西洋参活性部位对胰岛素抵抗大鼠基因mRNA表达的影响_李冀

2009年第26卷第6期中????医????药????信????息

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Vol??26,No??6,2009InformationonTraditionalChineseMedicine

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西洋参活性部位对胰岛素抵抗大鼠resistin基因

mRNA表达的影响

李冀,马育轩,葛鹏玲,刘微

(黑龙江中医药大学,黑龙江??哈尔滨??150040)

摘??要:目的:观察西洋参治疗胰岛素抵抗(InsulinResistance,IR)大鼠活性部位对Resistin基因表达的影响。方法:通过早期药效学试验证明,西洋参根部60%洗脱部分和30%洗脱部分为有效部位。本实验采用高脂饲料喂养加链脲佐菌素法复制IR大鼠(SD)的动物模型,造模成功后,将大鼠随机分为模型组、罗格列酮组、西洋参60%洗脱组、西洋参30%洗脱组。给药4周后,以RT-PCR法检测附睾周围白色脂肪组织中Resistin-mRNA的表达。结果:与模型组比较,各给药组大鼠脂肪组织中Resistin基因mRNA的表达均降低,其中以西洋参60%洗脱组作用最强,与模型组比较有极显著差异(P<0??01),西洋参30%洗脱组和罗格列酮组与模型组比较差异显著(P<0??05)。结论:西洋参可降低IR大鼠脂肪组织中Resistin基因的表达;西洋参60%洗脱部位降低Resistin基因表达的作用最明显。关键词:西洋参;胰岛素抵抗;Resistin基因

中图分类号:R285.6??????文献标识码:A??????文章编号:1002-2406(2009)06-0021-03????胰岛素抵抗(IR)是由遗传和环境因素导致的机体对胰岛素生理作用的反应性降低,即胰岛素促进葡萄糖摄取作用受损,导致代偿性胰岛素分泌增多,其重

[1]

要标志为高胰岛素血症。主要表现为外周组织对胰岛素敏感性下降,对葡萄糖的利用障碍

[2]

本实验观察西洋参治疗胰岛素抵抗(InsulinRe??sistance,IR)大鼠活性部位对Resistin基因表达的影响,以探讨其降低IR大鼠血糖的分子生物机制。1??材料与方法

1??1??动物

清洁级SD大鼠80只,雄性,体重160~180g,购自上海斯莱克实验动物有限公司,动物合格证号:SCXK(沪)2007-0007。1.2??仪器与试剂

PCR仪﹙美国PE公司﹚;梯度PCR仪﹙德国Bi??ometro公司﹚;高速冷冻离心机﹙美国Beckman公司﹚;凝胶成像系统﹙美国UVP公司﹚;电泳仪、电泳槽﹙北京市六一仪器厂﹚;西洋参﹙黑龙江省世一堂中药饮片厂,产品批号:0703129S﹚;罗格列酮:﹙黑龙江省人民同泰药店,产品批号:0409002﹚;链脲佐菌素(STZ,Sigma公司);RT-PCR3.0Kit﹙大连宝生物公司﹚;oligo6.0,PrimerPremier5??0(引物设计)﹙引物由上海博亚生物公司合成﹚。

1.3??西洋参的提取分离

西洋参19kg,粉碎,70%乙醇回流提取3次,每次1h,滤过,合并提取液,浓缩得浓膏(1mg??mL)。将浓膏进行大孔树脂柱层析(原药材与大孔树脂质量比为1:1),分别用水、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇洗脱,得各洗脱组分,并浓缩成干粉。通过早期药效学试,30-1

。

近年来发现的抵抗素(Resistin)成为研究IR相关

疾病的新靶点之一。抵抗素是一种富含半胱氨酸和丝氨酸残基、由二硫键连接成三聚体的蛋白分子

[4]

[3]

,广

泛作用于胰岛素的靶器官,对抗胰岛素,增加肝糖异生,使血糖升高,脂肪细胞增生而致IR和肥胖。

西洋参(PanaxquinquefoliumL.)为五加科多年生草本植物,又名花旗参,原产于美国和加拿大。目前国内有关单味药西洋参或其活性成分治疗IR的报道很少。文献检索见,西洋参茎叶总皂苷对IR脂肪细胞葡

[5]

萄糖转运、GLUT-4转运和CAP基因表达的影响及西洋参茎叶总皂苷对冠心病血糖异常者胰岛素敏感性的影响

[6]

。

基金项目:国家自然科学基金项目(30672632);黑龙江省杰出青年科学

基金项目(JC04-01)

作者简介:李冀(1960-),男,教授,博士生导师,黑龙江中医药大学副

校长,国家重点学科方剂学学科带头人,主要从事方剂配伍规律、作用机理及药效物质基础研究。

收稿日期:2009-09-08修回日期:2009-09-28

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中????医????药????信????息2009年第26卷第6期

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InformationonTraditionalChineseMedicineVo??l26,No??6,2009

效部位。

1.4??IR大鼠模型的制备及给药方法

80只SD雄性大鼠适应性喂养1周后,随机分为空白组(10只)和造模组(70只),正常组喂饲普通饲料,造模组应用高脂饲料(高脂饲料比例:猪油12%,蛋黄10%,糖15%,花生10%,盐5%,猪胆盐0??03%,基础饲料48%)。两组鼠分别喂养10周。其间,造模组按25mg??Kg

-1

总RNA(1??0??g????LRNasefreedH2OTotal应。

30??42??95??5??

