人脐静脉内皮细胞培养方法的改进

现代预防医学2013年第40卷第24期ModernPreventiveMedicine，2013，Vol.40，NO.24·4529·

Á·实验技术及其应用·

人脐静脉内皮细胞培养方法的改进

林敏华，陈子春，林宇涵，许双临，富显果

福建中医药大学附属宁德市医院，福建宁德352100

摘要：目的

法建立高效、可靠、经济的人脐静脉内皮细胞原代培养方法，为体外研究血管内皮细胞提供实验手段。方取健康剖腹产新生婴儿脐带，立即用0.1％Ⅰ型胶原酶室温消化，得血管内皮细胞，置于5%CO2、37℃培养箱进行原代培养，培养基采用M199培养基，含有10%胎牛血清、2mmol／L谷氨酰胺、50μg／ml肝素钠、10u／mlbFGF（贝复济，牛碱性成纤维细胞生长因子，basicfibroblastgrowthfactor）、100u／ml青霉素、50u／ml庆大霉素。在倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态特点，同时用免疫组织化学的方法对所得细胞进行鉴定。结果采用0.1％Ⅰ型胶原酶灌注法及改良培养基获得了相当数量的人脐静脉内皮细胞。光镜下观察见大量3～4个成团的内皮细胞。细胞接种后4h开始贴壁生长，5d左右可融合成片，原代细胞呈小三角形、圆形或梭形，细胞分布不均匀，成簇生长，互不重叠；传代细胞多为扁平多角形铺路石状镶嵌排列，3d左右可融合成片。免疫组化可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。结论Ⅰ型胶原酶灌注法是获得脐静脉内皮细胞的一种可取方法，成功率高，可靠性大。改良培养基能很好地促进内皮细胞体外培养及传代扩增，可成功构建体外研究血管内皮细胞的模型。

关键词：人脐静脉内皮细胞；鉴定；细胞培养

中图分类号：R329-33文献标志码：A文章编号：1003-8507（2013）24-4529-05

ÁÂAnimprovedculturemethodforhumanumbilicalveinendothelialcells

LINMin-hua，CHENZi-chun，LINYu-han，XUShuang-lin，FUXian-guo.

NingdeCityHospital，FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine，Ningde，Fujian352100，China

Abstract：OBJECTIVEThestudyaimedtoestablishanefficient，reliable，andeconomicalmethodforculturingprimaryhumanumbilicalveinendothelialcells（HUVECs），sotoprovideanexperimentalapproachforinvitrostudiesonvascularendothelialcells.METHODSUmbilicalcordsofhealthyC-sectionednewborninfantswereremovedanddigestedwith0.1%collagenaseIatroomtemperaturetoobtainvascularendothelialcells.Thecellswereincubatedunder5%CO2at37℃andprimary-culturedinM199culturemediumcontaining10%fetalbovineserum，2mmol／Lofglutamine，50μg／mlofheparinsodium，10u／mlbofFGF（basicfibroblastgrowthfactor），100μ／mlofpenicillin，and50μ／mlgentamicin.Morphologicalfeaturesoftheprimaryandpassagedcellswereobservedunderaninvertedmicroscope，andwereidentifiedbyimmunohisto-chemicalmethods.RESULTSAconsiderableamountofHUVECswereobtainedbyperfusionwith0.1%http://wendang.chazidian.comrgeamountofcellclusterscomprisedof3-4endothelialcellswereobservedunderanopticalmicroscope.Thecellsbegantoadheretothebottomoftheflasks4hafterseedingandreachedconfluencyonaroundday5.Theprimarycellsweresmalltriangular，round，orspindleinshape，distributedunevenly，andgrewinnon-over-lappedclusters.Ontheotherhand，thepassagedcellswerearrangedinaflatandpolygonalpavingstone-likepattern，andthecellscouldreachconfluencyinabout3days.ImmunohistochemicalanalysisrevealedthatcytoplasmoftheendothelialcellscontainedhumanfactorVIIIrelated-antigens.CONCLUSIONCollagenaseIperfusionisafeasiblemethodforobtainingHU-VECs；itishighinsuccessrateandreliability.Theimprovedmediumisusefulinpromotingculturingofendothelialcellsinvitroandproliferationofpassagedcells，andhasdemonstratedtosuccessfullyestablishinvitromodelsforstudiesonvascularendothelialcells.

