食品安全学

细菌内毒素的研究进展

摘 要：本文从细菌内毒素的化学组成、生物学活性、致病机理、内毒素的制备与检测及内毒素受体的作用等方面，对细菌内毒素的研究进展进行了综述，并对本领域的研究方向及前景进行了讨论。

关键词: 内毒素；生物学活性；致病机理；检测方法

内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖(LPS)成分， 是与细菌细胞壁牢固结合的一种大分子结构物质，只有在细菌死亡时、繁殖时或人工破坏时，才释放到细胞外，发挥其各种效应，细菌内毒素首先由Boivin等［1］1933年用三氯醋酸自鼠伤寒杆菌中提出，当时因其一般蛋白质反应呈阴性，而称之为脂多糖（LPS）。随后其他学者用不同方法从各种革兰氏阴性菌中提出与LPS相似的物质，该物质具有多种毒性反应，为区别于外毒素，而称之为内毒素。当机体受到创伤(包括手术)、烧伤、感染、和接受长期传统的肠外营养时，肠黏膜有可能发生通透性增高，导致细菌和内毒素移位。在某些情况下，细菌感染可能被控制，但内毒素仍可通过“漏”的肠黏膜，引起炎症的激活及细胞介质的释放，导致全身炎症反应综合征(SIRS)、多器官功能不全综合征(MODS)甚至多脏器功能衰竭(MOF)［2］。因此认为，革兰氏阴性菌释放的内毒素是造成革兰氏阴性菌感染的临床和实验室表现的原因。且革兰氏阴性菌血培养需要花费数天时间，因此细菌内毒素的测定对早期诊断病情比细菌移位更有意义。有研究结果表明，内毒素血症是临床上有用指标，预测革兰氏阴性菌败血症的阳性预测值为48%，而没有内毒素血症就可基本排除发生血症的可能，阴性预测值为99%［3］。

1 内毒素的化学组成

细菌内毒素是由LPS、蛋白质和磷脂组成的复合物，分子量约1×10～20×10道尔顿。内毒素与菌体细胞壁密切相连，其活性成份是LPS，而蛋白质和磷脂与内 1

毒素的活性无关。LPS为革兰氏阴性菌外膜中的脂多糖成分。它是由三部分组成：

(1)O-特异性侧链；(2)核心多糖；(3)类脂A。核心多糖相对稳定，同一菌属结构相同。内核部分含有庚糖和2-酮基-3-脱氧辛酸(KDO)两种特殊的糖类分子。它们在LPS结构中起着连结多糖与类脂的作用。其中类脂A是LPS活性不可缺少的部分，可视作LPS的“生物活性中心”，是抗原活性部位，保存着LPS的各种生物学活性[4]。在类脂A成分中，脂肪酸约占70%～80%，各种细菌类脂A的脂肪酸性质和排列不同。类脂A的生物学活性主要在于其以酯键相连的脂肪酸，若其被水解，类脂A或LPS即失去活性。类脂A具有免疫原性，注入动物全内可以产生相应抗体。基于对类脂A整个成份、结构、功能有了详细了解，80年代前后报道了合成类脂A，并将合成类脂A与天然类脂A的生物学活性作了比较，表明合成类脂A具有天然类脂A的某些活性，只是活力比天然类脂A低。

2 内毒素的生物学活性

细菌内毒素的生物学活性多种多样，尤其在机体内的表现，错综复杂，各单项活性之间常相互联系，相互促进或制约。在体内或特定的体外条件下，所表现的活性，有时为数种活性综合作用的结果。在不同的实验条件下，包括不同的机体、不同的内毒素制品、不同的剂量、不同的测试方法等，所得到的结果也不一致。现将其生物学活性总结如下：第一，内毒素具有致热性，可使人和动物发热，体温升高；第二，给动物注射内毒素，早期白细胞数量减少，后期白细胞数量明显增加；第三，内毒素可引起血小板粘附、聚集、触发凝血系统，导致弥漫性血管内凝血（DIC）。具有激活凝血系统作用。

3 内毒素的病理生理作用机制

内毒素(endotoxin，ET)主要通过刺激单核细胞和巨噬细胞，使其产生白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)、巨噬细胞炎症蛋白-1(MIP-

