肠道病毒71型在Cellspin系统中无血清微载体培养工艺的建立

肠道病毒71型在Cellspin系统中无血清微载体培养工艺的建立

DOI：10.13200/j.cjb.2013.03.120.zhouzh.007

中国生物制品学杂志2013年3月第26卷第3期ChinJBiologicalsMarch2013，Vol.26No.3·411·

·技术方法·

肠道病毒７１型在Ｃｅｌｌｓｐｉｎ系统中无血清微载体

培养工艺的建立

周正△，高晗△，杨志建，夏德镇，张高峡

上海泽润生物科技有限公司疫苗研发部，上海201203

摘要：目的建立肠道病毒71型（Enterovirus71，EV71）在Cellspin系统中无血清微载体培养工艺，为生物反应器培

方法在Cellspin培养系统中对Vero细胞进行微载体培养，考察不同种类培养基养EV71工艺的建立奠定基础。

MEM、DMEM／F12、VP-SFM、Opti-SFM、Opti-pro、MD505-199及不同微载体浓度3、5、10g／L对细胞密度的影响。分别以MOI为0.2及2.0接种EV71至Vero细胞，考察病毒接种量对病毒增殖的影响。分别按培养上清、微载体洗脱液模式收毒，比较不同组分中EV71的抗原含量及TCID50。结果采用5g／L微载体、VP-SFM培养基时，Vero细胞的密度达4.40×106个／ml；按MOI为2.0染毒，72h后即可收毒，较MOI为0.2的收毒时间早48h，按MOI为0.2染毒，收获液上清中的抗原含量达193.5U／ml，病毒滴度达8.43Log10TCID50／ml；按上清加洗脱液模式收毒，抗原

为生物反应器培养EV71含量可达573U／ml。结论成功建立了无血清微载体培养Vero细胞生产EV71的方法，

工艺的建立奠定了基础。

关键词：肠道病毒属；培养基，无血清；微载体；悬浮培养

中图分类号：R373.2R392-33文献标识码：A文章编号：1004-5503（2013）03-0411-05

Developmentofcultureprocedureofenterovirus71inVerocells

withserum-freemediumonmicrocarriersusingaCellspincell

cultivationsystem

ZHOUZheng，GAOHan，YANGZhi-jian，XIADe-zhen，ZHANGGao-xia

VaccineResearchandDevelopmentCenter，ShanghaiZerunBiotechnologyCo.，Ltd.，Shanghai201203，China

Correspondingauthor：ZHANGGao-xia，E-mail：zhanggaoxia@http://wendang.chazidian.com;

YANGZhi-jian，E-mail：yangzhijian@http://wendang.chazidian.com

Abstract：ObjectiveTodevelopaprocedureforserum-freecultureofenterovirus71（EV71）inVerocellsonmicrocarriersusingaCellspincellcultivationsystem.MethodsVerocellswereculturedonmicrocarriersinCellspincultivationsystem，basedonwhichtheeffectsofvariousmedia（MEM，DMEM／F12，VP-SFM，Opti-SFM，Opti-proand

）andconcentrationsofmicrocarriers（3，5and10g／L）oncelldensitywereinvestigated.EV71wasMD505-199

inoculatedontoVerocellsatMOIsof0.2and2.0respectively，andtheeffectofMOIonvirusproliferationwasevaluated.Theharvestedvirusliquidwaspooledintothreefractionsassupernatant，washandeluate，inwhichtheantigencontentsandTCID50werecompared.ResultsByusing5g／LmicrocarriersandVP-SFM，thedensityofVerocellsreached4.4×106cells／ml.TheharvesttimeofEV71inoculatedataMOIof2.0was72h，whichwas48hearlierthanthatataMOIof0.2.However，theantigencontentinharvestedsupernatantofEV71inoculatedataMOIof0.2reached193U／ml，whilethevirustiterreached8.43Log10TCID50／ml.TheantigencontentinEV71harvestedbycombiningthesupernatantandtheeluatefactionsreached573U／ml.ConclusionAmethodforproductionofEV71byserum-freecultureofVerocellsonmicrocarrierswasdeveloped，whichlaidafoundationofdevelopmentoferocellsbyusingaCellspincellcultivationsystemwasdeveloped，whichlaidafoundationofdevelopmentofaprocedureforcultureofEV71bybioreactor.