Keywords：Humanumbilicalveinendothelialcells（HUVECs）；Identification；Cellculture

糖尿病血管病变（Diabeticvasculopathy）是常

基金项目：福建省卫生厅青年科研课题（2011-1-45）；宁德市科学

技术计划项目（20110008），细胞分子生物学实验室（一

级）

作者简介：林敏华（1979-），女，本科，主管药师，研究方向：临

床药学

通讯作者：陈子春，E-mail：chenzichun@http://wendang.chazidian.com见的糖尿病并发症之一，也是导致糖尿病病人死亡的主要原因之一，多种因素参与了这一病理过程，其中血管内皮细胞功能紊乱是主要的发病机制［1，2］。因此，建立血管内皮细胞模型，研究内皮细胞功能变化与糖尿病血管病变的关系以及药物对血管内皮细胞的保护作用机制等都具有十分重要的意义。体外内皮细胞模型的成功建立依赖于血管内皮细胞的

·

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获取，人脐静脉作为内皮细胞的来源，在人内皮细胞的研究中被普遍采用，其具有取材容易、来源较充足以及操作简便的特点［3］。目前关于人脐静脉内皮细胞分离培养方法的报道较多，但原代的体外培养影响因素较多，基于研究者们大量的培养经验，本实验通过不断的摸索，应用Ⅰ型胶原酶灌注法，采用含有10%胎牛血清、2mmol／L谷氨酰胺、50

胞生长需要，而后每隔48h换液1次，至细胞生长融合为止。

1.2.2人脐静脉内皮细胞的传代培养细胞生长融

合至80%以上时，弃去培养基，PBS洗2次，以0.25％胰蛋白酶／EDTA600μl消化30～60s，倒置显微镜下观察，当细胞回缩变圆，弃去消化液，以

μg／ml肝素钠、10u／mlbFGF、100u／ml青霉素、50u／ml庆大霉素的M199培养基，取得了良好效果，

结果报道如下。

M199完全培养基6～9ml终止消化，采用巴氏吸管吹打，制成细胞悬液，将细胞悬液以1︰2或1︰3比例接种于培养瓶中，并置于5%CO2、37℃培养箱中培养。传代后24h更换培养基，以消除胰蛋白酶

对细胞的影响，并保持培养基中各成份浓度，其后每隔48h换液1次直至细胞生长融合。1.2.3人脐静脉内皮细胞的鉴定

1材料与方法材料

标本来源与采集

标本均来自宁德市医院产

1.11.1.1

科健康（血糖值在正常范围内，HBsAg检测阴性）足月剖腹产孕妇的脐带组织。无菌条件下剪去新生儿脐带（15～20cm），装入无菌采集瓶（4℃高压灭菌的PBS溶液）中后快速移入实验室，并行脐静脉内皮细胞分离培养。

1.2.3.11.2.3.2

光镜形态学观察在倒置显微镜下，观察

原代细胞及传代细胞形态及生长特征，并摄片保存。以SP免疫组化

染色试剂盒及DAB显色试剂盒说明书为标准进行免疫细胞化学检测。使用6孔板，将生长状态良好的

免疫细胞化学染色法鉴定

第3代人脐静脉内皮细胞消化后按2×105／皿接种于盖玻片，实验设立实验组及阴性对照组，并设立复孔。待细胞长至70%融合，去培养基，PBS清洗3次；4%多聚甲醛室温固定10min，PBS清洗3次，每次3min；预冷的0.3%Triton-1004℃透膜15min，PBS清洗（同上）；0.3%H2O2室温孵育10min以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS清洗（同上）。滴加非免疫血清室温封闭10min，弃去，实验组滴加兔抗人第八因子相关抗原免疫组化多克隆抗体，阴性对照组用PBS替代，放入湿盒内。湿盒保持4℃过夜，次日取出，室温平衡30min，PBS清洗

M199培养基、Ⅰ型胶原酶、胎牛血

清、0.25%胰蛋白酶／EDTA购自美国gibco公司；肝素钠购自南京新百药业有限公司；bFGF（贝复济，牛碱性成纤维细胞生长因子，basicfibroblastgrowthfactor）购自珠海亿胜生物制药有限公司；兔抗人第

试剂

八因子相关抗原免疫组化多克隆抗体购自福州迈新生物技术开发公司。

1.1.2

1.1.3仪器BCM-1000型生物净化工作台、OLYMPUSIX71倒置式研究型显微镜、BB15二氧化碳培养箱、YX280B手提式不锈钢消毒器、TD3台式低速离心机、ImprovedNeubauer细胞计数板。1.2方法

1.2.1人脐静脉内皮细胞的原代分离培养采用Jaffe［4］等人的方法加以改进。取健康足月剖腹产孕妇的脐带15～20cm，用灌胃针插入脐静脉，两把止血钳一左一右固定制成支架，以PBS溶液（高压灭菌）冲洗脐静脉腔2～3次，洗至流出液清亮无色。将37℃预温的Ⅰ型胶原酶（0.1％）约13ml注入脐静

