甘露糖筛选体系及在转基因玉米商业化中的应用_刘戬丰

综述与专论

BIOTECHNOLOGY BULLETIN

生物技术通报

2014年第9期

甘露糖筛选体系及在转基因玉米商业化中的应用

刘戬丰 王艳丽 李相敢

（先正达生物科技（中国）有限公司 北京 102206）

摘 要： 甘露糖在己糖激酶的作用下形成6-磷酸甘露糖，进一步在磷酸甘露糖异构酶（Phosphomannose isomerase，PMI）的催化下转化成植物可利用的6-磷酸果糖，从而使转化细胞在甘露糖作为主要碳源的培养基上正常生长，而非转化细胞生长受到抑制。这一筛选体系被认为是一种正向筛选（Positive selection），已被成功地应用于重要的粮食作物和经济作物中。甘露糖筛选的植株可以通过多种方法检测，其中氯酚红检测法和试纸条检测法简单方便，适用于初步筛选。甘露糖筛选体系安全高效，已被应用于玉米商业化产品中。综述了甘露糖（mannose）筛选体系的原理、筛选特点、植株的鉴定、筛选方法的优缺点以及在商业化中的应用，列举了利用甘露糖筛选的玉米单性状转化系用于抗鳞翅目和抗鞘翅目昆虫及抗高温淀粉酶的范例及其在育种叠加中的应用。这种育种叠加使得甘露糖筛选的性状与其他性状重叠而得到更广谱的具有抗除草剂抗虫性状的商业化产品。

关键词： 磷酸甘露糖异构酶 筛选标记 安全性分析 转基因植物检测 甘露糖

Mannose Selection System and Its Commercial Application in

Transgenic Corn

（Syngenta Biotechnology China Co.，Ltd，Beijing 102206）

Abstract: Mannose can be converted into mannose 6-phosphate in cells and further converted into fructose 6-phosphate in transgenic cells if phosphomannose isomerase（PMI）gene（manA）is introduced as a selection marker. The transformed cells can grow normally on the media with mannose as main carbon source while the non-transformed cells are inhibited to grow. As a positive selection, Mannose / PMI system has been applied to important food crops and important economic crops. The plants selected by mannose can be analyzed through a variety of methods, including simple CPR test and convenient strip test. Mannose selection system is a safe and efficient platform suitable for commercial applications. In this review, advances in mannose selection system with its mode of action, selection characteristics, methods of transgenic plants analysis, advantages and disadvantages in transformation, as well as its applications in transgenic corn production and breeding stacks were summarized. Successful examples to use Mannose / PMI selection system in corn to generate multiple single trait events for insect resistances and high temperature resistant amylase, which have been breeding-stacked with other corn traits selected by different selection systems to provide broad spectrum of herbicide resistance and insect resistance for higher commercial value were presented.

Key words: Phosphomannose isomerase Selection marker Safety analysis Transgenic plant assay Pmi（manA）

Liu Jianfeng Wang Yanli Li Xianggan

筛选标记基因对于转基因作物的研究和生产至关重要。自20世纪80年代第一株转基因植物产生至今，筛选标记基因（如抗生素抗性和除草剂抗性标记基因）所起到的作用有目共睹。如果没有这些抗性标记基因，产生转基因作物基本是不可能的［1］。随着植物转基因技术的迅速发展，大约50个标记基

因被作为筛选标记引入到植物中［2］。

近年来，人们对转基因安全的疑虑更进一步加深了对除草剂抗性和抗生素抗性基因作为标记基因的争论。其中包括怀疑是否抗生素基因被其他物种摄取而产生抗生素抗性，这种抗生素抗性可能会使抗生素失效；其次怀 疑抗除草剂基因可能会扩散到

收稿日期：2014-03-03作者简介：刘戬丰，女，硕士，研究方向：作物遗传转化；E-mail: jianfeng.liu@http://wendang.chazidian.com通讯作者：李相敢，男，博士，研究方向：作物遗传转化与分子生物学；E-mail：xianggan.li@http://wendang.chazidian.com

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1.2 甘露糖筛选体系的特点

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杂草中去，会使该类除草剂失效。为减少对转基因的争议和提高人们对转基因安全性的信心， 甘露糖筛选标记和筛选体系则成了很好的范例。这个筛选体系已被广泛应用于植物转化中，是一种高效、安全、环境友好型的筛选体系。