Keywords：Enterovirus;Medium，serum-free;Microcarrier;Suspensionculture

肠道病毒71型（Enterovirus71，EV71）属小RNA

通讯作者：张高峡，E-mail：zhanggaoxia@http://wendang.chazidian.com；

杨志建，E-mail：yangzhijian@http://wendang.chazidian.com

△：共享第一作者病毒科肠道病毒属，是引起手足口病（Hand，footandmouthdisease，HFMD）的主要病原体。近年来，HFMD在我国已有多次暴发流行，主要感染人群为5岁以下的婴幼儿，给公众健康带来了严重威胁。2009年

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及2010年报告的发病病例数分别为1155525和1774669，死亡病例数分别为353和905［1］。HFMD的大规模流行引起了人们的广泛关注，目前，已有若干企业研制的全病毒灭活疫苗进入临床Ⅰ-Ⅲ期（http：／／clinicaltrials.gov），但基本均采用细胞转瓶或细胞工厂培养工艺培养病毒［2］，且使用含牛血清成分的培养基，不利于下游的纯化和质控［3］。无血清细胞培养及生物反应器大规模培养病毒是病毒疫苗工艺发展的趋势。Cellspin及Spinner培养系统因能部分模拟生物反应器，被用于工艺开发中。与Spinner类似，Cellspin靠磁力旋转驱动搅拌桨转动实现细胞的悬浮培养，但与Spinner不同的是，Cellspin采用悬空玻璃钟锤作为搅拌桨，剪切力更小，更有利于细胞的生长。本实验采用Cellspin培养系统，对Vero细胞无血清微载体培养条件及染毒收毒条件进行考察，为生物反应器培养EV71工艺的建立提供参考。1材料与方法1.1细胞及病毒

Vero细胞（P133，无血清培养前

0.1%TritonX-100的1%结含0.1mol／L柠檬酸、

晶紫染色液37℃处理3h，释放并染色细胞核，显微镜下观察并计数细胞核来检测细胞密度。

1.4不同微载体浓度对Vero细胞微载体培养影响的检测使用VP-SFM培养基，分别以4×105、7.2×105、1.5×106个／ml的密度将Vero细胞接种入含3、5、10g／L微载体的250mlCellspin中，使每个微载体微球接种数目约为30个／球，于37℃，5%CO2条件下培养，搅拌速度35r／min。培养过程中取样，按1.3项方法检测细胞密度。

1.5不同MOI对病毒增殖影响的检测使用VP-SFM培养基，以4×105个／ml的密度将Vero细胞接种入含3g／L微载体的250mlCellspin中，培养96h后，分别以0.2、2.0MOI的EV71感染Vero细

CPE）胞，待细胞出现典型细胞病变（Cytopathiceffect，

并大部分脱落时，收集上清，检测收获液上清中病毒效价（TCID50）和抗原含量。

1.6CF培养病毒Vero细胞经Trypsin-EDTA消化传代至CF后，置37℃，5%CO2培养箱中培养，待

时，按0.2MOI加入相长成致密单层（75%~90%）

应量病毒，3d后收获病毒，检测收获液中病毒效价（TCID50）和抗原含量。

1.7不同收毒方式对病毒收获量影响的检测

取

将细胞在相应的培养基中进行无血清驯化5代）、RD细胞及EV71毒种（分离自2008年阜阳1例感染患者的咽拭子样本，命名为ZR14，C4亚型）由本公司疫苗研发部病毒研究室保存。