脉腔，至下端酶溶液流出，止血钳夹闭下端静脉，室温（20℃～25℃）消化20min，其间反复抽吸2～3次。放开下端的止血钳，收集含有内皮细胞的胶原酶，再以PBS溶液30ml冲洗管腔，消化液与冲洗液并入离心管，1000r／min离心10min，弃上清液后收集细胞，加入含有10%胎牛血清、2mmol／L谷氨酰胺、50μg／ml肝素钠、10u／mlbFGF、100U／

3次（5min／次），除去未结合的一抗；滴加生物素化山羊抗家兔IgG，湿盒室温孵育20min，PBS清洗（同上）；滴加试剂SABC室温20min，PBS清洗（同上）。DAB底物混合工作液显色，显微镜下观察

出现特异性染色后终止显色，双蒸水清洗；苏木素轻度复染5～10min，显微镜下观察并摄片。

1.2.4生长曲线取原代细胞及生长状态良好的第

3代人脐静脉内皮细胞消化后按1×104／皿计数种于24孔板，每24h取3孔分别计数，连续7d，描绘

细胞生长曲线。

22.1

结果

原代细胞

人脐静脉内皮细胞光镜形态学观察

接种后4h开始贴壁生长，24h贴壁率可达85%以上，5d左右可融合成片。倒置显微镜下观察初期细胞呈小三角形、圆形或梭形，细胞分布不均匀，成簇生长，簇中央细胞呈鱼贯状排列，外围细胞伸出伪足（见图1）。此后逐渐生长成单层，互不重叠，而是互相填补空隙，呈内皮细胞的典型生长特征（见图2）。

ml青霉素、50u／ml庆大霉素的M199培养基充分混

合，制成细胞悬液。将细胞移入一次性培养瓶中，显微镜下观察见大量3～4个成团的内皮细胞，置于5%CO2、37℃培养箱培养24h更换培养液，以除去未贴壁的细胞，并保持培养基中各成份浓度满足细

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85％，此后开始缓慢生长，72h生长速度加快，维持在对数生长期，120h起细胞发生接触抑制，进入停滞期。传代细胞接种后24h贴壁率达93%，此后快速生长，48h起达对数生长期，生长速度明显快于原代细胞，72h后细胞稳定生长呈平台（见图6），符合内皮细胞生长特点

。

图1人脐静脉内皮细胞原代培养（24h）（100X

）

图4Ⅷ因子抗体直接免疫标记法鉴定原代HUVECs（400X

）

图2融合成片的人脐静脉内皮细胞（3d）（100X）

传代细胞接种后1h开始贴壁生长，3d左右可融合成片。倒置显微镜下观察细胞分布均匀，多为扁平多角形铺路石状镶嵌排列，边界清楚，胞浆丰富，细胞核圆形或椭圆形，偶见双核。图片上浮起来的几个圆球，是刚刚分裂增殖出来的新生内皮细胞（见图3

）。

图5

细胞鉴定阴性（400X

）

图3传代-第3代细胞（100X）

2.2人脐静脉内皮细胞免疫细胞化学染色法鉴定

实验组加入兔抗人Ⅷ因子抗体、过氧化物酶标记的山羊抗家兔IgG，DAB显色反应后，倒置显微镜下见细胞胞浆棕黄色颗粒，可见胞核外形，呈阳性反应（见图4），而对照组内未见着色，呈阴性反应（见图5）。由此证实培养的细胞为内皮细胞。

图6人脐静脉内皮细胞生长曲线

3讨论

血管内皮细胞功能的研究对糖尿病血管病变机制以及药物对血管内皮细胞的保护作用机制具有重要的意义。原代细胞离体时间短，最接近和反映体

2.3生长曲线原代细胞接种后24h贴壁率达

·

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内生长特性，适合进行药物测试，细胞分化等研究。

1973年，Jaffe等［4］首次从人脐静脉中分离出血管内

皮细胞并在体外培养成功，同时提出内皮细胞的鉴定标准，至今已被多次引用。目前关于人脐静脉内皮细胞培养方法的报道较多，但是原代的体外培养影响因素较多，其中任何一个环节的问题都可能导致细胞不易贴壁而失败。通过不断的摸索，本实验建立并改良了一套高效、可靠、经济的原代培养方法，总结经验如下。

贵。本实验采用含有10%胎牛血清、2mmol／L谷氨酰胺、50μg／ml肝素钠、10u／mlbFGF、100u／ml青霉素、50u／ml庆大霉素的M199培养基。bFGF是一种多效能的细胞生长因子，可促进细胞分裂增殖，增强有丝分裂活性，能使内皮细胞在体外传代次数明显增加，而肝素可以稳定生长因子，增强生长因子对内皮细胞的增殖作用［10］。多次实验证明使用经改良的M199培养基，原代培养的人脐静脉内皮细胞形态较好，细胞传代后贴壁好，生长快。培养基pH值也是细胞培养成败的决定性因素，培养基最适pH值为7.0～7.2，脐静脉内皮细胞耐酶不耐碱，pH值为7.4时贴壁困难，pH值7.6以上贴壁细胞脱落受损失去活力，因此，培养基配制后应于2周内用完以保证pH值稳定。

