IL_11基因甲基化水平与原发性胶质母细胞瘤预后的关系_王利

·174·

中国微侵袭神经外科杂志2015年04月20日第20卷第4期ChinJMinimInvasiveNeurosurg,VOL.20,NO.4,April20,2015

·实验研究·

IL-11基因甲基化水平与原发性胶质母细胞瘤预后的关系

王

利，闫长祥

【摘要】目的检测IL-11基因在原发性胶质母细胞瘤（GBM）中的甲基化水平，分析其与原发性GBM预后的关系。方法采用亚硫酸氢盐测序法（BSP）定量检测IL-11基因在36例原发性GBM及8例正常脑组织标本的甲基化水平。将病人术后生存时间，绘制成Kaplan-Meier生存曲线，并进行log-rank检验分析。将IL-11基因甲基化水平与术后病人生存时间进行相关性分析。结果IL-11基因平均甲基化水平在原发性GBM与正常脑组织无显著性差异（P＞0.05）。在原发性GBM病例中，长生存期（≥16个月）病例平均甲基化水平高于短生存期（＜12个月）病例（P＜0.05）。生存分析显示：IL-11基因甲基化阳性病例的术后生存时间明显长于甲基化阴性病例（P=0.001）。相关性分析显示：IL-11基因甲基化水平与术后生存时间高度相关，但与病人年龄、性别等临床病理特征无明显相关性（P＞0.05）。结论IL-11基因高甲基化水平与原发性GBM病人术后长生存期密切相关。

【关键词】胶质母细胞瘤；IL-11基因；甲基化；预后中图分类号：R730.264

文献标志码：A

doi：10.11850/j.issn.1009-122X.2015.04.014

RelationshipbetweenIL-11genemethylationlevelsandtheprognosisofprimaryglioblastoma

WangLi,YanChangxiang

DepartmentofNeurosurgery,SanboBrainHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100093,China

Abstract:ObjectiveTodetecttheIL-11genemethylationlevelsinprimaryglioblastoma(GBM)andstudytherelationshipbetweengenemethylationlevelandpatient'sprognosis.MethodsIL-11genemethylationlevelwasquantitativelydetectedbysodiumbisulfitesequencingin36primaryGBMsamplesand8normalbrainsamples.Patients'postoperativesurvivaltimesweredrawnintoKaplan-Meiercurvesandanalyzedbythelog-ranktest.ThecorrelationofIL-11genemethylationlevelwithpatient'spostoperativesurvivaltimewasalsoanalyzed.ResultsThemeanIL-11genemethylationlevelsshowednosignificantdifferencebetweenthetumorsamplesandnormalbrainsamples(P>0.05).InprimaryGBMpatients,meangenemethylationlevelinthelong-timesurvivalgroup(≥16months)wassignificantlyhigherthanthatinshort-timesurvivalgroup(<12months)(P<0.05).Survivalanalysisshowedsurvivaltimewassignificantlylongeringene-methylatedgroupthanunmethylatedgroup(P=0.001).Correlationanalysisshowedgenemethylationlevelswerehighlyrelatedtopatient'spostoperativesurvivaltime,butnocorrelationwithpatient'sclinicalcharacteristics(P>0.05).ConclusionsAhighIL-11genemethylationleveliscloselyrelatedtolongerpostoperativesurvivaltimeinGBMpatients.

Keywords:glioblastoma;IL-11gene;methylation;prognosis

本研究采用亚硫酸氢盐测序法（BSP）定量检测原发性胶质母细胞瘤（GBM）及正常脑组织标本中IL-11基因的甲基化水平，探讨IL-11基因甲基化水平与原发性GBM预后及临床病理特征间的关系，以筛选新的预测病人预后的分子标记物。

性GBM肿瘤标本36例，其中20例定义为短生存期组（生存期＜12个月），16例定义为长生存期组（生存期≥16个月）；男23例，女13例；年龄＜45岁15例，≥45岁21例。肿瘤均位于额叶，术前均未接受伽玛刀、放疗或化疗，术前及术后生活质量评分（KPS）≥80分，显微镜下全切除，术后接受60Gy放疗及替莫唑胺6个疗程的标准化疗，术后随访36个月。8例正常脑组织标本来自颅脑损伤行颅内减压术病例。标本切除后立即置于液氮罐内冷冻保存，后转入－80℃、超低温冰箱储存。

1材料与方法

1.1实验材料选取首都医科大学三博脑科医院2008年-2010年手术切除，术后经病理证实的原发

基金项目：国家自然科学基金（编号：81272805）；北京市科委“首都临床特色应用研究”专项（编号：Z121107001012064）作者单位：100093首都医科大学三博脑科医院神经外科通讯作者：闫长祥，Email：yancx65828@http://wendang.chazidian.com

