴｈｕｎｂ．ｂｅｌｏｎｇｓｔｏｇｅｎｕｓＨｏｕｔｔｕｙｎｉａｏｆＳａｕｒｕｒａｃｅａｅ．Ｉｔｈａｓｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ，ａｎｔｉ－ｖｉｒｕｓａｎｄｄｉｕｒｅｓｉｓ，ａｎｄｃｏｕｌｄｅｎｈａｎｃｅｂｏｄｙｉｍｍｕｎｉｔｙ．ＳｉｃｈｕａｎＰｒｏｖｉｎｃｅｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｍａｉｎｐｒｏｄｕｃｉｎｇａｒｅａｓｏｆＨ．ｃｏｒｄａｔａＴｈｕｎｂ．Ｈ．ｃｏｒｄａｔａｉｓｔｈｅｏｎｌｙｓｐｅｃｉｅｓｉｎＨｏｕｔｔｕｙｎｉａＴｈｕｎｂ。ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏＦｌｏｒａｅＲｅｉｐｕｂｌｉｃａｅＰｏｐｕｌａｒｉｓＳｉｎｉｃａｅａｎｄＦｌｏｒａＳｉｃｈｕａｎｉｃａ．Ｚｈｕｅｔａ１．（２００１）ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄａｎｅｗｓｐｅｃｉｅｓＨｅｍｅｉｅｎｓｉｓＺ．ＹＺｈｕｅｔＳ．Ｌ．ＺｈａｎｇｉｎｔｈｅｇｅｎｕｓＨｏｕｔｔｕｙｎｉａｃｏｌｌｅｃｔｅｄａｔＥｍｅｉｍｏｕｎｔａｉｎｉｎＳｉｃｈｕａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ．ＩｔＷａｓｃａｌｌｅｄｃｏｍｍｏｎｌｙａｓｗｈｉｔｅＹｕｘｉｎｇｃａｏ，ｗｈｉｃｈｗａｓａｌｓｏｕｓｅｄａｓｖｅｇｅｔａｂｌｅａｎｄＨＥＲＢＡＨＯＵＴＴＹＮＩＡＥｉｎＥｍｅｉａｎｄＬｅｓｈａｎｒｅｇｉｏｎｓ．ＨｏｕｔｔｕｙｎｉａｉｓｗｉｄｅｌｙｓｐｒｅａｄｉｎＳｉｃｈｕａｎａｎｄＣｈｏｎｇｑｉｎｇｒｅｇｉｏｎｓｏｆＣｈｉｎａ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇＩＩＣｙｔｏｔｙｐｅｓａｎｄ２Ｃｈｅｍｏｔｙｐｅｓ．ＴｈｅｒｅｅｘｉｓｔｅｄｐｌｅｎｔｉｆｕｌｇｅｎｅｔｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎｓａｍｏｎｇｇｅｎｕｓＨｏｕｔｔｕｙｎｉａｇｅｒｍｐｌａｓｍｒｅｓｏｕｒｃｅｓ．Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ．Ｔｈｅｍａｉｎｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ：