1.2主要试剂及仪器Trypsin-EDTA、非动物源性TrypLEselect、新生牛血清、MEM基础培养基（使用时加入5%新生牛血清）、低血清培养基Opti-pro（使用时加入2%新生牛血清）、无血清培养基VP-SFM和Opti-SFM均购自GIBCO公司；微载体Cytodex-1购自GE公司；EV71抗原检测试剂盒购自京天成生物技术（北京）有限公司；抗原标准品购自中国食品药品检定研究院，标示量1600U／ml；DMEM／F12（使用时加入2%新生牛血清）购自Sigma公司；MD505-199（使用时加入2%新生牛血清）购自清大天一公司；Cellspin培养系统购自IBS公司；细胞工厂（CellFactory，CF）购自赛默飞世尔科技公司。

1.3不同培养基对Vero细胞微载体培养影响的检测Vero细胞复苏后经CF扩大培养，使用非动物源性的TrypLEselect消化30min，按7.2×105个／ml的密度（相当于每个微载体微球接种数目为30个／球）接种含MEM、VP-SFM、Opti-SFM、Opti-pro、MD505-199及DMEM／F12培养基的250mlCellspin中，加入微载体至终浓度为5g／L，37℃，5%CO2条件下培养196h，搅拌速度35r／min。培养过程中取样，用

10ml含微载体的病毒收获液，1000r／min离心5min，

每次收集上清液；用PBS洗涤沉淀的微载体3次，

15min，合并洗涤液；用含1mol／LNaCl的PBS浸泡微载体15min，收集洗脱液。分别检测上清液、洗涤液、洗脱液中的抗原含量；将各溶液混合为合并液，测定其平均抗原含量，并与CF收获液的抗原含量进行比较。

1.8病毒滴度与抗原含量的测定病毒滴度的测定采用体外细胞微量滴定法，按中国食品药品检定研究院统一的方法进行。Reed-Muench法计算TCID50。抗原含量的测定采用EV71抗原检测试剂盒（使用双单抗夹心，TMB显色法检测，灵敏度10U／ml，线性范围4～120U／ml），以抗原标准品标定标准曲线后测定。2结果

2.1不同培养基对Vero细胞微载体培养的影响细胞在MEM、VP-SFM、DMEM／F12培养基中培养144h时，均达到生长曲线的高平台，接近最大细胞密度，分别为4.79×106、4.40×106和4.50×106个／ml；继续培养至196h时，在MEM和DMEM／F12培养

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3g／

3g／3g／5g／5g／5g／10g

L微载体1L微载体2L微载体3L微载体1L微载体2L微载体3／L微载体

基中培养的细胞仍能维持较高密度，但在VP-SFM培SFM、Opti-pro及MD505-199培养基中培养的细胞生长缓慢，在144h后脱落死亡。144h前，细胞在无血清培养基VP-SFM中的生长曲线与MEM、DMEM／F12培养基无明显差异，表明无血清培养基VP-SFM适合Vero细胞生长，且能达到较高的细胞密度。见图1。因此后续试验选择VP-SFM培养基。在VP-SFM及MEM培养基中培养的细胞4h与144h时的生长状态见图2。

6细胞密度（×106个／ml）

543210

24

48

72时间（h）

96

144

196

MEM

VP-SFMOpti-SFMOpti-proMD505-199DMEM／F12

细胞密度（×106个／ml）

养基中培养的细胞出现脱落死亡，密度下降。在Opti-

5.