在甘露糖筛选体系中，除了需要加入筛选剂甘露糖外，还需要补充一定比例的可直接利用的碳源以提高筛选效果。Wright等［8］在2001年玉米转化试验过程中发现，在筛选和再生阶段，当培养基中仅仅含有甘露糖一种碳源时，转化的细胞或植株难以生长和分化成苗，需要配以一定含量的蔗糖。但是，也有少数研究发现无需加入可直接利用的碳源，如Bahariah等［9］在烟草和油棕［10］转化中，并未加入其他碳源。他们在油棕的研究中发现，筛选培养基甘露糖浓度为30 g/L且不加蔗糖时，得到的转化效率最高。根据物种和品种等条件的不同，筛选培养基中甘露糖浓度及其与补充碳源的配比有所不同。对于拟南芥，甘露糖的工作浓度仅为0.4 g/L［11］，而水稻甚至高达30 g/L［12］。甘露糖和补充碳源的比例范围也很大，Todd等［11］在拟南芥的转化中使用的比例为0.4∶10（g/L），而在Bahariah等转化烟草和油棕时，完全没有加入其他可直接利用的碳源。甘露糖和外加碳源的比例会直接影响到筛选效率和阳性率，如Wright等在小麦转化试验中，添加蔗糖可以大大提高筛选效率。甘露糖与蔗糖的比例取决于不同的基因型，浓度范围在5-20 g/L［8］。Feeney等［13］在大麻转化试验中也发现，试验所用的两个品种的最适筛选压明显不同。

根据物种和基因型的不同，补充碳源的种类也有差异。Joersbo等［14］在甜菜转化试验中比较了添加不同种类的补充碳源对于降低甘露糖抑制作用的效果明显不同，其中葡萄糖的效果最好，优于麦芽糖和果糖，蔗糖的效果居中。

甘露糖筛选体系可以利用多种类型外植体和多种转化方法。例如，玉米甘露糖筛选体系通常采用玉米幼胚、愈伤组织或原生质体作为外植体。转化方法包括农杆菌法［15］、基因枪法［8］和原生质体法［16］。图2简单描述了农杆菌介导的甘露糖筛选体系转化玉米幼胚的流程。

1 甘露糖筛选体系介绍

1.1 甘露糖筛选体系的原理

在甘露糖筛选体系中，植物转化细胞和非转化细胞均可吸收培养基中的甘露糖，并在植物内源［3］己糖激酶作用下自发［4］生成6-磷酸甘露糖。唯有转化细胞进一步在6-磷酸甘露糖异构酶（Phosphomannose isomerase，PMI）的作用下转化成6-磷酸果糖。如图1所示，甘露糖代谢成6-磷酸果糖，6-磷酸果糖进入糖酵解途径。编码6-磷酸甘露糖异构酶的基因是manA，该基因首次从大肠杆菌中克。进一步研究发现，磷酸甘露糖异构酶也存在隆［5］

于酵母、猪和人体中

［3］

。虽然人们推测在植物界可

能存在PMI的活性，如一些豆科植物能够在以甘露糖作为唯一碳源的培养基上生存，但是到目前为止，还没有直接从植物中克隆到类似于manA的基因。

转化细胞含有外源基因manA编码的磷酸甘露糖异构酶，可以把6-磷酸甘露糖转化为6-磷酸果糖，从而能够正常生长；未转化细胞不含有磷酸甘露糖异构酶，不能把6-磷酸甘露糖转化为6-磷酸果糖，导致6-磷酸甘露糖大量积累并且消耗大量ATP和磷酸根离子，抑制了糖酵解途径，从而生长受到抑制［6］。在该筛选体系中转化细胞可以利用筛选剂甘露糖作为碳源而非转化细胞不能利用甘露糖作为碳源，这种利用碳源缺乏来抑制非转化细胞生长的筛选方法

［7］为“正向筛选”。在一些极端情况下，甘露糖的

存在可以导致愈伤组织的死亡。例如，在玉米转化中，由幼胚诱导的愈伤组织在第1轮大约2周的甘露糖筛选中，偶尔会见到变白、质地软化、已经死亡的愈伤组织。

图1

甘露糖代谢原理

刘戬丰等：甘露糖筛选体系及在转基因玉米商业化中的应用

A1样品为非转基因的阴性对照，其余为筛选后的植株；其中A3、C4、D6与阴性对照相同为深红色，且ELISA检测呈阴性，故为假阳性植株；B3和C6呈桔黄色，且ELISA检测呈阳性，故为阳性植株；其余均为阳性植株（颜色标识见电子版）

