高等植物的交替氧化酶研究进展

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云南植物研究 2007,29(4):447～456

ActaBotanicaYunnanica

高等植物的交替氧化酶研究进展*

王雅英1,

2,田惠桥

(1

福建漳州市农业科

学研究所,

福建漳州

363005;2厦门大学生命科学学院,福建厦门 361005)

摘要:交替氧化酶(AlternativeOxidase,AOX)广泛存在于高等植物、藻类和原生生物线粒体内膜。从主呼吸链的辅酶Q分岔,是氧化辅酶Q、还原氧分子生成水的另一终端氧化酶。氧化过程没有质子穿膜运动、热量以产热方式散发。产热植物中交替氧化产生的热量使花粉发出芳香味吸引虫传粉。推测植物AOX使植物在环境胁迫下维持呼吸,调节能量平衡,抵抗氧化胁迫,保持三羧酸循环的运行。AOX是首次发现的双铁羧酸蛋白质成员中的膜蛋白质,AOX与膜分离后容易失活,至今尚未有三级结构的报导,只有二级结构的2种假设模式,最新的模式AOX为膜界面蛋白质而不是跨膜蛋白。最近我们的研究表明有2个途径可获得适量有活性的AOX:建立优化的pFLAG-1-AOX大肠杆菌超量表达系统;从产热植物如斑叶阿若母(Arummaculatum)花序组织线粒体分离纯化有活性的AOX。

关键词:交替氧化酶;高等植物;研究进展

中图分类号:Q945 文献标识码:A 文章编号:0253-2700(2007)04-447-10

WANGYa-Ying1,2,TIANHui-Qiao2**

(1AgriculturalSciencesInstitute,Zhangzhou363000,China;2SchoolofLifeSciences,XiamenUniversity,Xiamen361005,China)oxidase(AOX),aterminaloxidaselocatedintheinnermitochondrialmembrane,hasbeenidenti-fieduniversallyinplant,algae,fungi,andprotozoan.AOXbranchesfromthecytochromepathwayattheleveloftheubiquinoneandcatalysestheoxidationofubiquinolandreductionofoxygentowater.Thereisnon-protonmotiveandenergyisliberatedasheatinsteadofproducingATP.Inthermogenicplants,heatreleasedbyAOXattractsinsectsforpollinationbyheatingaromaticcompounds.TheuseofAOXinplantmay(a)allowflexibilityofrespirationunderchangingenviron-mentalconditions(b)regulateenergyhomeostasis(c)helppreventoxidativestress(d)maintainTCAcycleturnover.AOXisamemberofdi-ironcarboxylateproteins.TwostructuralmodelsexistforAOXandthelatestoneisamonotopicproteininsteadofspanmembrane.Relativelylittleisknownaboutits3-dimensionalstructure.Mainreasonisthatthesuffi-cientquantitiesofAOXsuitableforcrystallogramstructuralstudiesisunavailablebecauseofitsunstableness.Recentlywetriedtoobtainsufficientquantitiesalternativeoxidaseprotein(AOX)forfurtherconstructionstudies.Theaimisachievedbyover-expressinginE.coliandimprovingpurificationofnativeAOXfromArummitochondrial.

AlternativeOxidase;HigherPlant;StudyingProgress

植物除主呼吸链外,还存在其它电子传递分

支途径,如对氰化物、抗霉素A不敏感的抗氰

呼吸或交替呼吸途径(Alternativepath,AP)(图

1.1)。交替氧化酶(alterativeoxidase,AOX)是交替呼吸途径中的末端氧化酶,普遍存在于高等植物、真菌、藻类和部分寄生虫以及原核生物中(Berthold等,2002)。该途径只有电子传递但不伴随质子穿膜运动,不能形成驱动ATP合成的

基金项目:国家自然科学基金(No.30570104)

通讯作者:Authorforcorrespondence.E-mail:hqtian@http://wendang.chazidian.com;Tel:0592-2186486