1.2重要试剂和仪器dNTP-mix、Platinum-DNA-Polymerase及TA克隆试剂（Invitrogen公司），MethylCodeTMBisulfiteConversionKit（Life公司），

内容需要下载文档才能查看 内容需要下载文档才能查看 内容需要下载文档才能查看 内容需要下载文档才能查看

中国微侵袭神经外科杂志2015年04月20日第20卷第4期ChinJMinimInvasiveNeurosurg,VOL.20,NO.4,April20,2015

·175·

AxyPrep基因组DNA小量试剂盒、凝胶回收试剂盒

和质粒提取试剂盒（Axygen公司），琼脂糖（Oxoid公司）。精密恒温水浴PC200、ThermoScientificForma900系列超低温冰箱、Revco-20C酶制剂保存箱、MaxQ416HP摇床及ThermoScientificHeraeusMultifugeX3系列离心机（ThermoFisherScientific公司），ABI-9700普通PCR仪及3730测序仪（ABI

公司）。

22.1

结果

IL-11基因甲基化水平通过CpG岛预测软件，我们发现IL11基因序列含有1个CpG岛，包含8个CpG位点（图1）。甲基化水平=甲基化位点数/总位点数×100%。经统计学分析后：正常脑组织、肿

瘤组织、短生存期组、长生存期组的基因平均甲基化水平分别为（23.75±5.82）%、（18.02±20.45）%、（5.50±4.04）%、（33.67±22.02）%。正常脑组织与肿瘤组织之间的差异无统计学意义（P＞0.05，图2）；长生存期组的平均甲基化水平明显高于短生存期组（P＜0.05，图3）。

1.3方法及步骤

1.3.1基因组DNA提取和亚硫酸氢盐修饰：采用AxyPrep基因组DNA小量试剂盒从冷冻标本中提取DNA，然后用MethylCodeTMBisulfiteConversionKit对所提取基因组DNA进行处理，操作步骤均按

照试剂盒说明书进行。

1.3.2引物设计及PCR扩增：引物设计采用MethPrimer软件（美国生物应用公司），引物序列：上游引物（正向）5’-TTTGAGTTTGAGTGTTTGTTT-3’，下游引物（反向）5’-ACCTAACACATCCTAACTCACC-3’，扩增片段长218bp。PCR反应总体系为25μl：含1.0μl模板DNA，4.0μldNTP，1.0μl引物，0.2μlTaq聚合酶，12.5μl缓冲液及6.3μl去离子水。反应条件：95℃5min，95℃30s，56℃30s，72℃1min，35个循环后72℃延伸5min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，凝胶回收试剂盒对PCR产物进行回收纯化。

1.3.3PCR产物连接、转化及测序：将回收的PCR产物与pMD18-T质粒（Invitrogen公司）连接，16℃连接30min以上，取5μl连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布至含氨苄无抗性的LB平板，37℃培养过夜至克隆长出，每个平板挑选10个克隆进行菌落PCR鉴定，质粒提取试剂盒提取质粒并送测序。BSP测序法原理为：亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶（C）被转化为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶（C）则保持不变。基因组DNA经亚硫酸氢盐修饰后，设计BSP引物扩增目的片段，此时尿嘧啶（U）全部转化为胸腺嘧啶（T），最后对PCR产物进行测序就可判断CpG

位点是否发生甲基化。

图1位点

BSP分析结果IL-11基因序列含有1个CpG岛，包含

8个CpG位点。黑色圆圈：甲基化位点，白色圆圈：未甲基化

25.00平均甲基化水平

平均甲基化水平

40.00

P＞0.05

30.0020.0010.000.00

P＜0.05短生存期

长生存期

20.0015.0010.005.000.00

肿瘤组织正常组织

图2正常脑组织与肿瘤组织平均甲基化水平图3长生

存期组与短生存期组平均甲基化水平

2.2IL-11基因甲基化状态与临床病理特征及术后生存期的关系（表1）甲基化率大于正常组织平均甲基化率与其2倍的标准差之和（相当于95%可

信区间上限）就可判定为甲基化阳性。按此标准[1]，

1.4统计学分析采用SPSS17.0统计软件，数据以±s表示，两组间均数比较采用t检验，基因甲

基化状态与病人临床病理特征之间的关系比较采用χ2检验；将病人术后生存时间绘制成Kaplan-

IL-11基因的甲基化水平＞35.39%判定为甲基化阳

性，余判定为甲基化阴性。肿瘤标本的总体甲基化阳性率为19.44%（7/36），长生存期组的甲基化阳性率为43.75%（7/16），短生存期组的甲基化阳性率为

Meier生存曲线，并进行log-rank检验分析；将病人

基因甲基化水平与术后生存时间进行相关性分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

0%（0/20），两组间甲基化阳性率差异具有统计学意义（P＜0.05）。IL-11基因甲基化状态与病人年龄、

·176·

中国微侵袭神经外科杂志2015年04月20日第20卷第4期ChinJMinimInvasiveNeurosurg,VOL.20,NO.4,April20,2015