4.4.3.3.2.2.1.1.0.0.05050505050

024487296144196

时间（h）

图3不同微载体浓度细胞生长曲线

Fig3.GrowthcurveofVerocellsculturedonmicrocarriersatvariousconcentrations

2.3不同MOI对病毒增殖的影响以0.2和2.0MOI的EV71感染Vero细胞，病毒收获液中的抗原含量及TCID50均无明显差异，表明不同MOI并不影响最

终收获液中的病毒含量；但MOI为0.2时收获时间比MOI为2.0时晚48h，比MOI为0.2时的CF的收获时间也晚48h。见表1。从节约毒种的角度考虑，选择MOI为0.2接毒。不同MOI病毒感染的细胞及CF培养的Vero细胞的细胞病变情况见图4。

表1不同MOI收获液中抗原含量及TCID50

Tab1.AntigencontentsandTCID50ofharvestedEV71liquidinoculatedatvariousMOIs

培养体系MOICFCellspinCellspin

0.20.22.0

抗原含量（U／ml）Log10TCID50／ml收获时间（h）

290.6193.5174.8

8.068.438.21

7212072

图1不同培养基中Vero细胞的生长曲线Fig1.GrowthcurveofVerocellsinvariousmedia

4h144h

VP-SFM

48h72h

MEM

CF

（0.2MOI感染）

图2不同培养基中Vero细胞生长状态（×100）Fig2.GrowthofVerocellsinVP-SFMandMEM（×100）

Cellspin（0.2MOI感染）

2.2不同微载体浓度对Vero细胞培养的影响3

和5g／L微载体中培养的Vero细胞最高细胞密度

分别为2.6×106和4.4×106个／ml；10g／L微载体中培养的Vero细胞增殖缓慢，于96h全部脱落死亡。见图3。因此确定5g／L微载体为适宜的培养浓度。

Cellspin（2.0MOI感染）

图4不同染毒方式Vero细胞的细胞病变情况（×100）Fig4.CPEsofVerocellsinoculatedatvariousMOIs（×100

）

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2.4不同收毒方式对病毒收获量的影响上清液、

洗涤液及洗脱液中的抗原含量检测结果可见，Cells-pin对应的病毒合并液抗原总量为5726U，高出CF收获液中的抗原含量近1倍。见表2。

表2不同收集组分抗原含量

Tab2.Antigencontentsinvariousharvestedfractions

样品CF收获液上清液洗涤液洗脱液合并液

体积（ml）抗原含量（U／ml）总抗原含量（U）Log10TCID50／ml101050565

2901938.374588

2900193041337255720

8.068.43

从无血清培养基生研究院疫苗研发中心［2］报道，

VP-SFM、PlusVero、Excell、HyQ中筛选，发现VP-SFM最有利于Vero细胞的生长，在细胞工厂中用其培养病毒开发的灭活EV71疫苗现已进入Ⅰ期临床试验。新加坡过程研究所［11］报道，从OptiProSFM、EX-CELLVeroSFM、VP-SFM、Provero-1、HyQSFM4-Mega-Vir中筛选适合Vero细胞的无血清培养基，发现VP-SFM明显优于其他4种。本文利用Cellspin培养系统，也发现了VP-SFM培养基为微载体培养Vero细胞的最适无血清培养基；TrypLEselect作为无血清培养专用消化酶，与VP-SFM可很好地结合使用，无需中和，操作简化，培养的Vero细胞最高密度达4.4×106个／ml，与文献［10-12］报道水平相当。与巴斯德所疫苗研发事业部的研究［10］不同，本研究的结果表明VP-SFM培养基的培养效果与含血清MEM培养基基本一致。Liu等［13］利用无血清培养基M-VSFM、5g／L微载体培养Vero细胞生产EV71（B4基因型），发现染毒后，与含血清培养基比较，无血清培养的细胞容易死亡，从而导致病毒产量下降。本文没有观察到此现象，推测可能是因为毒株或无血清培养基的不同导致。

生物反应器中微载体的使用浓度多在2～10g／L，

由于该系统无法控制pH、溶氧、葡但对于Cellspin，

萄糖等浓度，在细胞密度较高时会引起这些指标较

大变化，进而抑制细胞生长，因而微载体浓度多控制在2～5g／L。本文研究结果表明，在低于5g／L微载体培养的条件下，细胞生长良好，过程可控；但当微载体浓度达到10g／L时，细胞无法维持正常的生长状态，96h时全部脱落死亡。

