木本药用植物红豆杉研究的新进展

林业科学研究??2009,22(3):439~445

ForestResearch

????文章编号:1001??1498(2009)03??0439??07

木本药用植物红豆杉研究的新进展

邱德有,1*吴小红,2黄璐琦3

(1.中国林业科学研究院林业研究所,国家林业局林木培育重点实验室,北京??100091;2.中国中医科学院广安门医院,

北京??100053;3.中国中医科学院中药研究所,北京??100700)

摘要:红豆杉是当今十分重要的一种木本药用植物,从中提取出的二萜类抗癌化合物紫杉醇在全世界已广泛应用于

卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等癌症的临床治疗,效果显著。近年来,人们还发现紫杉醇在其它疾病的治疗中也具

有很好的作用。本文综述了近年来国内外在红豆杉人工栽培、紫杉醇化学半合成、红豆杉细胞培养、产紫杉醇内生

真菌培养、代谢工程方面的最新研究进展,对当前工作中存在的问题进行了探讨,并对有关研究的发展前景进行了

展望。

关键词:红豆杉;人工栽培;紫杉醇;化学半合成;细胞培养;内生真菌;代谢工程

中图分类号:S795.7文献标识码:A

RecentAdvancesinResearchoftheWoodyMedicinalPlantTaxus

QIUDe??you,WUXiao??hong,HUANGLu??qi123

(1.ResearchInstituteofForestry,CAF;KeyLaboratoryofTreeBreedingandCultivation,StateForestryAdministration,Beijing??100091,China;

2.GuangAnMenHospita,lChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing??100053,China;

3.InstituteofChineseMeteriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing??100700,China)

Abstract:Taxusisanimportantmedicinalplan.tTaxol(genericnamepaclitaxel),acomplexditerpeneamidederivedfirstlyfromthePacificyew(Taxusbrevifolia)tree,hasbeenapprovedasanimportantpharmaceuticaldrug.Thisantitumorandantileukemicagentiseffectiveagainstseveralcancerssuchasovarianandbreastcarcinomas.Morerecently,taxolhasshownpromisingresultsindrug??elutingcoronaryarterystentsusedinthetreatmentofdiseasedvasculature.Inthispaper,therecentresearchprogressesinTaxuscultivation,Taxolchemicalsemi??synthesis,Taxuscellculture,endophyticfunguscultureandTaxolmetabolicengineeringaresurveyed.Theproblemsandfutureperspectivesfortheseresearchareasarediscussed.

Keywords:Taxus;cultivation;taxo;lchemicalsemi??synthesis;cellculture;endophyticfungus;metabolicengineering????红豆杉(Taxussp.)为红豆杉科(Taxaceae)红豆

属(Taxus)的木本植物。红豆杉属植物全世界共有

11种,分布于北半球的温带至亚热带地区,其中我

国有4种和1个变种。Wall等[1]与细胞微管蛋白结合,并促进其聚合,从而抑制癌细胞的有丝分裂,有效地阻止癌细胞的增殖。1992年12月美国FDA批准紫杉醇作为治疗转移性卵巢癌的药物,之后又批准可用于治疗转移性乳腺癌。国

产紫杉醇注射液 紫素!于1995年10月开始生产。

紫杉醇是一种广谱抗肿瘤药,它已用于治疗卵巢癌、在1971年从短叶红豆杉(TaxusbrevifoliaNut.t))树皮中分离得到二萜类抗癌化合物紫杉醇。紫杉醇抗癌的作用机制是

收稿日期:2008??12??08

基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)(2007AA10Z182),国家自然科学基金(30671698),中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(2007??01)

作者简介:邱德有(1967??),男,福建上杭人,研究员,从事专业为植物生物化学与功能基因组学.

