单个B细胞抗体制备技术及应用

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迟象阳 等/单个B细胞抗体制备技术及应用 生物工程学报 June 25, 2012, 28(6): 651?660

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特邀综述

单个B细胞抗体制备技术及应用

迟象阳，于长明，陈薇

军事医学科学院生物工程研究所，北京 100071

迟象阳, 于长明, 陈薇. 单个B细胞抗体制备技术及应用. 生物工程学报, 2012, 28(6): 651?660.

Chi XY, Yu CM, Chen W. Single B cell monoclonal antibody technologies and applications. Chin J Biotech, 2012, 28(6): 651?660. 摘 要: 单克隆抗体是现代生命科学研究的重要工具，为许多领域的发展作出了不可估量的贡献。随着PCR技术和单克隆抗体技术的发展和成熟，单个B细胞抗体制备技术迅速兴起。该技术能够对单个的抗原特异性B细胞进行抗体基因的体外克隆和表达，保证了轻重链可变区的天然配对，相较于传统的抗体制备技术具有效率高、全人源、基因多样性更丰富等优势。单个B细胞抗体制备技术已成为制备全人抗体的热门方法，同时也促进了包括抗体发生成熟、疫苗保护机制、疫苗开发、肿瘤及自身免疫疾病等免疫学相关研究。文中就单个B细胞抗体制备技术的过程及应用作简要综述。

关键词: 单克隆抗体，单个B细胞，免疫球蛋白基因，逆转录PCR

Single B cell monoclonal antibody technologies

and applications

Xiangyang Chi, Changming Yu, and Wei Chen

Beijing Institute of Biotechnology, Beijing 100071, China

Abstract: Monoclonal antibodies (mAbs) contribute a lot to the development of numerous fields in life science as a pivotal tool in modern biological research. Development of the PCR methods and maturation of antibody production have made it possible to generate mAbs from single human B cells by single cell RT-PCR with successional cloning and expression in vitro. Compared to traditional monoclonal antibody technologies, single B cell technologies require relatively fewer cells, which are highly efficient in obtaining specific mAbs in a rapid way with preservation of the natural heavy and Received: November 30, 2011; Accepted: February 14, 2012

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 81172980), National Science Fund for Distinguished Young Scholars (No. 81025018).

Corresponding author: Wei Chen. Tel: +86-10-66948565; E-mail: chenwei0226@http://wendang.chazidian.com

Changming Yu. Tel: +86-10-66948692; E-mail: yuchangming@http://wendang.chazidian.com

国家自然科学基金 (No. 81172980)，国家杰出青年科学基金 (No. 81025018) 资助。

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ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech June 25, 2012 Vol.28 No.6

light chain pairing. With so many advantages, single B cell technologies have been proved to be an attractive approach for retrieval of naive and antigen-experienced antibody repertoires generated in vivo, design of rationale structure-based vaccine, evaluation and development of basic B cell biology concepts in health and autoimmunity, and prevention of infectious diseases by passive immunization and therapy for disorders. Accordingly, this review introduced recent progresses in the single B cell technologies for generating monoclonal antibodies and applications.

Keywords: monoclonal antibody, single B cell, immunoglobulin gene, RT-PCR

单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具，自1975年杂交瘤单克隆抗体技术的出现，单克隆抗体迅速在生命科学研究和临床检测诊断中得到了广泛的应用，为许多领域的发展作出了不可估量的贡献。目前单克隆抗体制备技术有杂交瘤技术、EBV转化B淋巴细胞技术、噬菌体展示技术、转基因小鼠技术以及单个B细胞抗体制备技术等[1]。

传统的鼠杂交瘤单克隆抗体技术的基本过程是将来源于免疫接种过的小鼠的B细胞与骨髓瘤细胞融合，继而筛选出既能无限增殖又能分泌抗体的鼠杂交融合细胞，但是这种方法得到的鼠源抗体免疫原性高、半衰期短，往往临床疗效不显著。即使是对鼠源单克隆抗体进行完全人源化的基因工程改造，也不可能完全消除鼠源单抗的免疫原性，对临床疗效的改善依然有限[2]。

