高温高盐条件下嗜蜡菌的培养、驯化及应用潜力

石油天然气学报（江汉石油学院学报）２００８年６月第３０卷第３期

ＪｏｕｒｎａｌｏｆＯｉｌａｎｄＧａｓＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．ＪＰＩ）Ｊｕｎ．２００８Ｖ０１．３０Ｎｏ．３

高温高盐条件下嗜蜡菌的培养、

驯化及应用潜力

易绍金，谈媛（罨薹凳雾嚣誉蒙罴瓮鲁嚣焉篱意）

［摘要］针对许多深度油藏具有高温、高矿化度的特点，通过培养、驯化而得到耐温耐盐的嗜蜡菌，并应

用于极端油藏油井的微生物清防蜡。试验证明，采用驯化的方法可培养出耐温耐盐的嗜蜡菌．其中盐度

（以ＮａＣｌ计，下同）为１％～ｌＯ％的弱耐盐嗜蜡菌可在７５℃下生长；盐度为１０％～２２％的中等耐盐嗜蜡

菌可在６２＂Ｃ下生长；盐度为２２％～３ｓ％的极端耐盐嗜蜡菌可在５５℃下生长。该菌种应用于江汉油田取得

了较好的清防蜡效果。

［关键词］高温；高矿化度；嗜蜡菌；清防蜡

［中图分类号］ＴＥ３５７．９［文献标识码］Ａ［文章编号］１０００—９７５２【２００８）０３—０１４４一０３

在采油过程中，原油中的蜡组分随井筒温度的降低而逐渐析出，这种结蜡现象导致原油粘度急剧上升而影响油井的正常生产，带来井筒热洗频率高，作业成本大等问题。微生物清防蜡是近十年来发展较快的一种经济环保的新技术，已成为主要的清防蜡技术之一［１￣３］。但许多深度在数千米以下的油藏往往具有高温、高矿化度的特点，要在这些油藏进行微生物清防蜡，必须具有耐温、耐盐的高效菌种。大港油田对１５口高温油井进行微生物清防蜡试验，处理效果统计显示存在部分无效井，其主要原因是：井底温度过高（１１４℃）；地层水矿化度偏高Ｃ＞９５０５ｍｇ／Ｌ）［４］。因此，研究适应高温高矿化度下的清防蜡菌种越来越受到人们的重视。笔者通过试验培养、骊化出耐温耐盐的嗜蜡菌，以使微生物清防蜡技术能得到更广泛的应用。

１菌种的培养及生长规律

菌种来源于江汉油田高蜡油井中三相分离器出水处的

水样。无机盐培养液为：ＮａＣｌ（５．０９），ＮＨ。Ｎ０３

（１．０９），Ｋ２ＨＰ０４（１．０９），ＭｇＳ０４?７Ｈ２０（０．５９），

ＦｅＣｌ。（微量），ＣａＣｌ２（微量），蒸馏水（１０００ｍ１）。调节巅

靛

ｐＨ值为７．２～７．４，在１２１℃灭菌２０ｍｉｎ后，在无菌的条巅

掘

件下，将固体工业石蜡５．０９（即以石蜡为唯一碳源），无

机盐培养液９５．０ｍｌ装入２５０ｍｌ的锥形瓶中，向培养液中

注入５．０ｍｌ含混合菌种的水样，采用细菌瓶法［５］（下同）

测定菌种的初始菌量，然后放置于４０℃恒温摇床中培养，图１嗜蜡菌的生长曲线

转速控制在１２０ｒ／ｍｉｎ。该过程所培养菌种即为嗜蜡菌。

为测定其生长曲线，设计测定菌量的时间点分别为１０、

２５、４０、５５、７５、ｉ００、１２０ｈ，得到嗜蜡菌的生长曲线如图１所示。

由图ｌ可以看出，该试验所培养的嗜蜡菌的生长曲线符合一般微生物的生长曲线规律。其中０～２５ｈ为细菌生长的适应期；２５～４０ｈ为细菌生长的对数期；４０～７５ｈ为细菌生长的静止期；７５ｈ后进入［收稿日期］２００８—０１—１５

［基金项目］教育部重点实验室资助项目（Ｋ２００６１０）。［作者简介］易绍金（１９６３一）。男。１９８４年大学毕业，教授，现主要从事石油与环境微生物和油气田环境保护教学与科研工作。

第３０卷第３期易绍金等：高温高盐条件下嗜蜡菌的培养、驯化及应用潜力

?１４５?

