高活性纤维素酶菌株的筛选鉴定和秸秆降解特性的研究

华中农业大学

硕士学位论文

高活性纤维素酶菌株的筛选鉴定和秸秆降解特性的研究

姓名：曾青兰

申请学位级别：硕士

专业：生物化学与分子生物学

指导教师：刘子铎;赵斌

20080601

华中农业大学２００８届硕士毕业论文

摘要

农作物秸秆是世界上最丰富的纤维素类物质之一。由于纤维素分子结构的特殊性及纤维素物质在自然界的存在状态（以木质纤维素的形式存在）的特殊性，目前这一巨大资源不仅没有得到充分利用，反而因大部分被焚烧或弃置在自然环境而成了一大污染源。如何利用纤维素酶将这些秸秆纤维素废弃物大规模地转化为简单糖类或蛋白质等产品，进一步转化酒精、饲料等已成为全世界研究的热点，也是缓解当今世界所面临的粮食短缺、饲料资源紧张、能源危机和环境污染等问题的有效途经之一。

纤维素酶是一类能够水解纤维素的Ｂ．Ｄ．糖苷键生成葡萄糖的多组分酶的总称。自然界中能分解纤维素的生物主要为真菌类及部分细菌，以木霉、曲霉、青霉的能力最突出，但目前研究得最多的是一些真菌对经物理、化学处理（辐射、蒸汽爆破、膨化、碾磨、酸化、碱化等）的不溶性纤维素的作用，生产成本高，对环境的污染严重，限制了农作物秸秆的高效利用。而筛选性能稳定的高产纤维素酶菌株，研究其对未处理的天然纤维素的降解作用对解决上述这些问题至关重要。我们通过大规模的菌株筛选和测试，取得了以下主要结果：

１．采用ＣＭＣ－Ｎａ平板进行菌种分离，筛选出具有较高降解纤维素酶能力的细菌３５株，真菌ｌｌ株。

２．以天然水稻秸秆为碳源，进行液体摇瓶培养复筛得到一株能高效降解秸秆纤维素的丝状真菌，经１８ＳｒＤＮＡ基因序列分析和菌株形态特性分析，初步确定该菌株为藤仓赤霉（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）。

３．以未处理的水稻秸秆为唯一碳源，研究了氮源、接种量、发酵时间、初始发酵温度、培养基初始ｐＨ等对藤仓赤霉产酶的影响．结果表明该菌株产纤维素酶的最适宜的氮源为ＣＯ（ＮＨ２）２，接种量为５％，培养时间为１２０ｈ，培养温度为２８～３７℃，培养基初始ｐＨ为５＂－－＇６。

４．ＳＥＭ分析表明，藤仓赤霉作用水稻秸秆是从内表面向外表面进行的；作用前后的稻草成分测定结果显示，纤维素降解率、半纤维素降解率和木质素降解率分别达３８．９％，５７．９％和２６．５％；该菌对未处理秸秆作用８ｄ，秸秆失重率可达５３％；对该菌的酶成分进行分析，结果表明该菌可产生多种降解酶，其ＣＭＣａｓｅ、ＦＰａｓｅ、ｘｙｌａｎａｓｅ酶活分别可达１．７２３ｎ７／ｍＩ．０．３４４ＩＵ／ｍＬ、０．５３２ＩＵ／ｍＬ。且该菌产生的ＣＭＣ酶的反Ⅱ

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应温度以５０℃左右为宜，ｐＨ值以６左右为适，Ｍ９２＋－与Ｃａ２＋对酶反应有促进作用，Ｐｂ２＋和Ｃｕ２＋对酶反应有抑制作用。

本实验所获得的藤仓赤霉对水稻秸秆的这些作用特性未见其他作者报道，因此，为进一步利用该菌进行改良、提高酶活以应用于生产奠定了基础。

关键词：纤维素酶；筛选；藤仓赤霉；酶活力；秸秆；产酶条件；酶学性质ＩＩＩ

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Ａｂｓｔｒａｃｔ

Ｃｒｏｐｓｔｒａｗｉｓｔｈｅｍｏｓｔａｂｕｎｄａｎｔｃｏｌｌｕｌｏｓｅｉｎｔｈｅｗｏｒｌｄ．Ｔｈｅｓｐｅｃｉａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅｃｏｌｌｕｌｏｓｅ

ｃｏｌｌｕｌｏｓｅｍｏｌｅｃｕｌｅ，ａｌｏｎｇ谢ｔ１１ｍａｔｅｒｉａｌｓ（ｅｘｉｓｔｉｎｔｈｅｔｈｅｐａｒｔｉｃｕｌａｒｉｔｙｏｆｔｈｅｅｘｉｓｔｅｎｃｅｆｏｒｍｏｆｓｔａｔｅｏｆａｍａｊｏｒｉｔｙｏｆｗｏｏｄ）ｉｎｎａｔｕｒｅ，ＳＯ，ｔｈｅｒａｔｉｏｏｆｕｓｉｎｇｔｈｅｒｅｓｏｕｒｓｅ