-1

)1??0??L1??0ul8??5??L20??L

oligodTadaptor引物(2??5??M)

??将上述溶液混合并按以下条件进行反转录反

10min30min5min5min

BW一次性腹腔注射0??25%STZ溶

-1

液(溶于0??1mmol??L柠檬酸缓冲溶液,PH4??4);空白组腹腔注射等体积的枸橼酸盐缓冲液(0??1mmol??L,PH4??4)。饲养10w后,检测空腹血糖和空腹胰岛素,计算胰岛素敏感指数(ISI)。在造模组中筛选造模成功大鼠,共筛选出36只大鼠,随机分为模型组(8只)、罗格列酮组(10只)、西洋参60%洗脱组(9只)、西洋参30%洗脱组(9只)。各给药组按0??2g??kg

-1

-1

Ratresitingene(Genbankaccessionno.AF378366,primerposition167-579,productsize413bp,annealingtemperture55,30cycles)

5-'TGAAGCCATCAGCAAGAA-3'5-'CACCACCATCATCCCATT-3'1??5??2??ResistinPCR反应

??以反转录所得cDNA为模板进行PCR扩增,25ul反应体系中包含以下溶液或试剂:

10??PCRreactionbufferdNTPMixture(各10mM)引物1(10??M)引物2(10??M)EX-Taq(5U????L去离子水RTProducts

94??变性5min;94??30sec,55??60sec,30个循环;72??延伸10min。

??反应结束后,取PCR反应液(8ul)进行琼脂糖凝胶电泳,分析PCR产物。

??点样顺序均为:DL2000marker(2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp),模型对照组1-2(1-2),60%洗脱组1-2(3-4),30%洗脱组1-3(5-7),罗格列酮组1-3(8-10),空白对照组1-3(11-13)。

1??5??3??RT-PCR产物分析(光密度扫描法)

取PCR扩增产物10u,l以1.5%琼脂糖凝胶、100V电压电泳60min,GoldView染料染色,在紫外灯下观察结果、拍照。1.6??统计学处理

数据用SPSS软件处理,正态分布的资料以(x????s)表示,非正态分布的资料均取自然对数正态化后进行,0,??-1

(阳性对照药罗格列酮参考剂量)经大鼠体表面积折算成大鼠给药剂量;空白组和模型组每日灌服同等体积的蒸馏水。1.5??标本收集与检测

给药4周,于末次给药后,各组鼠分别禁食12h,将大鼠脱臼处死。立即取出腹腔及附睾附近的脂肪组织,放入液氮中,-70??冰箱中保存备用,观测脂肪组织中ResistinmRNA的表达。

脂肪组织中Resistin基因mRNA表达检测:取附睾周围白色脂肪组织50~100mg液氮冷冻后,置于研钵中,加入1mLTrizol充分研磨,抽提匀浆。将匀浆移入1??5mLEppendorf(EP)管,冰浴5min。每管加入0??2mL氯仿,剧烈震荡15s,冰浴2~3min。12000rpm??min

--1

2??5??L2??0??L0??5??L0??5??L

)0??25??L17??25??L2??0??L30sec,72??

??将上述溶液混合并按以下条件进行PCR反应。

、4??,离心5min,取水相移入

-1

1??5mL新EP管,加0??5mL异丙醇,轻摇混匀,冰浴放置10min。2000rpm??min、4??离心5min,弃去上清液,加入1mL75%乙醇(DEPC水配制),震荡拍匀(摇晃或拍打使RNA沉淀重新悬浮)。8000rpm??min、4??,离心5min,弃去上清液,超净工作台下倒置于干净滤纸上,自然干燥20min,加入DEPC水20ul混匀、溶解RNA,保存在低温冰箱中备用。1??5??1??Resistin反转录反应

??在0??2ml的PCR反应管中加入下列溶液或试剂:

10??reversetranscriptaseBufferMgCl2

dNTPMixture(各10mM)RNaseInhibitor(40U????L

-1

-1

2??0??L4??0??L

2??0??L

)

-1

0??5??L??

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??23??