1)、白细胞致热源(LP)和睫状体促神经因子(CNTF)等细胞因子而致病。LPS所引起炎症反应的病理作用分系统和细胞两个方面。在系统方面，LPS导致凝血系统活化，纤维蛋白形成增加，纤维蛋白降解减少。凝血系统出现的这些改变造成临床患者发生弥漫性血管内凝血(DIC)。在细胞方面，LPS可刺激一些效应细胞产 2

生活性因子，尤其是LPS刺激单核细胞巨细胞和内皮细胞产生多种促炎症细胞因子，如N17-n、11-IB。受LPS刺激细胞产生的细胞因子，迅速活化不同组织器官的细胞，导致机体代谢、激素水平和神经内分泌的改变，进而造成细胞功能的异常和不同器官的进行性衰竭。研究证明，内毒素所引起的各种生物学效应是通过与靶细胞作用而诱导这些细胞产生一系列炎症介质和细胞因子表现出来的，并非内毒素本身的效应。这些靶细胞包括单核-巨噬细胞、B淋巴细胞、粒细胞、血小板、成纤维细胞和内皮细胞等。内毒素诱导产生的炎症介质和细胞因子有C3a、C5a、内啡呔、凝血因子、PAF、TNF、IL-1、IL-6、IL-8、IFN等。LPS是目前所知诱导IL-1和TNF 最重要的因素［5］。内毒素诱导细胞因子的合成与分泌。已经证明动物细胞上有类脂A受体的存在，LPS与靶细胞的结合依赖于靶细胞的LPS结合蛋白(LBP)和CD14。LPS和LBP形成LPS-LBP复合物后，再与CD14结合，诱导胞膜及胞浆内蛋白磷酸化，然后启动细胞因子基因表达，产生细胞因子。过敏性毒素内毒素在激活补体活化过程中产生过敏性毒素C3a 、C5a，二者均可使肥大细胞或嗜碱性细胞产生组织胺，引起血管扩张，增加毛细血管的通透性，使平滑肌收缩和支气管痉挛等。TNF和IL-1作用相似，均为内源性致热原，可导致发热

[6]，促进白细胞渗出，破坏血凝-抗血凝平衡，抑制抗凝血机制，导致血栓形成等。内毒素诱导靶细胞产生细胞因子，一方面可激活机体局部和整体的免疫系统参与清除细菌感染；另一方面如果细胞感染严重，大量细菌在血中繁殖，使循环血中堆积大量内毒素，产生大量细胞因子，则可能导致内毒素性休克。

4 细菌内毒素受体

近年来有关内毒素受体的研究报道的非常多，已发现了4类分子家族与LPS脂质A部分结合参与炎症信号转导，包括CD14、脂多糖结构蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)、Toll样受体(Toll-Like Receptors，TLRs)、清道夫受体、T和β2白细胞整合素(CD11a/CD18，CD11b/CD18，CD11c/CD18等)。目前有关β2白细胞整合素的文献报道较多，现重点对前四者的研究进展进行阐述。

