高速及高分辨率原子力显微镜用于研究Trichoderma+reesei纤维素酶在结晶纤维素上的行为

第34卷第3期2014年6月林 产 化 学 与 工 业ChemistryandIndustryofForestProductsVol.34No.3June2014doi:10.3969/j.issn.0253-2417.2014.03.022高速及高分辨率原子力显微镜用于研究Trichodermareesei纤维素酶

在结晶纤维素上的行为

王芳芳,黄峰*

(山东大学微生物技术国家重点实验室,山东济南250100)

摘 要: 介绍了原子力显微镜(AFM)和高速原子力显微镜(HP-AFM)在研究生物大分子动态过

程中的优势和Trichodermareesei纤维素降解酶系的情况。详细综述了高速原子力显微镜和高分

WANGFang-fang 辨率原子力显微镜(HR-AFM)应用于研究Trichodermareesei产生的3种主要纤维素酶Cel7A

(TrCel7A),Cel6A(TrCel6A)和Cel7B(TrCel7B)在结晶纤维素上行为所获得的结果。可知,结晶

纤维素载入催化结构域和糖苷键的水解是Cel7A运动所必须的;增加结晶纤维素的疏水面积、Cel6A和Cel7A的协同作用能提高结晶纤维素水解速率;Cel7B在起初引起结晶纤维素表面的水解之后引起润涨。可以预期HP-AFM将在阐明纤维素酶在结晶纤维素上的作用机制方面发挥巨大作用。

关键词: 高速原子力显微镜;纤维素酶;结晶纤维素

中图分类号:TQ35;Q939.97 文献标识码:A 文章编号:0253-2417(2014)03-0130-05

TheActionofTrichodermareeseiCellulasesonCrystallineCellulosewithHighSpeedandHighResolutionAtomicForceMicroscopy

(StateKeyLaboratoryofMicrobialTechnology,ShandongUniversity,Jinan250100,China)

Abstract:Theadvantagesoftheatomicforcemicroscopyandhighspeedatomicforcemicroscopyonstudyingthedynamicsofbio-microscopyandhighresolutionatomicforcemicroscopyininvestigatingtheactionsofCel7A(TrCel7A),Cel6A(TrCel6A)andmacromoleculeandthecellulyticenzymesystemofTrichodermareeseiwerepresented.TheresultsofhighspeedatomicforceWANGFang-fang,HUANGFengcrystallinecelluloseintocatalyticdomainandthehydrolysisoftheglucosidicbondareprerequisiteforthemovementofCel7A;crystallinecellulose;Cel7Bmakescrystallinecelluloseswelling.AnditisprospectivethatHP-AFMwillplayanimportantroleinincreasingthehydrophobicareaofcrystallinecelluloseandthecombinationofCel6AandCel7AenhancethehydrolyticrateofCel7B(TrCel7B)ofTrichodermareeseioncrystallinecellulosewerereviewedindetail.TheconclusionrevealsthattheloadingofKeywords:highspeedatomicforcemicroscopy;cellullase;crystallinecelluloseelucidatingtheactingmechanismofcellulaseoncrystallinecellulose.

在自然界中,内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶协同降解天然纤维素,但是该生物技术应用到工业规模生产乙醇却迟迟未能获得理想的结果。遇到的问题主要包括纤维素降解酶不易接近和结合到合适的作用位点上,其体外水解速率和效率随着时间而降低。这些问题是由纤维素底物和纤 收稿日期:2013-04-27 作者简介:王芳芳(1986—),女,山西长治人,博士,主要从事木质纤维素生物降解机制研究工作 *通讯作者:黄峰,教授,博士生导师,研究领域为生物质生物降解与转化,制浆造纸工业中生物技术应用等研究;E-mail:lignin302304@yahoo.

