高灌蓝越橘多酚氧化酶的动力学研究

!基础研究

仑兹力的影响，其运动轨迹被束缚在拉默半径内，磁场越大拉默半径越小，导致了细胞内的电子和离子不能正常传递，从而影响细胞正常的生理功能。对于带有不同电荷基团的大分子如酶等则因在磁场下，不同电荷的运动方向不同而导致大分子构相的扭曲或变形，从而改变了酶的活性，因而细胞正常的生理活动受到影响。$("

脉冲磁场作用于细菌的动力学分析

细胞膜的离子通道主要由蛋白质分子组成，在运输离子时，蛋白质分子构成的通道有时打开，有时关闭。但近些年来，人们的研究表明这种开闭传输是服从某些规律的。O:3L:>=B01>=建立了一个非线性的模型PQR，更加符合通道中离子的运动实际。

该模型指出，离子的能量S是通道两边的电压差而膜电压又是激励电流的函数。这样，随着%的函数，

激励电流的变化，离子能量也将产生变化，一旦膜电压达到临界值，离子通道被击穿，细胞膜局部产生一强电位———动作电位从而使细胞膜结构瓦解，破坏细胞，杀死细菌。

另外，通过电磁脉冲作用于细菌的生物学分析发现，温升有利于提高细胞膜的流动性。结合生物模型的分析可知，适当的温升有利于提高电磁杀菌的效果。

以上机理分析，不同程度地在生啤酒杀菌试验中得到证明。

P!RPKRPQRP)R

"##$，%&’(")，*&()

结

论

!!

)

)MI杀菌的效果与脉冲磁场的强度和脉冲数（作用

时间）有关，从曲线的变化趋势可以看出，随着场强的

（作用时间）增加，杀菌效果在增加。随着脉冲数的加长，杀菌效果也在增加。场强和杀菌时间对杀菌效果的影响均有一个有显著到平缓的拐点值，超过拐点值，场强和杀菌时间对杀菌效果的影响大大减小。

且脉冲数大于I#，或)M"脉冲磁场强度大于"(!$/，

场强大于"(II/，且脉冲数大于$#时，生啤酒中残存的细菌总数小于!#个TA’，达到商业要求。

参考文献：PIRP"RP$R

吴岗(高压高频脉冲电场杀菌的研究PUR(华南理工大学学位论文VIJJH(

曾新安(高压电场脉冲在食品生化工业中的应用PWR(食

（Q）：品科学，IJJK，IQ$FK(殷涌光，殷锦捷，孙东升(用高压脉冲电场杀细菌孢子PWR(农业工程学报，+I.(IJJQ，

邹积岩，吴为民(脉冲电场食品处理技术PWR(高电压技

（K）术，"###，(（)）：,6&>1X/，L7651’2,%(N7@:75,0<2901A(IJJ!，)!!JIF!J)(

张铁华(冷杀菌技术在食品加工保藏中的应用PWR(食品（)）：工业科技，IJJJ，"#K$FK!(

O:3L:>=B01>=(Y*&>’:>16U<>7A:97’E&@1’&;Z&>X07>>1’

（K）：:>X1’’E1A467>91PWR(分子生物学报，IJJQ，"I""FI"!(

高灌蓝越橘多酚氧化酶的动力学研究

萌I，LMN&D1’"，EMME15901"

+IM江南大学食品学院，无锡"I)#$K.

+"M法国国立洛林理工学院应用生物化学实验室.

摘

要：采用紫外区域内对底物的扫瞄法研究了高灌蓝越橘!!"##$%&’(#)*$+),’(-."多酚氧化酶的底物专一性，用紫

杨

外分光光度法和极谱测氧消耗法对酶的动力学进行了研究，测定了相应的米氏常数。用二类抑制剂研究抑制剂浓度对抑制剂效果的影响以及抑制剂与酶结合不同时间对抑制效果的影响，从而对高灌蓝越橘多酚氧化酶进行了抑制研究。

关键词：多酚氧化酶+,,-.；专一性；动力学；米氏常数；抑制剂

!"#$%&’$(/012342567512819:;:9:5<&;0:=043204’314166<8&’<801>&’)!"##$%&’(#)*$+),’(-*+&?:@721072411>253@:1@4<7234256751297>>:>=A150&@:>281956&80&5&A156:967>=1(/011>B<A175:9C:>15:92072411>:>D125:=751@4<32:>=501281956&80&5&A156:9A150&@7>@8&’&67=67801A150&@(E:9071’:2F9&>257>5+GA.072411>7227<1@(/01C:>@2&;:>0:4:5&627>@5011;;1952&;:>0:4:5&69&>91>5675:&>7>@&;9&A4:>75:&>5:A1&;:>0:4:5&67>@1>B<A1&>501:>0:4:5:&>&;,,-07D17’2&411>257@:1@(