2??结果

附睾周围脂肪组织ResistinRNA检测结果:其琼脂糖凝胶电泳结果如图1、2所示。用Labworks软件对其进行图像分析:扩增后得到??-actin707bp和附睾周围脂肪组织Resistin417bp两个片段,??-actin为内参照,与脂肪组织Resistin的扩增条件完全一致。将脂肪组织中Resistin电泳图像中各条带的密度值与相应的??-actin条带密度值的比值作为其mRNA的相对表达量。结果见表1。

表1??用药后对附睾周围脂肪组织中ResistinmRNA表达的影响(x????s)

组别空白组模型组罗格列酮组60%洗脱组30%洗脱组

????注:与空白组比较,0??05,

??

??

3??讨论

本实验采用高脂饲料喂养加链脲佐菌素法复制大

鼠(Wistar)的动物模型,此模型具有高血糖、高胰岛素、高血脂及胰岛素抵抗的特点。本课题前期实验结果已表明,西洋参能降低IR大鼠空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)水平(P<0??05)。说明西洋参可降低IR大鼠血糖,增强胰岛素敏感性。

高甘油三酯(TG)和游离脂肪酸血症是导致IR的重要因素

[8,9]

[7]

。亦据前期实验表明,西洋参60%和

30%乙醇洗脱部位均能降低IR大鼠高脂血症和胰岛

[10,11]

素抵抗指数。说明西洋参活性部位可改善脂质代谢紊乱及IR。

抵抗素可以促进前脂肪细胞的分化,增强小鼠肝糖异生,并与血胰岛素、血糖和血脂水平呈负相[12,13]关。本实验结果表明,西洋参30%和60%乙醇

??

n1081099P<0??05,

??

Resistin/Bactin0.572??0.1331.829??0.395??1.440??0.241????1.208??0.347

????

1.388??0.217????

P<0??01;与模型组比较,

P<

洗脱部位可降低大鼠附睾周围脂肪组织中Resistin-mRNA的表达量,其中60%乙醇洗脱组与模型组比较,差异极显著,说明抑制抵抗素(Resistin)基因mR??NA的表达可能是西洋参干预胰岛素抵抗的作用机制之一,且60%乙醇洗脱部位可能是西洋参改善胰岛素抵抗的重要活性部位。参考文献:

[1]??李秀钧.胰岛素抵抗综合征[M].北京:人民卫生出版社,2001:44-57.[2]??SowersJR,FrohlichED.Insulinandinsulinresistance:impacton

bloodpressureandcardiovasculardisease[J].MedClinNorthAm,2004,88(1):63-82.

[3]??SteppanCM,BaileyST,BhatS,eta.lThehormoneresistancelinkso??

besitytodiabetes[J].Nature,2001,50(9):2094-2099.

[4]??徐伟斌,俞璐,罗敏.抵抗素的研究进展[J].国际内分泌代谢杂

志,2006,26(1):23-25.

[5]??殷惠军,张颖,扬领海,等.西洋参茎叶总皂苷对IR脂肪细胞葡

萄糖转、GLUT-4转运和CAP基因表达的影响[J].中国药理学通报,2007,23(10):1332-1337.

[6]??张颖,陆曙,刘育英,等.西洋参茎叶总皂苷对冠心病血糖异常者

胰岛素敏感性的影响[J].中国中西医结合杂志,2007,27(12):1066-1069.

[7]??李冀,葛鹏玲,李胜志,等.西洋参对胰岛素抵抗大鼠血糖胰岛素

及血清瘦素的影响[J].辽宁中医杂志,2008(1):34-35.

[8]??BodenG.Roleoffattyacidinthepathogenesisofinsulinresisuance

andNIDDM[J].Diabetes,1997,46(1):3.

[9]??LeeY,HiroseH,OhnedaM,eta.l??-celllipotoxicityinthepatho??

geneslsofnon-insulin-dependentdiabetesmdlitusofobeserats:mpairimentinadipocyte??-cellrelationships[J].ProeNatlAcadSciUSA,1994,91(23):10878.

[10]??李冀,盛波,葛鹏玲,等.西洋参不同洗脱部位对胰岛素抵抗大鼠

脂代谢的影响[J].中医药信息,2008(3):13-14.

[11]??李冀,马育轩,葛鹏玲,等.西洋参治疗胰岛素抵抗大鼠活性部分

对骨骼肌转运蛋白-4mRNA表达的影响[J].中医药学报,2009,37(5):9-11.

[12]??GongH,NiY,GuoX,eta.lResistinpromotes3T3-L1preadipocyte

differentiaion[J].EurJEndocrino,l2004(150):885.

[13]??RajalaMW,QiY,patelHR,eta.lRegulationofresistinexpression

andcirculatinglevelsinobesity,diabetesandfasting[J].Diabetes,2004():P<0??01。

统计分析结果显示:与正常对照组比较,模型对照组及各给药组大鼠脂肪组织中ResistinmRNA的表达相对增强(P<0??01);与模型组比较,各给药组大鼠脂肪组织中ResistinmRNA的表达相应降低,其中以西洋参60%洗脱组作用最强,与模型组比较有显著性差异(P<0??01),而西洋参30%洗脱组和罗格列酮组与模型组比较均为P<0??05

。

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