性别等无明显相关性（P＞0.05）。

将甲基化阳性与甲基化阴性病人的术后生存时间，绘制成Kaplan-Meier生存曲线，并进行log-

敏感性，同时能延长病人总生存期及无进展生存期[5-6]。然而，可能有更多的分子标记物与GBM发生、发展及预后存在密切相关性。

rank检验分析。结果显示：IL-11基因甲基化阳性病

人的术后生存时间明显长于甲基化阴性病人，两者间差异具有统计学意义（P=0.001，图4）。相关性分析显示：病人基因甲基化水平与术后生存时间之间有统计学意义（r=0.770，双侧Spearman检验，P＜

IL-11基因定位于人类染色体19q13.3-q13.4，

编码的细胞因子IL-11是细胞因子IL-6家族的一

员[7]，其表达于各种组织及产生多种生物活性[8]。研究发现IL-11基因高表达与胃腺癌的进展及侵袭性密切相关[9]。另有报道证实IL-11基因高表达与乳腺癌及肝细胞癌预后不良存在相关性[10-11]，此外还能增加乳腺癌、子宫内膜癌及软骨肉瘤的转移能力[12-14]。近年研究发现IL-11基因异常甲基化可能与GBM预后有关[15]。

本研究采用BSP检测36例原发性GBM及8例正常脑组织标本中IL-11基因甲基化水平。发现肿瘤组织与正常脑组织的IL-11基因平均甲基化水平无显著性差异，推测IL11基因异常甲基化可能与原发性GBM的发生无明显相关性，但本研究正常脑组织标本量较少，因此，有待进一步增加正常脑组织标本量深入研究，以获得更具统计学意义的结论。此外，发现长生存期病例的平均甲基化水平明显高于短生存期病例，生存分析显示甲基化阳性病例的术后生存时间明显长于甲基化阴性的病例，以及相关性分析显示病人IL-11基因高甲基化水平与术后长生存期高度相关。提示IL-11基因高甲基化水平与原发性GBM病人术后长生存期存在相关性，可成为一种新的预测病人预后的指标。

对于IL-11基因高甲基化水平与原发性GBM病人术后长生存期相关的具体机制尚不清晰。基因高甲基化水平往往抑制其表达[16]。此外，IL-11基因高表达与多种肿瘤化疗耐药性密切相关[17-19]。因此，我们推测：在原发性GBM中IL11基因的甲基化水平越高，其表达程度就越低，从而对化疗药物敏感

0.001），可见，IL-11基因高甲基化水平与术后长生

存期高度相关。

表1IL-11基因甲基化状态与病人临床病理特征间的关系项

目

n

IL-11基因甲基化

阴性

阳性

P值0.418

年龄（岁）

＜45≥45

性别男女

术后生存时间

152123132016

11181811209

43

1.000

52

0.001

07

＜12个月≥16个月

1.00.8生存曲线

P=0.001

0.60.40.20.0

甲基化阴性组（n=29）

甲基化阳性组（n=7）

0.010.020.0时间（月）

30.040.0

性就越强，病人术后生存期就越长。此假设尚需进一步研究证实，可为原发性GBM治疗提供新思路。

【参考文献】

图4IL-11基因甲基化阳性与甲基化阴性病例生存曲线

3讨论

[1]AgrawalS,HofmannWK,TidowN,etal.TheC/EBPdelta

tumorsuppressorissilencedbyhypermethylationinacutemyeloidleukemia[J].Blood,2007,109(9):3895-3905.[2]StuppR,MasonWP,vandenBentMJ,etal.Radiotherapy

plusconcomitantandadjuvanttemozolomideforglio-blastoma[J].NEnglJMed,2005,352(10):987-996.[3]IacobG,DincaEB.Currentdataandstrategyinglio-blastomamultiforme[J].JMedLife,2009,2(4):386-393.[4]TabatabaiG,StuppR,vandenBentMJ,etal.Molecular

diagnosticsofgliomas:theclinicalperspective[J].Acta

GBM是成人中枢神经系统最常见及恶性程度

最高的脑肿瘤，尽管采用包括手术切除、术后放射治疗以及替莫唑胺化疗的标准治疗方案[2]，不同病人术后生存期明显不同，有些病人术后生存时间短于1年，而有些病人术后生存时间超过3年。研究

[3]

发现GBM病人对各种治疗的反应及预后受多种分子标记物影响。目前研究最显著的是GBM病人存

[4]

在MGMT启动子区甲基化能增强对烷化剂治疗的

中国微侵袭神经外科杂志2015年04月20日第20卷第4期ChinJMinimInvasiveNeurosurg,VOL.20,NO.4,April20,2015

·177·

Neuropathol,2010,120(5):585-592.