cn。

维素降解酶两者的性质所决定的。纤维素存在木质纤维素生物质中,与木质素、半纤维素相结合,而且它的结晶度、聚合度和可及的表面积变化都很大。对于纤维素酶而言,产物抑制,酶协同作用的需要,酶的不可逆吸附或者失活都导致了水解速率的下降。然而,在该研究领域,其中具体每一个因素的相对重要性仍旧存在很大分歧。这主要是受到不能直接观察纤维素降解酶破坏和水解结晶纤维素的限制。近(HR-AFM)为阐明这些原因提供了方法和技术支持[1]。年来,随着原子力显微镜技术的不断进步,高速原子力显微镜(HP-AFM)和高分辨率原子力显微镜1 蛋白质动态过程的研究技术蛋白质动态研究方法方面已经进行了大量的工作。近来,在研究蛋白质工作中的创新技术是20世纪90年代早期所创立的单分子荧光显微镜。具体来说,它是通过连接在选择性位点上的荧光团所释放的荧光点的动态变化来监测工作中的各个蛋白质分子的动态行为。然而在该项技术中,即使使用超高分辨率的荧光显微镜,蛋白质分子在荧光下本身也是不可见的。另外,已经使用X射线晶体学、核磁共振(NMR)、电子显微镜(EM)和原子力显微镜(AFM)来研究生物分子的结构,但获得的结构基本上为静2年里快速发展的高速原子力显微镜(HP-AFM)已经被应用于能同时直接地记录生物分子的结构和动态变化[2-5]。自1986年HP-AFM问世以来,在生命科学研究中它被作为一种新的工具进行了许多探索。AFM态的。因此,不能同时监测蛋白质的结构和动态变化。为了克服在蛋白质研究中存在的问题,在过去的的一个最大优势是它能在不染色,不进行物理和化学处理的情况下在纳米级对各个生物分子进行成像,也就是说能在包含生理浓度的离子缓冲溶液中进行成像。它的这种能力使得它能够被用于记录各个生物分子在生理条件下的动态行为[4,6-7]。AFM在样品的许多点上获得样品的高度信息。具体来说,行成像。在获得每个点信息的过程中,尖探针与样品发生接触,在接触中测定微悬臂的机械反应(如偏AFM是通过位于一个纤细的微悬臂自由末端的尖探针在样品表面扫描而对样品的形貌和材料性质进离,振幅,振动相位或共振频率的变化),接着通过反馈控制,通过样品台在z向上的移动把微悬臂再恢复到给定的状态。如果没有反馈控制,从微悬臂顶端施加到样品上的力就不能保持恒定,从而导致对样品的严重损毁。各种装置中所包含的封闭的反馈环所需要的恢复时间主要依赖于机械设备的反应(如微悬臂和z向扫描)。在样品台进行侧向扫描过程中,对于样品不同点的信息需要重复许多次这一系列的操作,这就意味着需要相对较长的时间来获得图像,至少需要30s。因此普通的AFM是无法记录发生在毫秒级的蛋白质分子的行为。在过去的15年里,已经进行了各种努力来增加AFM的成像速率,包括采用高振动频率和低弹性常数的微悬臂,快速的扫描器和反馈控制器,快速的电极和检测微悬臂偏离的光学光束偏离检测器。目前成功制成了高速原子力显微镜,这个系统以敲击模式进行工作,微悬臂在下,最快达到每秒5~20个图像的速率。这个高速和最小化破坏的性能使得蛋白质动态变化直接可见z向上以某个共振频率振动使得尖探针间歇性地接触样品,在不干扰易受到损伤的蛋白质功能的前提2 真菌Trichodermareesei的纤维素降解酶系成为可能[2]。