4.1 CD14（分化抗原14）

CD14是最早确认的LPS受体。1985年有人用单克隆抗体发现了单核细胞表 3

面、髓样细胞(myeloid cell)培养上清液和正常人血浆中一种55ku的蛋白质，后来这种蛋白质在国际白细胞抗原研讨会(international worksphos on leukocyte antigens)上被命名为CD14，成为髓样细胞分化抗原中的一员。动物体内有两种形式的CD14，一种是膜结合形式(mCD14)，主要分布于髓样细胞表面，并作为这类细胞分化的标志，mCD14通过糖基磷脂酰肌醇锚定在细胞膜上[7]，相对分子质量约为5×104～515×104；另一种是可溶性形式(sCD14)，主要存在于血清中，介导非髓样细胞的激活，相对分子质量约为418×104～516×104。sCD14主要来自髓样细胞表面mCD14的脱落，或由髓样细胞合成后分泌[8]。LPS入侵机体后首先由单核细胞对它产生识别与应答作用，产生一系列细胞因子：肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)等。而在这个过程中CD14起主要的介导作用，CD14可以帮助LPS结合于单核细胞，实现机体识别LPS的第一步。研究发现，阻断LPS与CD14的结合可抑制LPS对单核细胞、中性粒细胞的刺激作用。将CD14基因转入大鼠未成熟B细胞后，此细胞对LPS的敏感性提高1000倍。更直接的实验发现，利用125I标记的LPS可以直接结合于细胞表面。利用ELISA法证实了sCD14能够直接与LPS结合。从而可以推断，CD14其生物学功能主要是识别、结合LPS或LPS/LBP复合物，介导LPS所致的细胞反应，在LPS性炎症反应、内毒素休克等病理反应中起着作用。若能够完全封闭CD14的功能，特异性的阻断CD14与LPS及LPS/LBP复合物结合，就能够防止或中止LPS性炎症反应、内毒素休克等病理反应的发生，对于临床治疗内毒素血症、内毒素休克等将会有重要意义[9]。许多资料显示，mCD14是细胞表面被低剂量LPS激发炎症反应的关键受体(大剂量LPS刺激不依赖于mCD14)。LPS可通过3种方式与CD14结合，包括完整细菌细胞壁上的LPS、聚集的LPS分子团以及LPS单体。然而，LPS被CD14识别并不是直接的，它需要脂多糖结合蛋白(LBP)催化。科学家还研究发现sCD14可以介导LPS对缺乏CD14的单核细胞PNH细胞具有刺激作用。由此可见，虽然机体只有少数几种细胞可以表达CD14，但是sCD14可以介导其他CD14阴性细胞(血管内皮细胞、上皮细胞)对LPS产生应答作用，参与LPS在体内的信号转导，激活机体的免疫系统，当前大量的研究都集中在免疫细胞对LPS的信号转导作用，但是对其他非免疫细胞的研究还不够充分，有待更深入的研究。

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4.2 Toll样受体(Toll-Like Receptors，TLRs)

近年来信号受体Toll的发现为LPS受体的研究找到了突破点。目前发现的TLR成员有12种，主要分布于一些免疫器官，例如脾脏和胸腺等。参与LPS信号跨膜传递的TLR主要有TLR2、TLR4和TLR5。Toll与其配体Spatzle结合而被激活，可引起胞浆内的转录因子dorsal的抑制因子cactus的降解、分离，从而dorsal被激活而启动机体的免疫防御反应。由于它对于机体免疫系统的重要性，对Toll信号受体的研究有可能明确革兰氏阴性菌感染的机制，从而为此类疾病的治疗带来有效的手段。

由于Toll的LRR区域具有识别蛋白、肽、碳氢化合物等的功能，Toll极有可能是LPS的识别受体，将刺激信号传入胞内。Toll样受体的胞内段含Toll同源结构域(Toll-Homolgy domain，TH do-main)，TH结构域与IL-1R胞浆结构具有高度的同源性，又将TH结构域称为Toll/IL-1R(TIR)同源区，这是TLRs和IL-1R向下游传导信号的核心元件。几乎所有的Toll均参与天然免疫反应，但它们的天然配体还不清楚，目前对TLRs研究得较多的是TLR2和TLR4。尽管革兰氏阴性菌各种成分相差很大，但LPS为革兰氏阴性菌胞壁所共有，它包括相同脂质A和具种间差异的多糖成分，Toll受体仅识别脂质A，这样机体就能识别整个革兰氏阴性菌病原菌，科学家将存在于胞壁为大多数微生物所共有的一类分子称为病原相关分子物质结构(pathogen-associatedmolecular patterns，PAMPs)，Toll受体所识别的结构正是PAMPs。人Toll与果蝇Toll蛋白的同源性以及在免疫防御反应中起重要作用，可以看出Toll受体进化的保守性，它是维持生命不可缺少的成分［10］。

5 内毒素抗体的保护作用

内毒素具有较强的免疫原性，只需几十至数百微克即能明显诱导小鼠及家兔产生抗内毒素抗体。大多数科学家认为，这种结合能够阻断内毒素诱导靶细胞或组织释放炎症介质和细胞因子，起中和内毒素的毒性和促进网状内皮细胞系统吞噬清除的功能。临床研究表明，抗CGL血清或免疫球蛋白具有明显的防治革兰氏阴性菌感染性休克和减少死亡率的作用。近十年来，应用单克隆抗体技术制备的抗CGL抗体，克服了以上诸多缺点，临床上应用也是安全有效的，具广阔的 5