收稿日期:2006-07-13,2007-01-25接受发表

作者简介:王雅英(1962-)女,副研究员,理学博士,植物学

4 4 8 云 南 植 物 研 究 膜质子势差,因而没有ATP合成,是一种耗能呼吸(Moore等,1978)。在佛焰花序植物中,花序产热释放出芳香气味吸引昆虫帮助传粉。推测AOX还与果实成熟(梁五生和梁厚果,1997)、抗逆抗氧化胁迫(吴强等,2003),抗水分胁迫(何军贤等,1999),抗真菌和抗病毒病理有关(Berthold等,2002)。目前,有关植物抗氰呼吸的环境调节以及环境胁迫条件下植物抗氰呼吸的生理学意义已成为植物呼吸代谢领域的前沿课题(吴强等,2003)。但由于AOX与线粒体膜分离后其活性不稳定,很难获得适量纯的具活性的AOX供其三级结构分析,有关它的结构及代谢调控机理还不清楚(Hourton-Cabassa等,2004),本文结合作者分离纯化活性AOX的研究,介绍近年来AOX研究进展。

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水杨酸羟肟酸(SHAM)则阻止辅酶Q的电子向交替氧化酶传递(潘瑞炽等,2004)。在细胞色c还原酶和细胞色素氧化酶抑制剂(例如抗霉素A和氰化物)存在时,电子传递依然能沿着交替途径进行。而羟氨基酸和五倍子酸化合物能抑制AOX活性,却不影响主呼吸链途径活性(Hoefn-agel等,1995a)。产热植物枯苞(Sauromatumguttatum)、海芋(Arummaculatum)的线粒体产生较高热量就是由于其富含AOX。有些佛焰花序植物在冬天开花时,花序温度可在一定时间内提高10℃以上就是因为花序中大量的线粒体进行抗氰呼吸的缘故。

尽管很早就有人发现对氰化物不敏感的AOX呼吸途径,但相对于其它呼吸蛋白,因为缺少纯化的活性AOX,至今AOX的三级结构及酶活性调节机理还不清楚。上世纪80年代从产热植物线粒体中分离到不完全纯化的AOX,表明抗氰呼吸活性是辅酶Q氧化和氧分子还原成水的过程,由单一呼吸氧化酶(AOX)负责催化。从枯苞获得AOX单克隆和多克隆抗体,AOX研究迈出重要一步。AOX的分子量为35～37kDa(Elthon等,1989)。线粒体中表现出抗氰呼吸活性AOX分子量为36kDa(梁五生和梁厚果,1997)。有人发现枯苞的功能性AOX约为30

kDa,

1 高等植物中的交替氧化酶

植物中的抗氰呼吸是呼吸链的分枝途径,它从辅酶Q分枝。有些专一性的电子传递抑制剂可以阻断呼吸链中某一部位的电子传递。如鱼藤酮(rotenone)、安米妥(amytal)可阻断电子由NADH向辅酶Q传递,抗霉素A(antimycinA)抑制电子从细胞色素bc1向细胞色素氧化酶传递;氰化物阻止电子从细胞色素氧化酶传至氧;

图1 植物线粒体呼吸链(WhitewoodandMoore,2004)。

P-side:线粒体内膜外侧,N-side:线粒体内膜内侧。NDp:位于线粒体内膜外侧的NADH,

NDn:位于线粒体内膜内侧的NADH。AOX:交替氧化酶,Succinate:琥珀酸。

Fig.1 Therespirationchainofplant

4期

王雅英等:高等植物的交替氧化酶研究进展 4

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免疫反应实验表明AOX通过还原巯基形成二聚体的方式失活(UmbachandSiedow,1993)。

首次从大肠杆菌cDNA文库中分离到该酶的基因,AOX基因是核编码,在细胞质中翻译,进入线粒体之前的全蛋白全分子量约为39kDa(RhoadsandMcIntosh,1991)。KumarandSou(1996)的研究表明细胞表达的AOX需经过修饰后才具活性,活性分子量为31kDa。