为了减少鼠杂交瘤抗体和人源化抗体的免疫原性，提高抗体生物效应，许多研究者尝试各种方法来获得全人抗体。其中人杂交瘤技术是在鼠杂交瘤技术的基础上发展的一种抗体制备技术，这种方法是将免疫过的人或鼠B细胞与人骨髓瘤细胞融合从而获得无限传代且能分泌抗体的杂交融合细胞，该技术虽然克服了鼠杂交瘤技术免疫原性等不足，但是仍有较多局限，如人骨髓瘤细胞系非常有限、细胞融合成功率低且容易造成染色体丢失等[3]。针对于以上缺陷，研究者

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利用EB病毒 (Epstein-Barr Virus，EBV) 在体外能感染正常静止的B细胞，使它们变成永生化的淋巴细胞系这一特性，制备分泌人单抗的杂交瘤细胞，即EBV转化B细胞技术。然而，EBV转化B细胞株不是恶性肿瘤细胞，较难克隆且抗体产量低，因而仍然没有得到广泛应用[4]。

噬菌体展示技术是目前广泛应用的体外筛选人源抗原特异性抗体可变区基因的一种方法，噬菌体展示是将抗体DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使抗体随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术[5]。这种方法无需B细胞培养过程、较为简单，但是得到的抗体并非在人体中表达，可能导致构象改变从而丢失抗原特异性，并且由于抗体重链和轻链 随机组合，无法保持抗体重链轻链的天然配对[6]。

除此之外，转基因鼠抗体制备技术在破坏鼠内源抗体基因后导入人抗体基因，进而用目标抗原免疫转基因鼠并在其体内表达人源抗体，这种方法得到的抗体产量和亲和力较高，但是鼠与人类免疫系统组成上的差异限制了其应用前景[7]。

近几年来新兴的单个B细胞抗体制备技术是一种体外克隆和表达单个抗原特异性B细胞抗体基因技术，这种方法保留了轻重链可变区的天然配对，具有基因多样性好、效率高、全人源、需要的细胞量少等优势。以下将详细介绍单个B细胞抗体制备技术及其应用。

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1 单个B细胞抗体制备技术过程

1.1 鉴定和分离单个B细胞

抗体基因的来源随研究目的差异而不同。Wrammert等[8]制备的抗H1N1抗体是从外周血中分离浆细胞 (Plasma cells) 获得；Morris等[9]则通过分离外周血单个记忆B细胞 (Memory B cells) 得到抗HIV抗体；Wardemann等[10]为研究人自身反应抗体的结构和规律，从正常人骨髓中分离前B细胞制备自身反应抗体。

在样品丰富的情况下，为提高特异性抗体得率，可以在分离B细胞之前先通过密度梯度法[11-12]，

或流式细胞分选[13]从外周血中粗分离B淋巴细胞，以ELISPOT进行抗原特异性细胞丰度的评价，从而选择含抗原特异性抗体浓度较高的血样进行后续抗体制备[8,14-16]。也有文献以ELISA法直接比较不同供血者的血样中含特异性抗体的浓度，如Gilbert等[11]利用基于细胞的ELISA技术(Cell based ELISA)估计血样中抗肿瘤抗体的含量。

单个B细胞分离可分随机分离和抗原特异性分离，前者只需分离B细胞，操作简单，但是随机分离适用于抗原特异性抗体浓度较高的血样，通常来自于疫苗接种者或患者，以尽量减轻后续抗体特异性鉴定的工作量[8,17-19]。后者需分离抗原特异性B细胞，操作较复杂，尤其适合抗肿瘤抗体、自身免疫抗体等特异性抗体含量较低的情况

[9-11,15]

。

随机B细胞分离的方法主要有显微操作法(Micromanipulation)、激光捕获显微切割法(Laser capture microdissection，LCM)、荧光激活细胞分选法 (Fluorescence-activated cell sorting，