1：农杆菌侵染；2：幼胚和农杆菌共培养；3：愈伤诱导；4：甘露糖筛选； 5：愈伤组织在含有甘露糖的培养基上再生；6：转化苗在不含有甘露糖的培养基中生根

图3 CPR

检测转基因玉米叶片结果

图2

农杆菌介导甘露糖筛选的玉米转化流程

、硬粒小麦［21，22］、甘蔗［4］、夏堇［23］等。高粱［20］

必须指出，该种方法也可用于其他筛选体系，如草。只要植物材料在有筛选剂的培养基中铵膦筛选［17］

能代谢糖分，使培养基酸化，就可以使用该种方法。同时应该注意到，植物材料应该是无菌的，从温室中所取的材料可能被微生物污染而产生假阳性。1.3.2 试纸条检测法 该试剂盒采用双抗体夹心模式。结合显色剂的PMI蛋白特异性抗体被耦合到侧向流试纸条上。当试纸条被放置在含有PMI蛋白质的少量植物组织提取液时，耦合的抗体会和蛋白质结合。不是所有结合显色剂的抗体会和蛋白形成双抗体夹心。试纸条薄膜上包含两个结合区，其中一个结合PMI蛋白；另一个结合显色剂。当三明治和/或未反应的显色剂在特定区域中被捕获时，这些结合区显示微红色。试纸条只显示一条线（对照线），表示是假阳性样品，显示两条线则表示为阳性样品。如图4所示为供应商提供的商品说明（图4-A）以及本实验室试纸条检测分析结果实例（图4-B）。供试商品来自美国公司Strategic Diagnostics Inc.，产品

1.3 转化植株的检测方法

由于manA基因在大多数植物中都不存在，所以该基因可以通过常规方法，如PCR、RT-PCR、Southern 杂交、ELISA、氯酚红检测法（CPR）等方法进行检测。此外，可以利用PMI在筛选体系中的特点进行检测，如分光光度检测法和试纸条检测法。本研究概括介绍如下两种简捷的非分子生物学方法。1.3.1 氯酚红（chlorophenol red，CPR）检测法 当pH6.0向pH5.0变化时，pH指示剂氯酚红从红色经。甘露糖代谢过程中可以使培养基橙色变成黄色［17］

酸化，从而可以使用氯酚红筛选转基因植株。图3为利用氯酚红检测法对甘露糖筛选的玉米植株叶片

［8］

进行检测（未发表的数据），试验方法参照Wright等

2001年检测转基因玉米使用的方法。试剂酚氯红来自美国Sigma公司，产品号为199524-10G。该方法已经被广泛地应用于不同转基因植物PMI的检测，、玉米［8］、水稻［18］、甜橙［19］、大麻［13］、如小麦［8］

A：未发生反应；B：PMI阴性；C：PMI阳性；由左至右C2和D2为阴性对照；E2-B12为转基因植株，其中 A12和B12均只有对照条带显色且ELISA检测呈阴性，故为假阳性；E3条带虽略浅，但ELISA检测呈阳性，故为阳性植株；其余均为阳性植株

图4

试纸条检测分析的范例和结果

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名称为Seed PMI Test Strips，产品号为7000052。

氯酚红检测法和试纸条检测法操作简单，结果直观，可以用于转基因植株初步筛选。此外使用多种检测方法不仅可以相互验证阳性植株，同时也可分析由不同方法所产生数据的相关性。例如，对81个T0玉米植株采用了Taqman、qRT-PCR、ELISA、氯酚红和试纸条法检测，其中73株在所有5种检测方法中表现为一致，吻合率接近90%（数据未发表）。

甘蔗和甜菜）和模式植物（拟南芥、蓝猪耳和常绿、长寿草）。本研究在此补充如下植物，烟草［9］、文心兰［28］、油棕［10］和豇豆［29］。花［31］

2.2 甘露糖筛选体系的安全性评价

前人做过很多研究，对甘露糖筛选体系进行了安全性评价。从筛选剂本身来讲，甘露糖可以作为食品添加剂，对人体无害；并且对植物生长也没有直接的副作用，只是大部分植物不能直接利用甘露糖作为碳源从而导致饥饿，进而抑制生长，这种对