主呼吸链和交替途径的电子传递之间的分歧机制研究得较多。当细胞色素途径饱和时,AOX途径才传递电子(BahrandBonner,1973)。但这种只考虑了抑制剂对呼吸速率的影响而忽略了另一种可能性,即一个途径的抑制会改变底物的有效性,从而影响非抑制的电子传递途径(Millar等,1995)。Moore等(1988)用Q—电子仪同时测定呼吸活性和离体线粒体Q池的还原水平,发现细胞色素与Q氧化还原势是线形相关,与AOX呈非线形相关:当Q氧化还原势降低20%时,AOX活性不成比例的提高。有机酸提取研究有关Q氧化还原势的结果也得出相同结论(Ribas-Carbo等,1995)。Hoefnagel等(1995b)用电化学方法的测得结果也表明,AOX被低Q氧化还原势激活后,可以与细胞色素途径争夺底物QH2。

分光光度计测定了离体线粒体AOX和细胞色素对氧化型辅酶I(NADH)的氧化亲和性。AOX对氧的亲和力(1.7μM)是细胞色素的10

倍(Millar等,1994)。氧分子电压仪的方法重复研究AOX的结果表明氧亲和力为10～20μM(Ribas-Carbo等,1994),明显高于分光光度方法。但2个实验都表明AOX对O2的亲和力明显高于细胞色素的趋势。低Q还原势下AOX氧亲和力明显提高。Affourtit等(2001)则认为这是由于人为地失去AOX活体状态的调控作用,不是酶的内在性质。

2 交替氧化酶的结构

由于很难获得纯化的AOX,所以用物理技术分析其蛋白质结构受到了限制,尽管人们曾做了许多尝试,但对其结构仍不明确(Zhang等,1996)。根据DNA重组技术和序列知识,已经有多种关于AOX结构的假设,如SUM和AN模式(图2)。SUM模型(Siedow等,1992)认为,2个跨膜螺旋镶嵌在线粒体内膜,1个“表面螺旋”位于膜间隙,N末端和C末端为亲水结构域,伸进线粒体基质。C端有4个小的螺旋,其中第1个和第4个螺旋各包含1个保守的EXXH模块,形成双核铁中心。N端保守的半光氨酸残基可能是AOX单体间二硫键的形成位置。AOX的C端有3个高度保守的区域,其中的两个区域,GluGluGlu-Ala-Ile-His和AlaAspGlu-Ala-His-His,与甲烷单加氧酶(MMO)双核铁中心区域很相似(Rosenzweig等,1993)。

AnderssonandNordlund(1999)认为

SUM模

图2 AOX结构模式(Albury等,2002)

A:SUM模式;B:AN模式(IMS:线粒体膜间隙;IM:线粒体内膜;M:线粒体基质;EΧΧH:铁结合模块)

Fig.2 TheAOXStructuralModels

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式和其它结构明确的双铁羧酸盐蛋白不一致。首先AOX的SUM模型中四螺旋纺缍形态折叠过程与其它双铁羧酸盐蛋白不相同;其次,所有两个铁蛋白中都有一个连接氨基酸残基(H273)却不存在于SUM模式中;第三,螺旋连接空间、顺序、方向均不同于该蛋白家族的其它蛋白。螺旋体比较短,因此蛋白质不如长螺旋体蛋白稳定(Aberg等,1993)。为了解释这些矛盾,Anders-sonandNordlund(1999)提出类似其它双铁蛋白结构的AOX活性位点模式(AN模式)。这种新模型放弃了跨膜螺旋的假设,保留了双铁中心,以特别长的4螺旋束代替以前的短螺旋束,并认为这可能是交替氧化酶的活性位点,EXXH模块位于第2和第4螺旋上。新模式认为AOX是一种膜界面整合蛋白,是双铁核羧基蛋白家族中的一员,该家族包括核苷酸还原酶(RNR)R2亚基,甲烷单加氧酶(MMO),硬脂酰-ACP△9去饱和酶(吴强等,2003)。AOX模型不再是跨膜连接,而是通过疏水螺旋区平行膜表面与脂双层的单面相互反应,类似于其它结构已明确的内表面膜蛋白(Wendt等,1999)。