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FACS)，见表1。显微操作法是在镜下用显微操作仪人工分离B细胞，虽然该方法无需特殊设备、操作简单但是分离效率低，且分离细胞种类有限；激光捕获显微切割法的基本过程是将事先经组织化学、免疫组化或免疫荧光方法染色的样品切片，在显微激光切割系统下观察细胞形态和染色情况并获取单细胞群或单细胞。该方法的特点是操作简单，定位准确，能在目视下从样品中特异挑选同类细胞乃至单一细胞并剔除杂质成分，但是该技术制样复杂，无法自动化在短时间内获取大量单个B细胞；荧光激活细胞分选法以荧光剂和细胞分选仪为基础，用激光束激发单行流动的细胞上结合的抗体所偶联的荧光素，根据产生的荧光信号对细胞进行自动分析或分选。虽然操作较为复杂，对设备和样品的要求较高，但荧光激活细胞分选能够自动化，从而快速准确分选或分析细胞，是目前应用最为广泛的细胞分离方法之一。

目前普遍运用于抗原特异性单个B细胞分离的方法包括：荧光标记抗原多参数细胞分选法 (Fluorochrome-labeled antigens via multi-

parameter，FACS)、抗原标记磁珠分选法 (Antigen- coated magnetic beads)、微雕法 (Microengraving) 以及细胞微阵列芯片法 (Cell-based micro-array chip systems)。荧光标记抗原多参数细胞分选法与荧光激活细胞分选法类似，二者差异在于前者在加入用于标记B细胞表面抗原的荧光抗体之外，还需加入荧光标记的目标抗原用来结合B细胞表面的膜抗体，以分选目标抗原特异性的B细胞。它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，此技术不仅提高分离细胞的纯度，而且可以得到更多的细胞信息，分选各个

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时期的B细胞用于不同的研究方向。该方法具有速度快、精度高、自动化程度高等优点，已成为当代最先进的细胞定量分析分选技术。抗原标记磁珠分选法基本原理是基于细胞表面目标抗原特异性抗体能与连接有磁珠的目标抗原相结合，在外加磁场中，通过目标抗原与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面特异性抗体的细胞由于不能与连接着磁珠的目标抗原结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。这种方法可以在几分钟内从复杂的细胞混合物中分离出高纯度的细胞，在流式分选单细胞前可用磁珠分选法进行预分离，但是由于磁珠影响细胞生物活性因而不利于分离后培养与操作；

表1 单个B细胞分选方法

Table 1 Approaches of single B cell isolation

Random isolation

Approaches

Micromanipulation

微雕法基于软光刻 (Soft lithographic) 微阵列芯片识别、恢复和克隆产生抗原特异性抗体的B细胞，刺激多克隆B细胞产生抗体并将其逐个置于芯片孔内，将该芯片转印至相应的蛋白芯片后，即可用荧光标记的目标抗原识别特异性抗体，进而显微操作将检测到的分泌目标抗原特异性抗体B细胞转移到细胞培养皿中进行后续克隆操作。微阵列芯片法同微雕法具有高通量 (每个芯片分选细胞量高达10万个细胞)、快速、成本低、可直接从多克隆B细胞中分选并鉴定抗体分泌B细胞等优点。另外，Jin等[20]通过酶联免疫斑点微阵列芯片法 (Immunospot array assay on a chip，ISAAC) 高通量制备流感抗体，ISAAC法

Advantages

Low equipment requirements

Simple operation High position accuracy Simple operation

Disadvantages References

Laser capture microdissection

Low efficiency [21-23] Limited types of isolated cells

Low efficiency [24-26] Complicated process of sample preparation

[8,10,12,18-19,27-28]

[6,11,14-15, 29-32]

Fluorescence-activated cell High accuracy and efficiency sorting High degree of automation

Antigen- selective isolation

Fluorochrome-labeled antigens via multi- parameter

Complicated operation High equipment requirements

High accuracy and efficiency Complicated operation High degree of automation High equipment High-throughput and multi- requirements parameter