*通讯作者E??mai:lqiudy@http://wendang.chazidian.com

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林??业??科??学??研??究第22卷

乳腺癌、非小细胞肺癌、食管癌、胃癌、头颈部肿瘤、黑色素瘤、结肠癌等,新的研究成果还在不断延伸红豆杉和紫杉醇的治疗范围。据估计,全世界紫杉醇的年需求量至少在1000kg以上。

令人遗憾的是红豆杉的生长缓慢,资源量有限,特别是其紫杉醇含量低,仅占树皮干质量的0.01%~0.02%

[2]

人工种植需占大量土地,周期长,而且由于色素等干扰,使得从人工种植的红豆杉枝叶中提取紫杉

醇及其半合成前体的难度要比从树皮中提取的难度大得多,得率要低,成本很高,所以,今后大规模栽培提取紫杉醇的红豆杉人工林时,必须选择生长快、紫杉醇含量高的红豆杉良种和优良苗木。对于那些未采用红豆杉良种、有种苗就栽的基地,除了生产紫杉醇外,还要利用其枝叶生产巴卡亭III(baccatinIII),10??去乙酰巴卡亭III(10??deacetylbaccatinIII)等,用这些副产品(半合成前体)来补偿经济上的损失。此外,还应加强对红豆杉人工栽培技术的研究

[7]

,所以,资源与开发矛盾相当突出。近年

来,受利益的驱使,红豆杉的野生资源受到严重破坏,供求矛盾日趋尖锐。为了解决紫杉醇的长期供应问题,人们在人工栽培、紫杉醇化学合成(包括半合成和全合成)、内生真菌、细胞培养和基因工程等领域进行了探索,取得了不少进展

[3-6]

,如

。其中,人工

深入研究不同人工施肥方法和菌根等对植株生长速度、紫杉醇和相关成分含量的影响,制定红豆杉人工栽培的技术规程,为红豆杉药材GAP基地的建设提供技术保障。

栽培、紫杉醇的化学半合成已应用于生产,细胞培养、基因工程也取得了一些进展;而紫杉醇的化学全合成需近30步反应,尚无商业开发价值。近年来,有关方面的研究又取得了一些新进展。下面就红豆杉人工栽培、紫杉醇化学半合成、内生真菌培养、红豆杉细胞培养和代谢工程研究的最新进展作一简要的介绍和评述。

2??紫杉醇的化学半合成

美国BMS(Bristol??MyersSquibb)等公司利用从欧州红豆杉(T.baccataL.)等枝叶中提取分离巴卡亭III(baccatinIII)和10??去乙酰巴卡亭III(10??deacetylbaccatinIII),将10??去乙酰巴卡亭III转化为巴卡亭III后,经过化学半合成法生产紫杉醇,但其合成原料巴卡亭III还须从红豆杉树皮或枝叶中提取,成本仍然较高。紫杉醇半合成法的关键是前体

巴可亭III的获得和生产。除了继续从红豆杉枝叶中提取外,目前的发展趋势是利用工程微生物和酶法进行baccatinIII的生产。美国密执根洲立大学Walker实验室利用表达10??去乙酰巴卡亭III??10??O??乙酰基转移酶基因的大肠杆菌将10-去乙酰巴卡亭III转变成了巴卡亭III。德国Zocher实验室利用中空纤维膜生物反应器培养含10-去乙酰巴卡亭III??10??O??乙酰基转移酶重组基因的大肠杆菌,以10??去乙酰巴卡亭III为底物,发现1周可生产1.6~2.4g的巴卡亭III,相当于500mg#L#d的产量

[9-10]

-1

-1

[8]

1??红豆杉的人工栽培

目前,我国广大地区已广泛开展了东北红豆杉(TaxuscuspidataSieb.etZucc)、中国红豆杉(T.chinensis(Pilg.)Rehd)、南方红豆杉(T.chinensisvar.maireiChengetL.K.Fu)、西藏红豆杉(T.walli??chianaZucc.)和云南红豆杉(T.yunnanensisChengetL.K.Fu)的人工栽培,有的面积多达500~600hm)。我国产东北红豆杉、中国红豆杉、南方红豆杉、西藏红豆杉和云南红豆杉的枝叶中紫杉醇的含量比树皮中紫杉醇的含量至少低一个数量级,通常

仅为枝叶干质量的十万分之一左右;因此,红豆杉人工种植中,面临枝叶紫杉醇含量普遍偏低的问题。我国于1996年从国外引种了东北红豆杉和欧洲红豆杉的天然杂交种曼地亚红豆杉(T.