收稿日期："##"F#HF"$

作者简介：杨萌+IJKKF.，女，工程师，法国工学硕士，研究方向：食品生化与生物技术。

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中图分类号：BCD#!)D

文献标识码：E

文章编号：F$$#A""%$G#$$%H$*A$$!!A$*

!基础研究

多酚氧化酶GIJF)F$)%)FH是一种含铜酶KFL，它是引进果蔬在储存、深加工等过程中褐变的主要酶，直接影响到果蔬的外观、口味、商业价值也急剧下降，研究该酶的性质，寻找有效抑制方法是许多科学工作者所关注的。

高灌蓝越橘*!"##$%&’(#)*$+),’(-+,属杜鹃花

科，蓝紫色的浆果可食，采用丙酮沉淀方法提取该果实的多酚氧化酶，以绿原酸、邻苯二酚、邻苯三酚、儿茶酸、多巴胺为底物，在%$$M!!$<>紫外区域作扫瞄K"L

，发现该酶对一元酚无催化活性，催化氧化邻位二元酚和三元酚的化合物，采用紫外分光光度法和极谱测

氧消耗法分别测N>值分别是：%)!、F)!#、#)$%>>’(OP和#)F*、

#F)$、FQ)#>>’(OP；&>4R分别是F$SF$%、F)*%SF$%、$)#%SF$%酶单位O>8<O>T蛋白和$)%F、$)#$#、$)$"%-#!>’(O>8<。

用了两种类型抑制剂，一种包含酚基因，类似于酚底物结构，而无底物功能的化合物通过直接与酶活性部位结合K!L

KDL

，另一种含UV基团的半胱氨酸，可以还

原醌成含氧二酚化合物，也可直接抑制,,-，它还可和醌形成稳定的半胱氨酸A醌复合物以减少颜色K%L。通过这两种抑制剂的不同浓度对酶活影响，抑制剂与酶预结合时间的不同对酶活影响，从而比较不同抑制剂的抑制效果。F材料和方法F)F

植物材料

供试果实来自法国东部山区，采集于

FDD*年W月，*X下运到法国洛林理工学院GY)+),)PH农业

和食品工业高等联合学校GI)+)U)E)Y)EH的应用生化实验室，速冻于A%$X的冷库。

F)#提取分离操作前，A%$X的果实在*X环境下解冻F@，随后的全部过程*X下操作，F!$T果实用#$$>(丙酮O蒸馏水GQ$Z#$&O&H混合由捣碎器G[340<?R%#H粉碎，用F$$!>至F"$!>的石英板式过滤器抽滤，滤渣用A%$X的丙酮冲洗，冲洗后滤渣为丙酮和滤渣混合物，我们称之为丙酮粉，随后置于室温下晾干。

F)%活性酶的提取用6VW)*的磷酸缓冲液作为溶剂，使上述丙酮粉充分溶解，*X下离心FDW$$S%$>8<，沉淀再用6VW)*的磷酸缓冲液作为溶剂反复提

取一次，合并两次离心后上清液，用氮气压板式超过滤器浓缩，浓缩液为粗酶IF。再用*$\的G+V*H#U-*沉淀离心一次，离心后的沉淀用6VW)*的磷酸缓冲液溶解，此为粗酶I#。

F)*酶活性测定用两种方法，

一种为分光光度法，测定产物形成速度变化，测定波长视底物而定，测定温度为#!X，反应液由Q$$!(6V]*的柠檬酸缓冲液和测定底物F$$!(和酶液F$$!(组成，测定底物有!个浓度，分别从$)#>>’(OP到#>>’(OP。一个酶活力单位为测定条件下，每分钟引起吸光率改变$)$$F所需的酶量K"L。另一种为极谱法，测定底物氧的消耗量，酶活力单位为