Trichodermareesei产生了几种纤维素降解酶协同降解纤维素。到目前为止,已经从T.reesei基因组中识别了8个主要的纤维素酶基因,包括2个纤维二糖水解酶(CBHⅠ和CBHⅡ,也就是Cel7A和所有已知的T.reesei纤维素酶除了Cel12A外,都具有两个结构域。它们由连接区域连接的催化结构域Cel6A)和6个内切葡聚糖酶(EGⅠ到EGⅥ,也就是Cel7B,Cel5A,Cel12A,Cel45A,Cel61A,Cel74A)。(CD)和碳水化合物结合结构域(CBD)组成。Cel7A(CBHⅠ)是T.reesei产生的主要的纤维素降解酶,它水解固态的纤维素,占所表达的纤维素降解酶的60%。它从纤维素链的还原性末端持续性地水解释放纤维二糖,特别对结晶纤维素具有高的降解活性。另一方面Cel6A(CBHⅡ)从非还原性末端水解纤维素链,释放纤维二糖,占总纤维素酶蛋白的10%~15%,它也降解结晶纤维素。Cel7B是T.reesei纤维

132林 产 化 学 与 工 业第34卷10%,少量的Cel12A,Cel61A,Cel45A对固态和溶解性底物具有不同的特异性活性。Cel74A是木糖葡聚

2.1 使用HP-AFM研究TrCel7A(Cel7A)在结晶纤维素上的行为糖酶,也具有内切葡聚糖酶活。此外,从T.reesei中还克隆了两个编码β-葡萄糖苷酶的基因[8-9]。

Igarashi等[10]使用HP-AFM对T.reesei的CBHⅠ(TrCel7A)在结晶纤维素上的行为进行了实时观素酶主要的内切葡聚糖酶,大约占其总纤维素酶的6%~10%。Cel5A占T.reesei总纤维素酶量的1%~测,制备了4种纤维素酶,包括从诺维信的商业纤维素酶纯化的TrCel7ACBHⅠ的全酶,用木瓜蛋白酶酶切纯化的TrCel7A获得的CBHⅠ的催化结构域CD,E212Q点突变的TrCel7A(212位Glu突变到Gln)和W40A(40位的Trp突变到Ala)点突变的TrCel7A的2个点突变的CBHⅠ。在TrCel7A的底物结合管道中从-7到-1容纳7个葡萄糖单元,在产物结合位点+1到+2位容纳另外2个葡萄糖。其中212位的Glu位于-1到+1之间作为催化的亲核试剂。212位Glu突变到Gln(E212Q)引起了CBHⅠ催化活性的重大损失。在活性位点管道入口处的保守的40位的Trp在-7位通过疏水作用固定底物。40位Trp突变到Ala(W212A)引起了CBHⅠ结合活性的重大损失。用这4种纤维素酶以相同浓度与从绿(3.5±1.1)nm的速度在结晶纤维素上单向滑行而不从底物上解离。当CD以与全酶相同的浓度加入藻Cladophora属纯化的纤维素,之后用HP-AFM对4种系统进行实时观察,发现TrCel7A全酶以大约时,在底物结晶纤维素上没有观察到蛋白质颗粒。然而,将CD的浓度提高到10倍时,出现了滑行的颗粒而且以与全酶相似的速率滑行。说明CBD并不是TrCel7A运动所必须的。E212Q点突变的CBHⅠ紧紧地结合在结晶纤维素上,在任何条件下也没有观察到分子的滑行,表明它长时间地停留在结晶纤维素表面而没有滑行运动。W40A点突变的CBHⅠ作为CD和E212Q的对照,它对无定形底物的活性类似于野生型酶,对高度结晶的纤维素的活性仅为野生型酶的20%。表明W40A点突变的CBHⅠ和CD具有相似的生物化学行为。然而,与CD相反,在HP-AFM中没有观察到W40A的滑行运动。而且与E212Q点突变的CBHⅠ相比,W40A点突变的CBHⅠ仅结合有限的时间。当以更快的速度扫描W40A点突变的CBHⅠ的行为时,显示许多W40A点突变的CBHⅠ分子不断地在结晶纤维素上进行着吸附和为它没有催化活性,而W40A点突变的CBHⅠ很少能拉起纤维素链,在结晶纤维素表面经历着重复性解吸。这些观察说明E212Q点突变的CBHⅠ能结合在结晶纤维素上但不能沿着纤维素链进行运动因的吸附和解吸过程。因此Igarashi提出CBHⅠ持续性运动的驱动力来自于糖苷键水解释放的能量。分子动力学的研究进一步表明酶和底物相互作用产生从表面拉起纤维链和沿着纤维素链移动酶所需的力,CBD能渗入纤维素链间将自由的链送入到CD的活性位点管道中。根据两个突变体和野生型酶的比较,Igarashi得出糖苷键的水解和底物的载入是酶滑行运动的关键。提高CD的浓度,而获得与野生型酶相似的滑行表明CBD的作用可能仅是增加酶在结晶纤维素表面的浓度。Liu等[11]利用AFM(每8分钟1帧)对TrCelCBHⅠ水解Ⅰα的Valonia纤维单个晶体所发生的形态学变化进行了实时成像。他们的研究发现相对于对照,CBHⅠ的样品在6~11h内,结晶纤维素的面积在降低,纤维素晶体的平均宽度降低,但其中平均高度保持相对恒定,推测CBHⅠ特异性的降解某个面。根据AFM所拍摄到的Valonia纤维单个晶体是具有两个窄边的六角形微纤丝。再根据具有3nm宽的两个疏水表面(110)的Ⅰα纤维素的结构,Liu提出,因为在AFM成像中使用亲水的云母作为基底,露给纤维素酶,易被其水解。因此他的研究直接可视化地支持了纤维素酶选择性地降解疏水表面。所以纤维素晶体的亲水表面结合在云母上,根据晶体在云母表面的取向,疏水性的(110)和(110)面暴Igarashi等[12]用HP-AFM研究了CBHⅠ在Ⅰα和ⅢⅠ型两种不同晶型的纤维素表面上的行为。研--究发现CBHⅠ在Ⅰα型纤维素上沿着单个轨道运动,而在ⅢⅠ型结晶纤维素表面都有CBHⅠ移动的轨道,但CBHⅠ在这两种不同晶型的结晶纤维素上的移动速率是相同的。通过之前研究得出的纤维素Ⅰ