?mediaReh??

der)。曼地亚红豆杉的枝叶具有较高的紫杉醇含量。实际上,曼地亚红豆杉有数十个品系,其中,有一些品系如曼地亚红豆杉中的Taxus?mediaHicksii品系紫杉醇的含量稍高,可占枝叶干质量的万分之4左右,而其他一些品系的紫杉醇含量也不高,应该加以区分。目前,我国广大地区人工栽植的红豆杉良种化程度很低,只要是红豆杉苗就栽,不分是否是优良种苗,所以,制定我国红豆杉种苗的标准、选择2

。

另外一个趋势是利用红豆杉树皮和枝叶提取紫

杉醇时的副产品7??木糖??10??去乙酰紫杉醇。广西桂林市晖昂生化药业公司于2004年完成了7??木糖??10??去乙酰紫杉醇半合成紫杉醇的生产工艺的研究,达到了一次投含20%7??木糖??10??去乙酰紫杉醇料150kg,经过三步反应生产出了10kg紫杉醇的规模,这种技术已申请了专利

[11]

。以天然紫杉醇作对照,中

第3期邱德有等:木本药用植物红豆杉研究的新进展

-1

441

了化学结构、质量以及抗肿瘤活性的全面检测,结果证明是一致的,符合美国药典半合成紫杉醇的质量标准。2005年1月广西壮族自治区科技厅组织专家对该成果进行了鉴定,获得了很高的评价。

达到295mg#L,并发现在200L的生物反应器中,曼地亚红豆杉18批试验中紫杉醇的产量都表现得较稳定,产量保持在140mg#L到295mg#L

-1[13]

-1

-1

3??红豆杉细胞培养

植物细胞培养由于不受气候和土壤的限制,所以植物细胞培养技术在20世纪60年代就开始尝试作为生产植物有用次生代谢物质的工具。在20世纪80年代,日本的科学家利用植物细胞培养技术成功进行了紫草素和人参皂甙的工业化生产。自1989年Christen首次报道利用红豆杉细胞悬浮培养技术生产紫杉醇后,国内外学者进行了大量红豆杉愈伤组织培养和细胞悬浮培养的研究,研究的植物几乎包括短叶红豆杉、欧洲红豆杉、东北红豆杉、中国红豆杉、加拿大红豆杉(T.canadensisMarsh)、云南红豆杉和曼地亚红豆杉等主要的红豆杉,其中大部分已证实能够产生紫杉醇,但大多存在细胞易褐化、培养物生物量小,培养规模小、紫杉醇产率较低和生产稳定性差等问题,离紫杉醇工业化生产还有距离

[12]

之间,每天紫杉醇的产率为21.1mg#L。这是

目前唯一公开的对大规模生物反应器培养紫杉醇稳定性的报道。

我国在红豆杉细胞方面的研究也取得了一定的进展。早在1997年,甘烦远等

-1

[16]

发现云南红豆杉

-1

细胞在发酵罐中生长速率达到12g#L,紫杉醇含量为1.19g#kg,大约是成年树树皮含量的12倍,为栽培植株的40倍。近年来,广东梅雁生物工程研究所也进行了红豆杉细胞不锈钢生物反应器的

-1

中试,产量达到了100mg#L以上,该单位下一步的计划是进行大规模生物反应器培养试验。

虽然国际上已有少数几个公司已经开始利用大型生物反应器生产紫杉醇,但这些都是在投入巨额研发经费的条件下取得的。在生物反应器中,植物细胞比微生物生长慢,而且生产时需要有大型专用生物反应器,所以,生产成本将成为该技术工业化应用时必须认真考虑的问题,同时还急需解决大规模生物反应器培养时紫杉醇生产的稳定性难题

[17]

。在选择高产细胞系的同时,通过利用真菌诱

3+

。

导子、La、变温处理、乙烯抑制剂STS(silverthio??sulfate)和茉莉酸甲酯(MeJA)等因子或方法可以使培养细胞的紫杉醇产量得到提高,其中最有效的是MeJA

[12-14]

如果红豆杉培养细胞中紫杉醇产量的稳定性难题能够得到有效地解决,那么植物细胞培养技术生产紫杉醇将有可能成为一种具有竞争力的方法

[18]