细菌生长的衰亡期。

２耐温嗜蜡菌的驯化及特性研究

２．１耐温嗜蜡菌的驯化

取培养４０ｈ后含嗜蜡菌的混合培养液进行耐温能力稳定性驯化培养。驯化时先取５．０ｍｌ处于生长对数期的菌液注入到新鲜培养液中，在１２０ｒ／ｒａｉｎ的摇床中培养（３５℃）１个周期；通过镜检和细菌瓶法测定，发现菌量仍较多时，开始逐渐升高温度，继续培养１个周期；如此反复，直至温度升高到菌量明显减少时停止升温。该过程所培养菌种即为耐温嗜蜡菌。根据试验观察，从３５℃开始驯化，初期以５℃为一个温度梯度，驯化周期为１～３ｄ，当温度升高到６０℃后，以２℃为一个温度梯度，驯化周期为５～７ｄ。试验所得菌量与温度的关系如图２所示。

由图２可知，嗜蜡菌的延滞期随着温度的升高而延长，驯化后的嗜蜡菌在７５℃下生长缓慢且菌量较

少。

圈２不同温度驯化后的菌量

２．２嗜蜡菌耐温驯化过程中耐温特性的研究

通过耐温驯化试验，可观察到所驯化的嗜蜡菌能较长时间内在７５℃下生长，当温度进一步升高后，细菌停止生长；但当菌种直接在１００℃下煮沸２ｈ后再在３５℃下培养３ｄ后，仍有大量菌种，证明所驯化菌种是可耐１００℃并在较高温度下生长的耐温嗜蜡菌，将高温驯化后的嗜蜡菌放于油镜下观察，结果见图３。

由图３可见，耐温嗜蜡菌菌体多成短小、细长状，个体偏小，且有明显芽孢。

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图３显微镜（１６００Ｘ）下耐温嗜蜡菌的形态

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０

３耐盐嗜蜡菌的驯化及特性研究

圈４菌■与盐度的关系

３．１耐盐嗜蜡菌的驯化

取培养４０ｈ后含嗜蜡菌的混合培养液进行耐盐能力稳定性驯化培养。驯化时，先取５．０ｍｌ处于对数生长期的菌液注人最低盐度的新鲜培养液中，培养１个周期，在３５℃下、１２０ｒ／ｍｉｎ的恒温摇床中培养；然后在菌种的对数生长期内再进行转接，同时提高盐度到下一个梯度；依次类推，直到ＮａＣＩ达到饱和为止。耐盐驯化培养液

图５显微镜（１６００）＜）下耐盐嗜蜡菌的形态

?１４６?石油天然气学报（江汉石油学院学报）２００８年６月的ＮａＣｌ含量分别为１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、３５ｏ／／（过饱和），试验所得菌量与盐度的关系（图４）。由图４可知，当培养液中ＮａＣＩ达到饱和时，仍存在大量嗜蜡菌，说明驯化后的嗜蜡菌为极端耐盐的嗜蜡菌。

３．２嗜蜡菌耐盐驯化过程中耐盐特性的研究

通过耐盐驯化试验，可观察到处于低盐度下的嗜蜡菌多为球状，个体较大。而处于高盐度下的嗜蜡菌多为细长杆状，且个体偏小（图５）。低盐度下嗜蜡菌（图５左）与高盐度下嗜蜡菌（图５右）当同一菌群在转接入高盐度培养液时，细菌的延滞期随盐度的升高而延长，因为随盐度的升高，培养液的渗透压升高，对嗜蜡菌的生理代谢造成很大的抑制和毒害作用，嗜蜡菌需要时间来改变自身的代谢系统和启动应对高渗透压的耐盐机制。