[5]HegiME,DiserensAC,GorliaT,etal.MGMTgene

silencingandbenefitfromtemozolomideinglioblastoma[J].NEnglJMed,2005,352(10):997-1003.

[6]黄磊,江涛,袁芳,等.MGMT基因甲基化在胶质瘤化疗

及预后中的意义[J].中国微侵袭神经外科杂志,2007,12

andp38MAPKpathwaysinbreasttumormodelswithvariedbonemetastasespotential[J].CancerBiolTher,2011,11(3):311-316.

[13]LayV,YapJ,SondereggerS,etal.Interleukin11regulates

endometrialcancercelladhesionandmigrationviaSTAT3[J].IntJOncol,2012,41(2):759-764.

[14]LiTM,WuCM,HuangHC,etal.Interleukin-11increases

cellmotilityandup-regulatesintercellularadhesionmolecule-1expressioninhumanchondrosarcomacells[J].JCellBiochem,2012,113(11):3353-3362.

[15]ZhangW,YanW,YouG,etal.Genome-wideDNA

methylationprofilingidentifiesALDH1A3promotermethylationasaprognosticpredictorinG-CIMP-primaryglioblastoma[J].CancerLett,2013,328(1):120-125.[16]HermanJG,BaylinSB.Genesilencingincancerinasso-ciationwithpromoterhypermethylation[J].NEnglJMed,2003,349(21):2042-2054.

[17]PuYS,HourTC,ChuangSE,etal.Interleukin-6isrespon-siblefordrugresistanceandanti-apoptoticeffectsinprostaticcancercells[J].Prostate,2004,60(2):120-129.[18]VegaMI,Huerta-YepazS,GarbanH,etal.Rituximab

inhibitsp38MAPKactivityin2F7BNHLanddecreasesIL-10transcription:pivotalroleofp38MAPKindrugresistance[J].Oncogene,2004,23(20):3530-3540.[19]PutoczkiT,ErnstM.Morethanasidekick:theIL-6family

cytokineIL-11linksinflammationtocancer[J].JLeukocBiol,2010,88(6):1109-1117.

（收稿日期：2014-12-08；修回日期：2015-01-14）

(10):474-477.

[7]McKinleyD,WuQ,Yang-FengT,etal.Genomicsequence

andchromosomallocationofhumaninterleukingene(IL11)[J].Genomics,1992,13(3):814-819.

[8]DuX,WilliamsDA.Interleukin-11:reviewofmolecular,

cellbiology,andclinicaluse[J].Blood,1997,89(11):3897-3908.

[9]NeculaLG,Chivu-EconomescuM,StanciulescuEL,etal.

IL-6andIL-11asmarkersfortumoraggressivenessandprognosisingastricadenocarcinomapatientswithoutmutationsinGp130subunits[J].JGastrointestinLiverDis,2012,21(1):23-29.

[10]HanavadiS,MartinTA,WatkinsG,etal.Expressionof

interleukin11anditsreceptorandtheirprognosticvalueinhumanbreastcancer[J].AnnSurgOncol,2006,13(6):802-808.

[11]XiangZL,ZengZC,FanJ,etal.Expressionofconnective

tissuegrowthfactorandinterleukin-11inintratumoraltissueisassociatedwithpoorsurvivalaftercurativeresec-tionofhepatocellularcarcinoma[J].MolBiolRep,2012,39(5):6001-6006.

[12]GuptaJ,RobbinsJ,JillingT,etal.TGFβ-dependentinduc-tionofinterleukin-11andinterleukin-8involvesSMAD

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

第一届中法立体定向功能神经外科国际讲习班

会议通知

由中国人民解放军总医院和法国巴黎第六大学联合举办的“第一届中法立体定向功能神经外科国际讲习班”将于2015年5月9日-15日在北京举办。本次国际讲习班将由DBS的发明人Benabid教授等12名法国、美国及以色列知名的神经内科、神经外科和神经心理及神经电生理等专家领衔授课，讲习班全英文授课（配有中文幻灯和同声翻译）。包括：①立体定向技术应用专题；②脑深部电刺激（DBS）专题；③癫疒间及神经心理专题；④手术演示（DBS手术和ROSA机器人手术，实时同步转播）；⑤讨论与互动等内容。内容经典且精彩，各层次学员将都会有很大收获，欢迎积极参与。

报名方式：可通过信件、电话、电子邮件等方式报名。

联系人：赵婷女士（13911305928），凌至培主任（13811895827）联系地址：北京市复兴路28号解放军总医院外科楼9层神经外科二病区

邮编：100853

Email：brain301lxx@http://wendang.chazidian.com