。

。

早在1992年,美国ESCAgenetics公司在NCI主持的第2次紫杉醇研讨会上就宣布他们用细胞培养法所得产物紫杉醇含量为树皮的2~5倍。目前,国际上至少有2~3个公司开始利用大型生物反应器生产紫杉醇。一个是韩国的SamyangGenex公司(Taejon,Korea),1997年韩国就批准该公司利用红豆杉细胞生物反应器生产出的紫杉醇??Genexol上市。另一个公司是Phyton(NY,USA),该公司从1993年开始就与Bristol??MyersSquibb合作进行红豆杉细胞的研究,在2002年Phyton与Bristol??MyersSquibb签订了长期提供紫杉醇的合作协议。目前该公司最大的生物反应器已达75000L的规模。由于采用酶法半合成和利用红豆杉细胞生物反应器生产紫杉醇,Bristol??MyersSquibbU.S.在2004年因此获得了美国环境保护机构(EPA)颁发的总统绿色化学挑战奖

[15]

4??产紫杉醇内生真菌的培养

1993年,美国蒙太拿州立大学的Stierle等

[5]

从

太平洋红豆杉的韧皮部分离到1株产紫杉醇的内生真菌(Taxomycesandreanae),发现该菌的发酵液含紫杉醇24~50ng#L。随后,该实验室又从西藏红

豆杉枝条上分离到1株小孢拟盘多毛孢(Pestalotiop??sismicrospora),紫杉醇的产量比Taxomycesandreanae高很多,发酵液的紫杉醇含量高达60~70??g#L

-1[19]

-1

。随后人们在落叶松、松树Wollemianobili和

[20]

秃柏中分离出产紫杉醇的内生真菌#霍夫曼等

[21]

。特别值得

一提的是美国俄勒冈州波特兰大学的化学家安杰拉

发现榛子树的叶、枝和果实中均含有

紫杉醇,含量为红豆杉的10%,同时还发现生长在榛子树上的真菌也可产生紫杉醇。除红豆杉外,榛子树是第2种能产紫杉醇的植物,而且其内生真菌也能产紫杉醇。我国自1994年北京大学邱德有等

[22]

。第3个是日本的Mitsui化学公司,该公

司建立了红豆杉细胞大规模培养系统,他们利用二人首先从云南红豆杉的树皮中分离出可产紫

442

林??业??科??学??研??究第22卷

交通大学、天津大学和华中科技大学、中国中医科学院等单位先后进行了产紫杉醇内生真菌的分离和培养的工作。国内外已报道的产紫杉醇真菌种类已超过30种,这些真菌绝大多数是子囊菌或半知菌,而且大都是红豆杉内共生菌。产紫杉醇真菌的筛选除了采用形态学和化学的方法外,目前人们已开始用PCR进行有关菌株的快速筛选和鉴定

[23-24]

[20]

1????羟基化酶(图1F)、紫杉烷2????羟基化酶(图1G)、紫杉烷7????羟基化酶(图1H)、紫杉烷9????羟基化酶(图1I)、紫杉烷13????羟基化酶(图1J)、紫杉烷2????O??苯甲酰基转移酶(图1K)、紫杉烷10 ??O??乙酰基转移酶(图1L)、紫杉醇侧链N??苯甲酰基转移酶(图1M)、紫杉烷C??13??O??苯丙烷侧链乙酰CoA酰基转移酶(图1N)、 ??苯丙氨酸变位酶(图1O)、乙酰CoA连接酶(图1P)、 ??苯丙氨酸水解酶(图1Q)、9????羟基氧化酶(图1R)、4,20环氧化酶(图1S)、环氧乙烷环氧四环变位酶(图1T)。Croteau实验室已经完成了其中14个基因的克隆。2003年,该实验室又成功地克隆了处于包括紫杉醇在内的各种C??13氧取代的紫杉烷生物合成的分支途径中紫杉烷14 ??羟基化酶基因(14OH)(图1)

[29-30]

。

产紫杉醇的内生菌选育和发酵培养的研发尚未取得实质性进展,因为内生真菌每升培养物仅有微克级

紫杉醇,产量很低。紫杉醇真菌的筛选只是第1步,关键是提高真菌发酵时紫杉醇的产量。赵凯等

[25]