测定条件下，

每分钟消耗底物氧微摩尔的量。F)!蛋白质测定P-^_‘法，以牛血清蛋白为标准GWH。F)"底物专一性各底物按酶活性测定系统进行反

应，反应产物用a&A#"$在%$$<>至!!$<>波段进行扫瞄，观察吸收峰存在与否。

F)W抑制剂采用两种类型的抑制剂，一种为类似于酚底物结构，而无底物功能的化合物通过直接与酶活性部位结合，另一种含UV基团的半胱氨酸，从抑制剂的不同浓度G从$至*>>’(OPH对酶活影响，抑制剂与酶不同的预结合时间G从$至#@H对酶活影响，采用分光光度法测定酶活。#

结果与讨论

#)F

底物专一性和酶动力学

在研究底物专一性时，采用了!个底物：绿原酸、邻苯二酚、邻苯三酚、儿茶酸、多巴胺为底物，根据反应：

酚底物b,,-b-#b缓冲液———.底物产物b缓冲液

寻找每个反应产物的最大紫外吸收值，发现以绿原酸、邻苯二酚、邻苯三酚为底物时，在%$$M!!$<>紫外区域作扫描，反应产物存在有吸收峰G图FH，分别是*$$、%DQ、*$$<>。而以儿茶酸、多巴胺为底物时没有吸收峰，说明该酶对一元酚无活性，催化氧化邻位二元酚和三元酚的化合物。此外还注意到了反应过程中的颜色变化，不同的底物颜色不同。当底物为绿原酸时，将酶加入反应液，立即出现黄色并保持!>8<左右；然后逐渐变红；当底物为邻苯三酚时，立即出现红色；当底物为邻苯二酚时，逐渐出现淡红色。

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!基础研究

#$$%，&’()#*，+’)*

表0112的3.和&.45,紫外分光光度法/

底

物

化学结构

最大波长,-./

!"

3.P..’(P6&.45QP.7-P.RS1;’T87-

图0氧化底物产物的紫外吸收

底

物

表#112的3.和&.45,测氧法/

3.P..’(P6#)0*#0)$0H)#

&.45,2#!.’(P.7-/

$)%0$$)#$#$)$I%

绿原酸邻苯二酚邻苯三酚

以绿原酸、邻苯二酚、邻苯三酚为底物，固定最大波长，采用!个浓度，依照67-8984:8;<=;>法作双倒

数,图#/，发现基本成直线，说明选择的底物浓度合适，从得到的米氏常数,表0/中，可以看出较适底物是

邻苯二酚，但从最大反应速度看，似乎是绿原酸较大，112的结构BCD，可直接还原醌，但由于A2#等物质的敏由于我们采用紫外分光光度法测定产物形成速度变感性，EFG,0CHI，0CH"/限制使用有必要发展其它抑制化，这个产物实际是级次反应的产物，有许多因素影响，我们得112的羟基化活力须采用氧气吸收的方法，到结果,表#/，似乎较适底物是绿原酸。#)#

酶活性抑制

目前有许多方法来抑制酶性灰变反应，一般常用方法就是降低反应中的?@值、减少氧压、或用一些还原剂,抗坏血酸，其中A2#可以不可逆的改变A2#/等，

剂，并且大量工作者也已致力于这方面的工作。112是一种含铜酶，根据J4K8;L@4;8,0C"C/

抑制剂：

,0/,#/

螯合剂之类的物质，一些酸、氰化物。

障碍底物与酶活性部位结合的化合物，是许

多类似于二酚底物结构，而无底物功能的化合物，一些人认为这类抑制可能是竞争型的，也有认为这类抑制决定于底物，要么是竞争型的，要么是非竞争型的，要么是混合型的价值。

,%/

一些还原性物质如：抗坏血酸及衍生物、半

胱氨酸等，其中半胱氨酸有其优点，它的效果已被证明并可自由使用，它可以还原醌成含氧二酚化合物，也可直接抑制112，它还可和醌形成稳定的半胱氨酸醌复合物以减少颜色。

在研究抑制剂时，使用了第二和第三种类型的抑制剂：间苯三酚、间苯二酚这些具有*M甲基间苯二酚、

二至三个酚基团化合物作为抑制剂和半胱氨酸作比

图#112双倒数图,紫外分光光度法/

B*D

BHD

有三种类型

针对铜反应的抑制化合物，主要用一些金属

，这些抑制剂通过直接与酶活性部位

结合。掌握这些抑制剂可以为工业生产提供一些利用

较。发现当抑制剂与酶同时与底物相结合时,即酶与抑制剂事先不结合/，在?@N*，测定反应强#!O条件下，度,/光密度P.7-/，半胱氨酸的抑制效果较好，它的

&’()#*，+’)*!"#$$%，

!基础研究

表%酶与抑制剂结合时间与抑制效果的关系

酶与抑制剂结合时间,-.