EV71感染Vero细胞时，在微载体上感染过程与CF中存在差异。在微载体培养条件下，细胞出现病变比在CF中慢48h，提高病毒接种量可缩短感染时间，推测微载体影响病毒感染细胞。微载体表面修饰有DEAE基团，为带正电荷的微球，能吸附负电荷，可将其看成阴离子交换介质；病毒在培养环境下也带负电荷，会以阴离子交换的方式吸附到微载体微球上，从而影响染毒过程。这一结果意味着在实际应用中，不能按CF或细胞转瓶的感染条件感染利用微载体培养的Vero细胞，而需要提高染毒时的MOI，从而加快染毒过程，缩短收毒时间。基于细胞在微载体上病变晚于CF，本研究设计了收毒实验。利用高离子浓度的溶液将微载体表面可能吸附的病毒洗脱，并检测抗原含量。不同组分中的抗原含量相比较，由高到低依次为：洗脱液>上清液>洗涤液，说明病毒主要分为两部分，一部分吸附

3讨论

微载体培养是贴壁依赖型细胞大规模培养的主要方法，国外已有疫苗使用微载体培养技术进行大

规模工业化生产［4］。Cellspin培养系统能模拟生物反应器，可同时进行多组平行实验，从而缩短实验周期，因此在考察工艺的早期阶段，可使用Cellspin培养系统进行微载体悬浮培养工艺的开发［5］。基于防止病毒污染、纯化工艺和产品质控的考虑，细胞培养基的无血清化以及无动物源性化或化学限定成分培养基已成为细胞培养工艺发展的趋势［6-7］，无血清培养工艺的终产品具有更高的质量及安全性。《重组制品生产用哺乳动物细胞质量控制技术提倡采用无血清培养基，并尽可能减评价一般原则》

少用于处理细胞的动物来源的蛋白酶。张韧［7］报道美国及欧盟倾向于停止牛血清在生物制药中的应用。基于质量及政策法规的考虑，国外已有若干企业采用无血清工艺开发产品，如百特公司的流感疫苗Influjet、Celvapan及诺华公司开发的流感疫苗Optaflu已上市销售；巴斯德开发的狂犬疫苗已进入Ⅲ期临床试验；波兰血清研究所［8］开发的无血清注射型脊髓灰质炎疫苗与无细胞百白破联合疫苗的临床试验显示具有较好的安全性及免疫原性。

由于无血清培养基没有血清对胰酶的中和作用，通常在细胞传代工艺中使用胰酶抑制剂或非动物源性消化酶。TrypLEselect作为一种非动物源性消化酶，使用时不需要血清中和［9］。巴斯德所疫苗研发事业部［10］报道，利用Spinner培养系统在无血清培养基VP-SFM及TrypLEselect条件下建立了Vero细胞生产狂犬病毒的微载体工艺，发现VP-SFM培养基培养的效果优于含血清培养基。中国台湾卫

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在微载体上，一部分释放到上清液中，且吸附在微载体上的病毒量与释放到上清液中的病毒量基本一致。证实了在微载体培养条件下，病毒与微载体存在离子交换吸附作用，这个作用来源于微载体表面包裹的阳离子手臂DEAE。改进的收毒工艺可显著提高抗原得率，意味着利用微载体大规模生产EV71收毒时，需增加洗脱步骤。相同接毒体积比较，Cellspin中的TCID50高于CF，但抗原含量却低于CF。推测因为EV71含实心

TCID50测定的是实心颗粒，而与空心两种颗粒［14-15］，

抗原含量测定的是实心及空心颗粒，不同培养条件会产生不同比例的两种颗粒，因而出现抗原含量与TCID50并不一致这一现象。

综上所述，本研究通过Cellpin培养系统建立了

为后续生物反无血清微载体悬浮培养EV71的工艺，

应器培养EV71奠定了良好基础。

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（收稿日期：2012-06-04）

消息··

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