成功通过原生质体诱变技术提高了真菌中的紫杉醇

-1

产量,高达418??g#L。最近,他们通过genomeshuffling的方法,进一步提高了树状多节孢(Nodulis??poriumsylviform)F4??26紫杉醇的产量,达到516.37??g#L。尽管已经取得了很大的进展,但要实现工业化生产,还必须获得毫克级水平的紫杉醇产率。今后的研究重点应该是菌株的改造。至今还不清楚真菌中紫杉醇生物合成的途径,到目前,还没有一个真菌紫杉醇合成基因克隆的报道,开展真菌紫杉醇合成基因克隆甚至基因组学的研究工作很有必要。弄清紫杉醇生物合成和调控的分子机理等过程,是改造菌株的前提,它将使有目的地、精确地改造产紫杉醇真菌菌株成为可能。笔者正与美国俄勒冈州波特兰大学的化学系的安杰拉#霍夫曼拟合作开展产紫杉醇真菌分子生物学的研究工作。可以相信,随着有关研究工作的深入,利用产紫杉醇真菌进行大规模发酵生产这一重要药物将很可能成为现实。

-1[26]

。紫杉

醇的生物合成涉及20个基因,目前还没有找到有效的增产办法。和其它受多基因控制的化合物一样,通过操作紫杉醇生物合成途径中的单个基因或某些转录因子有望提高其产量。国内外不少实验正在进行这方面的研究,但还没有成功的报道。

作者认为对于紫杉醇生物合成调控而言,处在紫杉醇生物合成竞争的分支途径中的基因也很重要。因为除了可以通过促进紫杉醇合成途径中有关基因的表达,还可通过抑制其分支途径中有关基因的表达,甚至可以通过既促进合成途径中基因的表达,同时又能通过抑制其分支途径中基因的表达来实现有关目的。红豆杉植株中含有大量的C??14氧取代的紫杉烷,如TaxuyunnanineC[2??,5??,10 ,14 ??四乙酰氧基??4(20),11??紫杉二烯]及其类似物2??,5??,10 ??三乙酰氧基??14 ??(2???甲基??3???羟基)??丁酰氧基??4(20),11??紫杉二烯、2??,5??,10 ??三乙酰氧基??14 ??丙酰氧基??4(20),11??紫杉二烯和2??,5??,10 ??三乙酰氧基??14 ??(2???甲基)??丁酰氧基??紫杉二烯等。红豆杉离体培养的细胞在产生极少量的紫杉醇时,也产生大量C??14氧取代的紫杉烷,后者的总含量可达细胞干质量的3.4%,占红豆杉离体培养细胞所产生的紫杉烷总量的85%之多,而包括紫杉醇在内的各种C??13氧取代的紫杉烷占总量的

[31]

8.2%,其中,紫杉醇仅为1%。

体外酶促反应试验时,紫杉烷14 ??羟基化酶与负责紫杉醇合成的13 ??羟基化酶竞争共同的底物紫杉??4(20),11(12)??二烯??5??,10 ??二醇。Ketchum[32]

等发现添加茉莉酸甲酯后,红豆杉细胞中C??14氧取代的紫杉烷的总含量由5%减少到2%,而含C??

5??代谢工程的研究进展

5.1??红豆杉细胞紫杉醇代谢工程

培养细胞中紫杉醇的产量一般都不高,即使偶尔获得较高的产量也都存在着紫杉醇产量不稳定的

问题,所以要利用基因工程的方法对紫杉醇生物合成与分支途径中有关基因进行调控,以提高红豆杉培养细胞中紫杉醇产量及其稳定性就成为近年来红

[27-28]

豆杉细胞代谢工程研究的重点。至今,已确定红豆杉细胞从FPP和IPP开始到紫杉醇是由20个蛋白所催化完成的。它们分别是GGPP合成酶(图1A)、紫杉??4(5),11(12)??二烯合成酶(图1B)、紫杉烷5????羟基化酶(图1C)、紫杉烷5????O??乙酰基转移酶(图1D)、紫杉烷10 ??羟基化酶(图1E)、紫杉烷

第3期邱德有等:木本药用植物红豆杉研究

的新进展443