$$)!5#%

（/$0123）,按抑制效果增加顺序.抑制效果

（$)5!6）（$)5*!）；间苯三酚；间苯二酚,$)5$".；半胱氨酸,$)$"*.*4甲基间苯二酚

（$)5!6）（$)55*）间苯二酚；间苯三酚,$)5%".；；半胱氨酸,$)$"*.*4甲基间苯二酚（$)5#）（$)5#）；间苯三酚；间苯二酚,$)$7.半胱氨酸,$)5#.；*4甲基间苯二酚（$)5$"）（$)5$"）；间苯三酚；半胱氨酸,$)$76.；间苯二酚,$)$6.*4甲基间苯二酚

（$)5!）（$)5#）半胱氨酸,$)5!6.；；间苯二酚；间苯三酚,$)5*.*4甲基间苯二酚

值为$)$"*,表%.。可是如果事先让酶与抑制结合，分别为%$123、发现在%$123时，半胱胺酸的抑制5-、#-，效果仍较好，但在以后的5-，半胱氨酸的抑制效果#-，明显不如另外三种抑制剂。在这三种抑制剂中，*4甲

基间苯二酚的抑制效果在%$123内较间苯二酚、间苯三酚好，但在以后的5、#-抑制效果有所下降。间苯三酚的抑制效果似乎随酶与抑制剂结合时间的增加而增加，但其抑制效果最好的值是酶与抑制剂结合时间为$)5$"!/’0123。间苯二酚随酶与抑制剂结合时#-，

间的增加至#-达最佳抑制效果，为$)$6!/’0123，超过半胱氨酸在开始时的抑制效果,$)$"*!/’0123.，整个抑制剂抑制效果在酶与抑制剂结合时间为%-的时候，都有所减弱。%

结论

果佳。

参考文献DE5FE#F

杨萌，>G’:;(HII;JK-;)高灌蓝越橘多酚氧化酶的提取和纯化ELF)无锡轻工大学学报，577"H,%.D!*4!M)N’(<34N’(O-2=P-QR-2J<@;=GL)STT;KJ’T<PK’=U2K<K2OHP’O2?1U2P?T2J;<3OJ-2’(K’1V’?3OP’31?P-=’’1V’(WV-;3’(’X2O<P;ELFHLHQ1;=2K<3Y-;12K<(B’K2;JWH57"*H%#D5$$%45$$7)E%F

C<(21;JI’3JZ’1;=WIR)YWPJ;23;P<P<323-2U2J’=’TU=’[323Z23\;<=L?2K;K’3K;3J=<J;ELFHL]’’OBK2H57"%D*%H7!547!#)E*F

L<3’:2J^4A(<VVQC;J<()_3-2U2J2’3PJ?O2;P’3<VV(;V’(WV-;3’(’X2O<P;ELF)LQZ=2K]’’OY-;1H577$D%"H7#647%5)E!F

A<3PK2N)Y’3J=2U?J2’3<_‘;J?O;O;_‘23-2U2J2’3O?U=?32PP;1;3J;3^W1<J2a?;O;P:;Z;J<?XV<=(;PK’1V’P;P<T’3KJ2’3J-2’(H1;1’2=;O;/SQ;3PK2;3K;P<Z=’3’12a?;PV=;P;3J;<(‘_+\9)577#)E6F

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在研究底物专一性时，用了!个底物在%$$8!!$31紫外区域作扫瞄，发现其中以绿原酸、邻苯二酚、苯三酚为底物时反应产物存在有吸收峰。分析这三个底物的酶动力学，作923:;<:;=>?=@双倒数图，A1现出两种方法有两种最适底物，一是邻苯三酚，另一个是绿原酸，我们认为以测氧法较为准确。最后用了两种类型抑制剂，一种包含酚基团，另一种含BC基团的半胱氨酸，分析了在相同浓度下，这两种抑制剂与酶同时与底物结合时，即酶与抑制剂事先不结合半胱氨酸的抑制效果较好，抑制效果跟酶与抑制剂结合时间有很大关系，随酶与抑制剂结合时间的增加含BC基团的半胱氨酸抑制效果不如含酚基团类型抑制剂的抑制效

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