１．ＴｈｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｌｅｎｇｔｈｏｆｔｈｅｅｎｔｉｒｅＩＴＳｒｅｇｉｏｎｓ（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ５．８ＳｒＤＮＡ）ｉｎＨｏｕｔｔｕｙｎｉａＷａｓｆｏｕｎｄｔｏｆｌｕｃｔｕａｔｅｂｅｔｗｅｅｎ６７０ｂｐａｎｄ６８４ｂｐ．ＴｈｅｌｅｎｇｔｈｏｆＩＴＳｌｖａｒｉｅｄｆｒｏｍ２３１ｔｏ２４５ｂｐ，ｗｈｉｌｅｔｈａｔｏｆＩＴＳ２Ｗａｓｕｎｉｆｏｒｍｌｙ２７５ｂｐｆｏｒａｌｌａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ．Ｔｈｅｏｖｅｒａｌｌｌｅｎｇｔｈｏｆｔｈｅ５．８ＳｓｕｂｕｎｉｔｏｆａＵＨｏｕｔｔｕｙｎｉａａｃｃｅｓｓｉｏｎｓｅｘａｍｉｎｅｄＷａｓａｌｓｏｕｎｉｆｏｒｍｌｙ１６４ｂｐ．ＴｈｅＧ＋ＣｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｔｈｅＨｏｕｔｔｕｙｎｉａＩＴＳｗｅｒｅｓｉｍｉｌａｒ，ｗｉｔｈｖａｒｉａｔｉｏｎｆｒｏｍ５５．５％ｔｏ５６．９％ｆｏｒｔｈｅｅｎｔｉｒｅｓｐａｃｅｒｒｅｇｉｏｎ；ｆｒｏｍ５４．７％ｔｏ５６．３％ｆｏｒＩＴＳ１．ｆｒｏｍ５１．２％ｔｏ５２．８％ｆｏｒ５．８Ｓ，ａｎｄｆｒｏｍ５８．９％ｔｏ６０．４％ｆｏｒＩＴＳ２，ｗｉｔｈａｎａｖｅｒａｇｅｏｆ５６．４％，５５．８％，５１．８％，５９．８％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

２．ＡｌｉｇｎｍｅｎｔｏｆｔｈｅｅｎｔｉｒｅＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅｓｆｒｏｍ２３ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ．Ｉｔ

ｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎ６８４ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ，ｏｆｗｈｉｃｈ４３ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ（７．０２％）ｗｅｒｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅｓｉｔｅｓａｎｄ１３６ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ（１９．９呦ｗｅｒｅｖａｒｉａｂｌｅｓｉｔｅｓＴｈｅＩＴＳｌｒｅｇｉｏｎｈａｄ２２ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅｓｉｔｅｓ（３．２２％）ａｎｄ５６ｖａｒｉａｂｌｅｓｉｔｅｓ（８．１９％），ｗｈｉｌｅｔｈｅＩＴＳ２ｒｅｇｉｏｎｈａｄ１６ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅｓｉｔｅｓ（２．３４％）ａｎｄ４０ｖａｒｉａｂｌｅｓｉｔｅｓ（５．８４％）．Ｔｈｅｒｅｗｅｒｅ８ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅｓｉｔｅｓ（１．１７％）ａｎｄ１６ｖａｒｉａｂｌｅｓｉｔｅｓ（２．３３％）

３．Ｔｈｅｌｅｎｇｔｈｓｏｆａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｓｆｒｏｍｅａｃｈｉｎｔｒａ－ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｔａｘａａｒｅｓｉｍｉｌａｒｔｏｅａｃｈｏｔｈｅｒ，ｗｉｔｈｔｈｅｅｘｃｅｐｔｉｏｎｏｆＷ０１?１６、Ｗ０１—１００、ａｎｄＷ０１－３７，ｗｈｉｃｈｒｅｓｕｌｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｖａｒｉａｔｉｏｎｓｉｎＩＴＳｌ．ＴｈｅｏｖｅｒａｌｌｓｉｚｅｏｆｔｈｅＩＴＳ２ａｎｄ５．８ＳｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡｇｅｎｅｉｎＷ０１?１６、Ｗ０１—１００ａｎｄＷ０１—３７ｗｅｒｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，２７５ａｎｄ１６４ｂｐ．ＳｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＩＴＳ１ａｍｏｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎＷ０１－３７ｒｅｖｅａｌｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ，ｗｉｔｈｓｉｚｅｓｒａｎｇｉｎｇｆｒｏｍ２３１ｔｏ２４５ｂｐ．Ｗ０１－３７－９ｈａｄｔｈｅｓｈｏｒｔｅｓｔＩＴＳｌｌｅｎｇｔｈａｍｏｎｇｇｅｎｕｓＨｏｕｔｔｕｙｎｉａ，ｎａｍｅｌｙ２３１ｂｐ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆａｄｅｌｅｔｉｏｎｉｎｔｈｉｓａｃｃｅｓｓｉｏｎ．