AOX氨基酸序列存在3个相邻谷氨酸残基(E268～E270),其中一个是SUM中的E270,另一个是AN中的E269。原位基因突变研究了E270的作用,发现突变基因E270N在酵母线粒体内膜的AOX失活,说明E270对催化起作用(Albury等,1998)。进一步的研究表明E270的丙氨酸、亮氨酸及天冬酰胺酸突变体都导致在大肠杆菌中表达的蛋白失活(Chaudhuri等,1998)。E270发生天冬酰胺或组氨酸突变后能保持20%活性,因为天冬酰胺和组氨酸能与铁结合,突变体能部分保留E270与铁结合的功能。E269发生丙氨酸突变也导致蛋白失活(Wu等,1998)。随后在拟南芥(Arabidopsisthaliana)中发现编码与AOX相同蛋白质的基因突变体(Berthold等,2000),该蛋白是质体终端氧化酶(PTOX)。但PTOX只有一个谷氨酸,这二种酶连接铁原子的都是E268残基,而不是E270或E269(Ajayi等,2002)。但为什么E268～E270基因突变产生相同结果的机制尚不清楚。另二个位点E217A和H220A的突变也可使蛋白失活,但其原因更倾向于AN模式(Albury等,2002)。在SUM模式中

E217与催化中心较远,当E217位点由Glu突变为Ala时,理论上对活性位点的影响较小,E217A的突变导致蛋白失活的可能性较小。在AN模式中,由于E217和H220就是铁结合位点,这两个位点的突变导致蛋白失活的解释更合理一些。研究AOX1a蛋白在大肠杆菌中的表达并首次获得AOX的电子顺磁共振(EPR)信号,证明是双铁羧酸盐氢氧桥键的特征(Berthold等,2002)。AOX蛋白分子中的E217或E268发生丙氨酸突变后,在蛋白失活的同时EPR信号消失,该实验支持AOX的AN模式。

3 交替氧化酶的催化机制

在呼吸作用的主要电子传递过程中,三羧酸循环中的氢传递体(辅酶I,NADH和黄素腺嘌呤二核苷酸,FADH2)将电子传递给泛醌(Q)形成还原型泛醌(QH2),2个QH2分子的4个电子经过细胞色素bc1复合物,再传递给细胞色素氧化酶(含有两个铜离子),还原2个氧分子生成2个水分子。在交替呼吸过程中,2个QH2分子的4个电子经过AOX传递给氧也形成2个水分子。由于AOX含有非血红素铁中心,而不是细胞色素氧化酶的铜中心,AOX的催化反应原理与细胞色素氧化酶的催化机制不同(Affourtit等,2000)。AOX可能以类似甲烷单加氧酶(MMO)的铁蛋白催化氧还原成水。通常MMO的2个三价铁离子(Fe3+

)可被QH2还原为2个

二价铁离子(Fe

2+

),结合氧分子后形成氧和

QH2的中间产物,进而中间产物分开生成一个水分子和2个被氧化的三价铁离子。在没有甲烷底物时,MMO通过还原性高价铁离子(Fe4+

)发

生氧化反应,QH4+

2将高价铁(Fe)还原为三价

(Fe

3+

)而催化氧还原生成2个水分子(Affourtit

等,2002)。有人则认为水的形成过程中高价铁离子和氧不形成中间产物,而是由高价铁离子将氧分子直接还原成水分子(Berthold等,2000)。

Affourtit等(2000)认为在细胞色素氧化酶活化过程中,由铜中心的4个电子还原氧分子是一步完成的。但在交替呼吸途径中,铁中心的二价铁离子有可能通过三价或一步产生四价铁离子并与氧结合使之还原成水。细胞色素氧化酶和光

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合系统II都可由酪氨酰激活。AOX也能被氨基酸激化,由1个或2个具还原活性的氨基酸提供电子替代高价铁,催化反应中双铁蛋白RNR还原活性的酪氨酸还原高价铁为三价铁(Berthold等,2000;Albury等,2002;Affourtit等,2002)。当AOX中的2个酪氨酰发生变异时,常常会改变蛋白质的活性,比如其中一个突变体(Y275F)在酵母线粒体表达时蛋白失去酶活性,因此认为Y275可能是酶活化形式(Albury等,2002)。