-α和ⅢⅠ特征的不同,即Ⅰα在100和0102个亲水表面间具有疏水的110面,而ⅢⅠ具有相似的疏水表面110和亲水的010面,但是还有中等疏水且面积更大的100面。因为实验中使用高度疏水的热解石墨作为基底,预期晶体以疏水面取向于石墨接触相对称,相反的面也是疏水面朝上。因此,在ⅢⅠ型结晶纤维素上,TrCel7A不仅在疏水面110而且也在有些弱疏水的100面移动。而在Ⅰα型结晶纤维素-

上,对于酶来说,110面是唯一足够疏水结合的面。所以增加适合纤维素酶运动的轨道的数量将是提高结晶纤维素水解的有效方式。另外Igarashi发现在ⅢⅠ纤维素表面当一个TrCel7A分子运动停止时,许多后面的分子堆积在停止的分子后面,引起堵塞。然而,当其它几个分子也受到堵塞时,酶分子在表面不能爬过,因此停了下来,但是在停止的分子后面随后分子的积累引起了障碍的消除,因此受阻的分子从第一个分子停止的位点重新开始线性的移动。

2.2 使用HP-AFM研究TrCel6A(Cel6A)和TrCel7A在结晶纤维素上的协同降解Igarashi等[12]同时利用HP-AFM研究了T.reesei的2种主要的纤维二糖水解酶TrCel6A和TrCel7A重新开始运动,纤维束从晶体表面剥离。这个行为显示在结晶纤维素表面存在障碍,一个TrCel7A分子晶纤维素的水解过程进行了成像。首先在无纤维素酶时,结晶纤维素没有变化,加入TrCel6A温育495s后,可以看到TrCel6A在晶体表面,但是没有定向的运动。加入TrCel7A后,可以看到酶分子从底物表面的许多点开始移动,酶分子经过的地方结晶纤维素变薄直至被降解消失。TrCel6A和TrCel7A两者同时存在时对结晶纤维素的降解速率明显比TrCel7A单独存在时快,而且从释放的纤维二糖的量也得到了佐证。即TrCel6A和TrCel7A两者同时作用于结晶纤维素所释放的纤维二糖的量高于TrCel6A,