Capability of isolating B cells at different stages

High purity High cost

Mostly used in pre-isolation Limited bioactivities of fluorescence-activated cell sorting

High accuracy and efficiency Complicated operation Low cost Early and rapid identification of antibody-secreting cells

Antigen-coated magnetic beads [15,18,28, 33-34]

Microengraving/Cell-based micro-array chip systems

[13,20,35-39]

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是微阵列芯片法的延伸和补充，该方法用包被于芯片表面的抗免疫球蛋白抗体来代替微雕法转印蛋白芯片的过程，抗免疫球蛋白抗体能够快速捕捉抗体分泌B细胞分泌的抗体，进而用生物素标记的目标抗原识别特异性抗体，从而达到筛选并分离特异性抗体分泌B细胞的目的。ISAAC法较微雕法另一改进在于，前者能在同一块芯片上筛选针对多种不同目标抗原的特异性抗体，简化了实验过程且更加高效，是目前前景非常广阔的分选B细胞方法。

1.2 扩增和克隆抗体基因

经典克隆未知抗体基因的方法比如cDNA

文库筛选[40-41]等有着共同的弊病，

即实验操作繁琐，周期较长、工作量大。近些年来随着PCR技术的快速兴起和成熟，单个B细胞抗体基因的扩增和克隆也随之发展。

细胞分选时，通常需将单个B细胞分至内含适量细胞裂解液、RNA酶抑制剂和PCR反应试剂的适当容器中，如96孔板。由于单个细胞内RNA含量少，适当的容器可以方便大批量操作、防止样品损失或交叉污染。另外，不同类型B细胞抗体分泌能力差异明显，如抗体分泌B细胞中抗体基因转录本含量远高于记忆B细胞，因此从抗体分泌B细胞中更容易扩增得到抗体基因。

通常从单个B细胞中扩增未知抗体基因，需使用合适的引物进行巢式或半巢式逆转录PCR (Nested or semi-nested RT-PCR)，该过程要求引物具有通用性、灵敏性、特异性，能避免非特异性扩增又能扩增出完整的抗体基因序列，因此合理设计引物序列至关重要。通常针对抗体重链轻链可变区不同前导序列设计前向引物的混合物，反

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向引物特异性互补于抗体恒定区。根据实验目的，如果分离和扩增不同同种型的抗体，反向引物则是特异性互补于各种同种型抗体恒定区的混合物[42-45]。除此之外，为方便重叠延伸PCR重组和酶切克隆抗体重链轻链可变区基因，前向引物5′端和反向引物3′端需要包含限制性内切酶位点。虽然该方法已被应用证实能扩增出部分抗体序列，但产物的多样性仍受限于前向引物结合序列的非保守性，理论上是无法涵盖所有分选到的B细胞中功能性抗体基因[9,12,15,19,25,27]。此外，这种基于混合引物的多重PCR反应体系复杂，在扩增效率、特异性以及抗体基因表达谱的还原 (Repertoire retrieve) 上都可能存在问题。

Ozawa等

[23]

通过5′ RACE (5′ rapid

amplification of cDNA ends) 方法成功扩增出抗体基因编码框5′端的完整序列，该方法通过针对不同同种型抗体恒定区保守序列的特异性反向引物序列GSP引物混合物，直接从细胞中RT-PCR合成cDNA第一链，对第一链加多聚G尾后，继续用一条带有下游巢式PCR引物互补序列和多聚C的前向引物AP合成第二链，进而利用针对AP和恒定区保守序列的特异性引物混合物进行两步巢式PCR，更加特异地扩增出目的基因。传统的5′ RACE法扩增未知基因的细胞含量要求较高，Ozawa提出的单个B细胞5′ RACE材料要求少至仅需一个细胞，且可能扩增出多种前向引物混合物PCR的方法无法扩增出的抗体基因，另外过程中无需纯化PCR产物，省略了复杂的前向引物混合物，大大简化了反应体系[14,20,22,46]。

扩增出的抗体基因片段用重叠延伸PCR方

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