４．Ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｉｎｔｒａｃｙｔｏｔｙｐｉｃｇｅｎｅｔｉｃｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ（ＧＳ）ｖａｌｕｅｓｗｉｔｈｉｎ１１ｃｙｔｏｔｙｐｅｓ（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ八Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，ＧＨ，Ｉ，ＪａｎｄＩ（）ｗｅｒｅ０．００５６，０．００４０，０．００９６，Ｏ．００７７，０．００９１，０．０１３７，０．００９２，Ｏ．００６９，０．００９３，０．００５８，Ｏ．００８９ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｉｔｈｔｈｅａｖｅｒａｇｅｏｆＯ．００８２．Ｔｈｅｉｎｔｒａｃｙｔｏｔｙｐｉｃｖａｒｉａｂｌｅｓｉｔｅｓ（４２）ａｎｄｔｈｅｉｎｔｒａｃｙｔｏｔｙｐｉｃｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅｓｉｔｅｓ（１５）ｏｆｃｙｔｏｔｙｐｅＦ（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｎｕｍｂｅｒｏｆ８２）ｗｅｒｅｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔ．Ｔｈｅｉｎｔｒａｃｙｔｏｔｙｐｉｃｖａｒｉａｂｌｅｓｉｔｅｓ（１５）ａｎｄｔｈｅｉｎｔｒａｃｙｔｏｔｙｐｉｃｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅｓｉｔｅｓ（４）ｏｆｃｙｔｏｔｙｐｅＢ（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｎｕｍｂｅｒｏｆ５４）ｗｅｒｅｔｈｅｌｏｗｅｓｔ．

５．Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｏｆｔｈｅ１１ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｙｔｏｔｙｐｅｓｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎ６８４ａｌｉｇｎｅｄｃｈａｒａｃｔｅｒｓ（ｗｉｔｈｏｕｔｇａｐｓ）．Ａｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆ１１ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｙｔｏｔｙｐｅｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆ

ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓｗｉｔｈｔｈｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｎｕｍｂｅｒｌｅｓｓｔｈａｎ７２ｈａｖｅｌｅｓｓｖａｒｉａｔｉｏｎ

ｔｈｏｓｅｗｉｔｈｔｈｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｎｕｍｂｅｒｍｏｒｅｔｈａｎ７２．ＴｈｅａｖｅｒａｇｅＧＳｂｅｔｗｅｅｎＨｅｍｅｉｅｎｓｉｓａｎｄ且ｃｏｒｄａｔａａｃｃｅｓｓｉｏｎｓｂａｓｅｄｏｎＩＴＳｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ０．００５１ｂｅｔｗｅｅｎｃｙｔｏｔｙｐｅＢａｎｄＡ（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｎｕｍｂｅｒｏｆ３６）ｔｏＯ．０１４９ｂｅｔｗｅｅｎｃｙｔｏｔｙｐｅＦａｎｄＡ．

６．Ｔｈｅｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇｄｉｓｔａｎｃｅｍｅｔｈｏｄｂａｓｅｄｏｎＨｏｕｔｔｕｙｎｉａＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｎａｌｙｓｉｓｗｉｔｈＡＦ２０３６２８ａｓｏｕｔｇｒｏｕｐＴｈｅａｃｃｅｓｓｉｏｎｓｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙｗｅｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｅｄａｓｔｈｒｅｅｓｏｌｅａｃｃｅｓｓｉｏｎｇｒｏｕｐｓａｎｄｔｗｏｂｉｇｇｒｏｕｐｓ（ｇｒｏｕｐＡａｎｄｇｒｏｕｐＢ）ｂａｓｅｄｏｎＩＴＳ．ＧｒｏｕｐＢｏｎｌｙｃｏｎｓｉｓｔｅｄｏｆＨｏｕｔｔｕｙｎｉａａｃｃｅｓｓｉｏｎｓｗｉｔｈｔｈｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｎｕｍｂｅｒ＞ＥＨｏｕｔｔｕｙｎｉａｔｈａｎ