［15］

。同时，生长的抑制作用可以通过添加蔗糖来减轻

2 甘露糖筛选体系的评价

2.1 甘露糖筛选体系技术上的优势

2.1.1 转化效率高 自甘露糖筛选体系成功应用于植物转化以来，诸多研究者利用该体系在不同作物中获得较高转化效率（表1）。Joersbo等［24］报道了在甜菜转化中，用甘露糖筛选的转化效率是用卡那霉素筛选的10倍。Wright等［8］报道了在玉米转化试验中，甘露糖筛选体系得到的转化效率是除草剂Basta（活性成分是草丁膦）筛选的4倍。Gao等［20］在农杆菌介导高粱转化的试验中，得到比其他几个作者利用不同筛选标记和转化方法都高的转化效率。

表1 近年来利用甘露糖筛选的报道

作物甜菜玉米小麦甜橙高粱洋葱杏树马铃薯生菜兰花豇豆水稻

转化方法农杆菌介导法基因枪法基因枪法农杆菌介导法农杆菌介导法

农杆菌介导法/基因枪法农杆菌介导法农杆菌介导法农杆菌介导法农杆菌介导法农杆菌介导法农杆菌介导法

转化效率0.94%45%≥20%3%-23.8%2.88%-3.30%27% / 23%6.8%53.3%25%21%3.6%54.8%

参考文献［24］［8］［8］［19］［20］［25］［7］［26］［27］［28］［29］［30］

Wang等［16］通过对果糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和蔗糖对玉米愈伤诱导和生长的研究表明：玉米愈伤组织不能利用甘露糖作为碳源。其进一步的研究结果显示，在添加的总糖量为20 g/L时，3种处理方法（20 g/L 蔗糖、15 g/L蔗糖+5 g/L甘露糖和10 g/L蔗糖+10 g/L甘露糖）对玉米愈伤生长没有显著影响，说明甘露糖对玉米愈伤组织没有直接毒性，而是由于。近年来，随着除草剂和抗引起饥饿而抑制生长［16］

生素抗性基因作为筛选标记应用于植物转化，引起了人们对环境和自身安全的疑虑，而甘露糖筛选体系则成为了很好的选择。Reed等［6］对玉米转化植株T0代进行一系列研究，对纯化的PMI蛋白进行了过敏性评价和毒性分析，及其农艺性状及谷物成分分析，结果表明，PMI蛋白对于哺乳动物毒理和过敏反应方面都没有副作用，这种蛋白很容易在模拟的胃液和肠液中被消化，并且与已知的过敏基因没有同源性，也没有其他过敏基因所共有的N-糖基化序列，对植物的农艺性状及营养成分也没有负面影响。

现以先正达公司商业化转化系5307为例重点。该转化系已通过描述甘露糖筛选的安全性评估［32］

美国政府部门的审批和商业化之前的安全性评估。5307玉米转化系是将抗虫基因eCry3.1Ab经甘露糖筛选体系引入玉米得到的商业化产品。eCry3.1Ab蛋白可以抗玉米根萤叶甲（Diabrotica vergifera virgifera Leconte）、长角叶甲（D. longicornis barberi Smith and Lawrence）和墨西哥玉米根虫（D. virgifera zeae Krysan and Smith）。5307是利用农杆菌介导法转化自交系NP222幼胚产生的。转化载体为pSYN12274，其T-DNA区域包含目的基因ecry3.1Ab 和筛选基因

2.1.2 应用广泛 目前，很多研究者将甘露糖筛选体系应用于多种植物转化中。Stoykova等［3］在2011年总结了比较详尽的列表，这些植物包括谷物（水稻、玉米、高粱、小麦、珍珠稷和硬粒小麦）、蔬菜（番茄、黄瓜、辣椒、马铃薯、生菜、洋葱和大白菜）、水果（杏树、番木瓜、甜橙、柑橘和苹果树）以及其他一些经济作物（亚麻、大麻、鹰嘴豆、油菜籽、