4 交替氧化酶的调控

AOX有二种激活调节机制,一种是二聚体双硫键还原激活,另一种是有机酸直接激活AOX活性。上世纪90年代,UmbachandSiedow(1993)用电泳分离线粒体AOX,发现其分子量为30～40kDa,而二聚体为60～70kDa。二氯二苯三氯乙酸(DDT)氧化还原使二者互换,说明连接两个单体的是双硫键桥。AOX能被还原态的DDT还原激活(Umbach等,1994)。还原态的AOX能通过化学方法再聚合,说明线粒体AOX存在非共价联接。线粒体中的AOX二聚体在自然条件下存在着共价和非共价结合两种状态,推测可能是硫氧化还原蛋白催化蛋白二硫键还原,从而使酶活化(梁峥等,2001)。线粒体内NADH还原AOX为结合蛋白,AOX的活性由线粒体基质还原能力调节(SiedowandUmbach,1995)。

丙酮酸是三羧酸循环的底物,而AOX是电子传递链中的一个分支酶。Millar等(1993)发现,加入丙酮酸后的线粒体AOX呼吸活性提高4倍,QH2氧化活性也提高。其它有机酸,如乙醛酸、草酰乙酸也能活化AOX,但需要的浓度较高。有机酸活化AOX发生在线粒体基质,琥珀酸和苹果酸激活线粒体AOX活性是通过琥珀酸脱氢酶和苹果酸酶的作用,在基质中生成丙酮酸(Millar等,1996)。丙酮酸改变AOX活力,同时内源Q氧化还原势也发生变化(Djajanegara等,1999)。不加丙酮酸,Q氧化还原势较高(40%～60%)时AOX活性才发生变化。加入丙酮酸,较低Q还原势(0%～20%)就可使AOX活性发生改变。丙酮酸能提高AOX与QH2的亲和力(Umbach等,1994)。有人则认为丙酮酸只是激

活AOX并明显改变最快的反应速度(Vmax)但不影响酶与QH2的亲和力(Hoefnagel等,1997)。丙酮酸能活化硫醇进一步还原AOX,但不能激活共价连接的AOX(Vanlerberghe等,1995)。研究半胱氨酸与氢硫基化合物相互作用影响大豆线粒体AOX活性,发现用NEM(乙基马来酰亚胺)预处理能干扰丙酮酸的激活作用,从而抑制AOX活性(UmbachandSiedow,1996)。

氨基酸序列分析表明,AOX的两个半胱氨酸残基C122、C172是AOX二聚化的位置。原位基因突变AOX1(Vanlerberghe等,1998)和AOX1a(Rhoads等,1998)研究,C122突变可使AOX不为丙酮酸激活,也不为化学氧化聚合。野生型AOX的95%活性依赖α-酮酸,而C122E(突变为谷氨酸)突变的蛋白酶不为丙酮酸激活。此种基因突变还表明,这个位点上的电荷变化是重要的因子,可诱导正电荷或负电荷,其蛋白质的性质与C122E突变体相似,也不为丙酮酸激活。大豆C122A(突变为丙氨酸)突变体也不为丙酮酸激活,但却能为大肠杆菌膜和烟草线粒体的琥珀酸激活(Djajanegara等,1999)。C122S突变体也有这个特性(Umbach等,2002)。这种生理现象与含丝氨酸的同工酶有关(Holtzapffel等,2003)。有实验表明含C122同工酶的AOX1b及AOX1a在酵母表达,其离体线粒体AOX活性能为琥珀酸和丙酮酸分别激活(Holtzapffel等,2003)。与丙酮酸相比,AOX与琥珀酸和丝氨酸及丙氨酸之间都不能产生共价联接,说明可能还有其它的作用机制。

AOX活性调控受多种因素影响,环境胁迫,植物受伤、冻害、干旱、渗透压及病菌等都可诱导AOX表达。水杨酸(SA)、过氧化氢、乙烯和主呼吸链抑制剂也同样能诱导AOX在植物中的表达。抗氰呼吸活性和AOX表达在产热植物的佛焰花序中较高(Leach等,1996)。在非产热植物中,AOX表达水平与发育状态有关,如在衰老(Maxwell等,2002)和果实成熟过程中都有AOX的表达(Holtzapffel等,2002)。

大豆(Finnegan等,1997)、水稻、芒果、玉米(Karpova等,2002)的AOX是多基因家族,大豆和水稻不同组织AOX表达水平不同(Saika等,2002)。AOX蛋白有亚分子AOX1和AOX2