ｏｆｐｏｌｌｕｔｉｏｎｆｏｒｂｅｉｎｇｉｓｌｏｗｎｏｗ，ｗｈａｔｉｓｍｏｒｅ，ｍｏｓｔｏｆｉｔｈａｖｅｂｅｃｏｍｅｔｈｅ

ｄｉｓｃａｒｄｅｄｉｎｎａｔｕｒａｌｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ

ｆｉｂｒｅｉｎｔｏｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ

ｆｏｏｄｕｌｔｅｒｉｏｒｌｙｈａｓｂｅｃｏｍｅｏｒａｏｒｓｏｕｒｃｅｂｅｉｎｇｂｕｒｎｔ．Ｈｏｗｏｎａｔｏｔｒａｎｓｆｏｒｍｔｈｅｄｉｓｃａｒｄｅｄｓｔｒａｗａｌｃｏｈｏｌ，ｆｅｅｄｅｖｅｎｐｒｏｔｅｉｎｓｌａｒｇｅｓｃａｌｅａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｈｏｔｓｐｏｔｉｎｗｏｒｌｄｗｉｄｅｓｔｕｄｙ，ａｌｓｏ

ｒｅｓｏｕｒｃｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｗａｙｏｆｒｅｓｏｌｖｉｎｇｔｈｅｓｈｏｒｔ－ｃｏｍｍｏｎｓ，ｔｈｅｌａｃｋｏｆｆｅｅｄａｎｄｔｈｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｐｏｌｌｕｔｉｏｎ．

ｃａｌｌＣｅｌｌｕｌａｓｅｉｓｔｈｅｋｉｎｄｏｆｅｎｚｙｍｅｉｎｃｌｕｄｉｎｇｍｕｌｔｉ—ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｗｈｉｃｈｈｙｄｒｏｌｙｚｅｔｈｅ

ｐ—Ｄ—ｉｎｄｉｃａｎｂｏｎｄｏｆｃｅｌｌｕｌｏｓｅｔｏｇｌｕｃｏｓｅ．Ｔｈｅｍａｊｏｒｏｒｇａｎｉｓｍｔｈａｔｃａｎｄｅｃｏｍｐｏｓｅｃｅｌｌｕｌｏｓｅａｒｅｆｕｎｇｉ：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ

Ｂｕｔａｔｐｒｅｓｅｎｔｍｏｓｔ

Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｏｎａｎｄｓｏｍｅｂａｃｔｅｒｉａｉｎｎａｔｕｒｅ．ｓｔｕｄｉｅｓａｒｅｆｏｃｕｓｅｄｏｎｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，ｉｎｓｏｌｕｂｌｅｃｅｌｌｕｌｏｓｅｔｒｅａｔｅｄｂｙｐｈｙｓｉｃｓａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅｒａｄｉａｔｉｏｎ，ｓｔｅａｍｄｅｍｏｌｉｔｉｏｎ，ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，ｍｉｌｌｉｎｇ，ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｌｋａｌｉｚｅａｎｄＳＯｏｎ．Ｂｅｃａｕｓｅｏｆｌｌｉ曲ｃｏｓｔｏｆｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｓｅｒｉｏｕｓｐｏｌｌｕｔｉｏｎｔｏｔｈｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，ｔｈｅｓｅｍｅｔｈｏｄｓｌｉｍｉｔｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｔｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｃｒｏｐｓｔｒａｗ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｔｈｅｎａｔｕｒａｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｏｒｇａｎｉｓｍｗｉｔｈｃｏｌｌｕｌｏｓｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｉｓａｂａｓｉｃｗａｙｔｏｓｏｌｖｅｔｈｅｐｒｏｂｌｅｍａｂｏｖｅ．Ｂｙｈｉ曲ｔｈｏｕｇｈｓｃｒｅｅｎｉｎｇ（ＨＴＳ）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｗｅｏｂｔａｉｎｅｄｆｏｌｌｏｗｉｎｇｒｅｓｕｌｔ．

Ｉｎｔｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈ，３５ｂａｃｔｅｒｉａｌｓｔｒａｉｎｓ

ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｈａｖｅｂｅｅｎｏｂｔａｉｎｅｄ．ａｎｄ１１ｆｕｎｇａｌｓｔｒａｉｎｓｔｈａｔｈａｖｅｅｆｆｉｃｉｅｎｔｃｅｌｌｕｌｏｓｅ

Ｗｉｔｌｌｎａｔｕｒａｌｓｔｒａｗａｓｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅ，ｗｅｏｂｔａｉｎｅｄａｓｔｒａｉｎｏｆｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｆｕｎｇｉｔｈａｔｃｏｕｌｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｃｒｏｐｓｔｒａｗｃｅｌｌｕｌｏｓｅ．ＴｈｉｓｓｔｒａｉｎＷａｓｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓＧｉｂｂｅｒｅｌｌａｆｕｊｉｋｕｒｏｉａｃｃｏｒｄｉｎｇ

ｒＤＮＡｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．ｔｏｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃｔａｘｏｎｏｍｙａｎｄｔｈｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｉｔｓ１８Ｓ

Ｗｉｔｈｕｎｓｅｔｔｌｅｄｓｔｒａｗａｓｏｎｌｙｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅ，ｖａｒｉｏｕｓｆａｃｔｏｒｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅ，ｉｎｏｃｕｌａｔｉｎｇｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ，ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇｔｉｍｅ，ｉｎｉｔｉａｌｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｉｎｉｔｉａｌｐＨｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｕｌａｓｅｈａｖｅｂｅｅｎ

ｓｏｕｒｃｅｅｔａｌｔｈａｔｃａｌｌａｆｆｅｃｔｓｔｕｄｉｅｄ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｂｅｓｔｎｉｔｒｏｇｅｎＷａｓＣＯ（ＮＨ２）２，ｉｎｏｃｕｌａｔｉｎｇｖｏｌｕｍｅＷａｓ５％，ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇｔｉｍｅｗａｓ１２０ｌｌ，ｉｎｉｔｉａｌｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅＷａｓ２８～３７＂ＣａｎｄｉｎｉｔｉａｌｐＨｏｆｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｗａｓ５～６．ＩＶ

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ＳＥＭａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＧｉｂｂｅｒｅｌｌａｆｕｆｉｋｕｒｏｉｄｅｇｒａｄａｔｅｄｔｈｅｃｅｌｌｕｌｏｓｅｆｒｏｍｔｈｅｉｎｎｅｒｓｕｒｆａｃｅｔｏｔｈｅｅｘｔｅｒｎａｌｓｕｒｆａｃｅ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ、析ｔｌｌｔｈｅｕｎｓｅｔｔｌｅｄｒｉｃｅｓｔｒａｗ，ｔｈｅｒａｔｉｏｏｆｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅａｎｄｘｙｌｏｇｅｎｒｅａｃｈｅｄ３８．９％，５７．９％ａｎｄ２６．５％．ｎｌｅｒａｔｉｏｏｆｓｔｒａｗｗｅｉｇｈｔｌｅｓｓｎｅｓｓｒｅａｃｈｅｄｏｖｅｒ５３％ｖｉａｔｈｅｆｕｎｇｉ’Ｓａｃｔｉｏｎｏｎｎａｔｕｒａｌｓｔｒａｗｆｏｒ８ｄ．功ｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｉｔｓｅｎｚｙｍａｔｉｃｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＧｉｂｂｅｒｅｌｌａｆｕｊｉｋｕｒｏｉｃｏｕｌｄｐｒｏｄｕｃｔａｖａｒｉｅｔｙｏｆｄｅｇｒａｄｉｎｇｅｎｚｙｍｅｓ，ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（ＣＭＣａｓｅ）、ｎａｔｕｒａｌｃｅｌｌｕｌａｓｅａｎｄＦＰＡａｓｅｒｅａｃｈｅｄ１．７２３ＩＵ／玎１Ｌ、０．３６８１１ＬＪ／ｎ１Ｌａｎｄ０．３４４ｎ乃，ｍＩ，．Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｔｈｅｅｎｚｙｍａｔｉｃｒｅａｃｔｉｏｎｗｅｒｅａｂｏｕｔ５０℃ａｎｄｐＨ６；Ｕｎｄｅｒ５０＂Ｃ，ａｔｐＨ５，－。６，ｔｈｅｅｎｚｙｍｅｓｈｏｗｅｄｈｉｇｈａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｇｏｏｄｓｔａｂｉｌｉｔｙ；Ｍｇ什，Ｃａ十ｗｅｒｅｔｈｅａｃｔｉｖａｔｏｒｓａｎｄＰｂ２＋，Ｃｕ¨ｗｅｒｅｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆｔｈｅｅｎｚｙｍｅ．

Ｔｈｅｓｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｈａｖｅｎｏｔｂｅｉｎｇｒｅｐｏｒｔｅｄ，ＳＯｉｔｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂａｓｅｓｆｏｒｉｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅｓｔｒａｉｎａｎｄｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｉｔｓｅｎｚｙｍａｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｏｒｄｅｒｔｏｍｅｅｔａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ；Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａｆｕｊｉｋｕｒｏｉ；Ｃｅｌｌｕｌａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ；Ｓｔｒａｗ；Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｐｒｏｄｕｃｉｎｇｅｎｚｙｍｅ；ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｎｚｙｍａｔｉｃｒｅａｃｔｉｏｎｓＶ