刘戬丰等：甘露糖筛选体系及在转基因玉米商业化中的应用

pmi两个部分。转基因在玉米中插入部位的核苷酸序列分析表明：5307含有完整的单拷贝T-DNA，靠近pmi基因的左边界（Left border）有8个碱基的缺失，这种断裂在农杆菌介导的转化中很常见，并且这个缺失对插入片段的功能没有影响［32］。另外，还检测到插入片段整合在基因组过程中引起了玉米基因组33个碱基的缺失，生物信息学分析表明，这段缺失并未影响已知的玉米内源基因［32］。

在研发过程中，除对目的基因表达进行大量研究外，就PMI蛋白特性尤其安全性进行了测试［32］。将大肠杆菌K-12中分离的pmi基因克隆到可诱导的过表达载体pET-24a上，并将此载体转化到大肠杆菌菌株BL21（DE3）RP中过表达产生PMI蛋白。过表达产生的PMI蛋白与玉米5307中产生的PMI蛋白的氨基酸序列相同。分析两种PMI蛋白分子量、免疫活性和酶活性，证实两种蛋白产物在生物化学和功能上没有区别。所以，重组大肠杆菌产生的PMI蛋白可以替代5307中的PMI蛋白进行安全性研究。

对该产品PMI的安全性评估的结论总结如下

［32］

良好的作用机制、物理化学特性和安全性分析结果表明5307中表达的eCry3.1Ab和PMI蛋白对哺乳类动物无害［32］。对实验室、温室、生长箱和大田中的5307玉米调查证实，种子、花粉、植物表型或成分都没有变化，这些结果显示5307的植物有害指数没有改变。美国多个大田粮食和饲料成分评估结果表明5307玉米在成分上相当于与其对应的传统玉米，并与其对应的传统玉米一样有营养价值。在美国玉米不具有杂草特性或与野生近缘亲属杂交的特性，这些特性在5307玉米中并没有发生改变。

2.3 甘露糖筛选体系的缺点

甘露糖筛选体系的特点决定了其筛选的特殊性。在筛选过程中，不仅要加入合适浓度的甘露糖，还需补充一定量的可直接利用碳源。并且根据物种、基因型等的不同，不仅需要不同的筛选压，还需配以不同种类以及不同浓度的补充碳源以提高筛选效率。所以，在对某一特定基因型植物进行遗传转化研究或生产中，优化筛选培养基配方是一项比较费时的工作。

过去的研究表明甘露糖筛选不能用于可能具有内源磷酸甘露糖异构酶活性的植物，如大豆及一些其他豆科植物。当未转化的材料放置于仅含有甘露糖作为唯一碳源的培养基上，这些植物材料的生长不会受到抑制，因为这些植物可以代谢甘露糖，从而使这一筛选体系几乎无效。人们试图寻找对甘露糖敏感的大豆品种，或者利用突变的方法产生甘露糖敏感的突变体，从而使得甘露糖筛选体系可以在豆科作物中得以推广。然而，最近的一些研究表明豆类植物利用甘露糖筛选体系不是没有可能的。如目前已有报道，利用甘露糖筛选体系转化大豆［33］、鹰嘴豆［34］和豇豆［29］，但在其他豆科植物中尚未见报道。图5是转化鹰嘴豆的检测结果，显色比较明显［34］

。未来的研究将更进一步证明这种筛选技术在

：（1）manA基因来源于大肠杆菌K-12，这种

细菌无处不在而且无致病性，由该基因编码的蛋白质PMI无毒性。（2）生物信息学分析表明，PMI 391个氨基酸序列没有与任何已知毒素明显相似的序列。（3）小鼠急性口服毒性研究中没有发现PMI的负面效应。（4）PMI在模拟哺乳动物胃和肠中容易被消化，表明具有低致敏性。（5）进一步的生物信息学分析表明，PMI氨基酸序列没有和已知的或者推测的过敏原相似。（6）PMI可在65℃及以上的温度下通过加热灭活。（7）PMI蛋白在5307玉米中不被糖基化，相同的PMI蛋白在其他转基因玉米品种中也不会被糖基化。（8）对潜在致命性过敏原的分析，结果表明PMI不太可能是过敏原而且也不太可能与其他过敏原发生交叉反应。

1-5：转基因植株；C：阴性对照

图5 氯酚红法检测鹰嘴豆分析结果