2.3 使用HR-AFM研究TrCel7B(Cel7B)在结晶纤维素上的行为TrCel7A单独作用释放的纤维二糖的量,也高于二者的释放的纤维二糖的简单加和。

Wang等[1]利用对T.reesei的Cel7B(T.reesei分泌的主要的内切葡聚糖酶)在细菌纤维素的单个结协同对结晶纤维素的水解。在无纤维素酶时,先加入TrCel6A温育和然后再加入TrCel7A时,对ⅢⅠ结晶纤维素上的行为进行了实时的观察。AFM图像显示Cel7B和一个较大的纤维在长达185min的温育过程中,由于各个微纤丝的侵蚀或润涨,纤维逐渐起皱。图像显示微纤丝的亮条纹随时间出现和消失,说明在温育过程中纤维表面有峰出现和消失。对横截面形貌变化进行定量分析发现,在起初与酶温育的50~60min内纤维的平均高度逐渐降低,而在剩余的时间内纤维的平均高度增加。粗糙度的数据显示在整个温育时间内纤维的粗糙度随着时间的延长而显著地增加。另外体积变化的数据也显示在开始的50~60min内体积稳步地下降,降低到几乎原始体积的60%,接着开始增加,在185min时,达到初始体积的93%。体积变化明显大于体积的随机波动,因此,所观察到的变化是Cel7B在结晶纤维表面的行为。这与Peter等[13]用TrCel7B处理纤维素膜所得到的引起纤维素膜变松散相同。说明在TrCel7B细菌结晶纤维素相互作用的最初50~60min内水解起主要作用,引起了结晶纤维素体积和高度的降低,之后润涨起主要作用,这也说明具有催化活性是这两个效应所必须的。为了证实这一点,Wang等用分离的Cel7B的CBD重复Cel7B的实验,当以与Cel7B相当浓度的CBD处理纤维时,在纤维形态上没有引起任何可识别的变化。然而,在增加CBD的浓度后,观察到纤维的一些润涨,说明CBD在破坏纤维素微纤丝的氢键系统中起作用。因此Wang等提出Cel7B降解纤维素链的表面保护层后,Cel7B向内部的类晶纤维素所暴露的亲水结构中引入水分子,引起微纤丝的润涨,随着水分子渗入到相邻的纤维素链间的空间,引起分子内氢键网络的不平衡,从而导致微纤丝的物理性体积的膨胀,这是一个相对缓慢的过程。

3 结论和展望通过上面的综述可知:结晶纤维素载入催化结构域和糖苷键的水解是TrCel7A运动所需要的;提高结晶纤维素的疏水面积可以提高TrCel7A对其的水解速率;TrCel7A和TrCel6A的协作提高对结晶纤维素的水解速率。TrCel7B在起初引起结晶纤维素表面的水解之后引起润涨。HP-AFM用于研究纤维素酶在常用的生产生物乙醇的木质纤维素原料结晶纤维素上的行为还未见报道。如果使用生产生物乙醇的木质纤维素原料的纤维素作为底物的话,对于阐明在工业上纤维素酶生产生物乙醇中所遇到的瓶颈问题的帮助可能会更大。

140nm/s,但是现在的高速原子力显微镜还达不到这个速度,因此对纤维素酶降解纤维素机制的研究仍另外,按照CBHⅠ水解释放2个纤维二糖的距离计算的话,CBHⅠ完成一次水解的运动速率为

134林 产 化 学 与 工 业第34卷旧存在限制。随着高速原子力显微镜技术的不断发展,它应该会在纤维素酶降解纤维机制上的研究提供更强大的技术支持,从而帮助工业上实现利用大量可再生的木质纤维素原料中的纤维素生产生物乙醇及其它化学品。

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