４耐温耐盐嗜蜡菌的驯化

为了驯化出既耐温又耐盐的嗜蜡菌，笔者采用了３种驯化方案。

１）先对嗜蜡菌进行耐温驯化，然后在耐温嗜蜡菌的基础上进行耐盐驯化。即先从３５℃开始驯化，初期以５℃为一个温度梯度，驯化周期为２～３ｄ；温度升高到６０℃后，以２℃为一个温度梯度，驯化周期为５～７ｄ；当菌种生长稳定后，再按３．１的方法提高培养基中的ＮａＣｌ含量，初期以５％为浓度梯度，驯化周期为２～３ｄ；达到１５％后再以２％为浓度梯度，驯化周期为５～７ｄ；直至ＮａＣｌ饱和为止。

２）先对嗜蜡菌进行耐盐驯化，然后在耐盐嗜蜡菌的基础上进行耐温驯化。步骤与方案一相反。

３）在进行耐温驯化的同时进行耐盐驯化，即嗜蜡菌先从３５℃开始驯化，以５℃为一个温度梯度，同时提高培养基中的ＮａＣｌ含量，以５％为一个浓度梯度，驯化一个周期（２～３ｄ）；当菌种稳定后再同时提高温度和盐度，如此反复，当菌种减少时，减少温度及盐度的梯度，延长驯化周期，直至菌种明显减少为止。

试验表明，方案一嗜蜡菌耐温至７５℃后再提高盐度到１０％后菌种停止生长；方案二极端耐盐的嗜蜡菌再提高温度到４５℃后菌种停止生长；方案三由于嗜蜡菌耐温耐盐同时培养，生长条件变化波动小，菌种生长旺盛，适应周期长，可观察到嗜蜡菌在不同盐度及不同温度下的生长情况，且菌种的耐温耐盐性能高于前两个方案所驯化出的菌种。其中盐度为ｌ％～ｌＯ％的弱耐盐嗜蜡菌可在７５℃下生长；盐度为１０％～２２％的中等耐盐嗜蜡菌可在６２℃下生长；盐度为２２％～３５％的极端耐盐嗜蜡菌可在５５℃下生长。

５耐温耐盐嗜蜡菌的应用潜力

５．１高温高矿化度油井的微生物清防蜡

本试验所培养的菌种属于耐温耐盐且可耐受１００℃高温的嗜蜡菌，在现场应用中既可保证菌种在高温高矿化度的极端油藏中不死亡，当其随着抽油杆返回地面时又可有效地作用于含蜡原油，达到清防蜡的目的。目前该菌种已试用于江汉油田的高温高矿化度油井，油井井底地层温度１００℃左右，矿化度为２５％，试验的３口油井（广２斜一８井、广斜８—１２井、黄２２斜一４３井）均取得了较好的清防蜡效果。５．２高温高矿化度含油污水生物处理的应用潜力

由于油田采出水成分复杂，可生化性较差，且一般具有高温高矿化度的特点，生物处理难度较大。本试验所培养的菌种可在高温高盐环境下生存，可在一定程度下作用于含油污水，具有～定的应用潜力。

［参考文献］

［１３陈铁龙．三次采油概论［Ｍ］．北京：石油工业出版杜，２０００．

Ｅ２３宗海鹏，张欣．微生物清防蜡技术现场试验［刀．石油钻采工艺，１９９５，１７（４）；９６～９９．

［３３ＡｙｏｕｂＳａｄｅｇｈａｚａｄ，ＮａａｓｅｒＧｈａｅｍｉ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｏｆｗａｘｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｉｎｃｒｕｄｅｏｉｌｂｙｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍ［Ｊ］．ＳＰＥ

８０５２９，１９９５．

［４］冯庆贤．耐高温采油微生物的研究和应用［Ｊ］．石油勘探与开发，２０００，２７（３）：５０～５２．

［５］易绍金．细菌瓶法用于石油烃降解菌菌数测定［Ｊ］．油田化学，２００１．１８（４）；２７２～２７４．［编辑］萧雨