3.1污染是细胞培养中的重要问题在细胞培养过

程中，要严格无菌操作，特别是要保证储存脐带的容器无菌。本实验选用剖腹产婴儿脐带，有效防止培养前污染。

3.2脐带要新鲜脐带离体后随着时间延长，细胞

活性逐渐下降。Jaffe［4］等强调脐带保存时间不得超过3h。有研究表明［5］脐带离体3h内内皮细胞存活率为90%，而离体24h后仅有50%存活率。王建明［6］等人的研究表明，离体脐带内皮细胞某些物质的含量会随时间延长而发生变化，内皮细胞Ⅷ子相关抗原、前列环素在6～12h呈下降趋势。本实验取用离体脐带后立即行脐静脉内皮细胞的分离培养，24h贴壁率可达85%以上。

3.6常用鉴定方法目前鉴定人脐静脉内皮细胞常

用的方法有细胞形态的观察、电镜检查内皮细胞的

W-P小体以及免疫荧光检测细胞内的Ⅷ因子相关抗原［11］，但并非每个细胞都能观察Weible-Palade小

体，而且电镜标本制作较困难。因此，最为可靠且便于实施的标准是Ⅷ因子相关抗原染色，Ⅷ因子除内皮细胞外，仅在血小板和巨噬细胞中存在，可利用此原则鉴别血管平滑肌细胞和成纤维细胞［12］。

总之，本实验在总结失败经验的基础上，通过不断的摸索，证实Ⅰ型胶原酶室温（20℃～25℃）20min灌注法是获得脐静脉内皮细胞的一种可取方法，成功率高，可靠性大。经改良的含10%胎牛血清、2mmol／L谷氨酰胺、50μg／ml肝素钠10u／mlbFGF、

3.3消化酶的选择是影响分离效果的决定性因素

较多研究采用胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶消化法。而Ⅱ型胶原酶价格昂贵，本实验试过

0.25%胰蛋白酶消化9min及0.1%Ⅰ型胶原酶消化20min，结果发现胰蛋白酶消化效果不理想，虽能

消化大量细胞，但细胞贴壁率极低，不易成活，且易混入成纤维细胞及平滑肌细胞；而Ⅰ型胶原酶消化过程中不易损伤内皮细胞，细胞量较多，结构较为完整，且细胞成团生长，容易存活。

100u／ml青霉素、50u／ml庆大霉素的M199培养基

能很好地促进内皮细胞体外培养及传代扩增，可成功构建体外研究血管内皮细胞的模型。

参考文献

［1］AvogaroA，FadiniGP，GalloA，etal.Endothelialdysfunction

3.4掌握胶原酶最佳消化时间、条件，是保证实验

胶原酶灌注方法要得当，既要保

成功的关键之一

证静脉充盈，又要防止胶原酶外漏。大部分研究表明脐带应不少于20cm，37℃消化12～15min。本实验采用15～20cm的脐带即可获得大量内皮细胞，灌注Ⅰ型胶原酶13ml，室温（20℃～25℃）消化20min为最适条件，能够保证脐静脉充分充盈且不外漏，虽消化时间延长，但脐带无需移出生物净化操作台，可减少污染机会。

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3.5培养基成分及pH值是必须注意的关键环节

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人脐静脉内皮细胞是一种低增殖能力的细胞，对营养成分要求较高，内皮细胞的天然培养基是血清，高质量的胎牛血清对人脐静脉血管内皮细胞的生长有良好的促进作用。有文献采用20%胎牛血清，但也有文献报道［9］血清浓度较高，细胞容易老化，

［7］

［8］

传代的代次较少，不利于后续实验开展。血管内皮生长因子能专一性的促进内皮细胞增殖，但价格昂

15.

现代预防医学2013年第40卷第24期ModernPreventiveMedicine，2013，Vol.40，NO.24·

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收稿日期：2012-10-18

（上接第4526页）

重，说明干预工作还很不到位。健康指导工具对居民健康行为的建立具有不可忽视的作用，应加大政府投入，整合社会资源，将健康生活指导市场化，满足提高居民健康生活指导工具需求，加强居民具体技能指导，提高其采用率。同时，要广结社会团体、企事业联盟，同心协作，发挥各自优势，开展形式多样的全民健康生活方式示范创建活动，营造健康生活氛围，加大身体活动支持性环境建设，提高居民主动锻炼、满足身体活动水平比率。

志谢

河南省18个省辖市级和43个调查县（区）级的行动负责人，

参考文献

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北京：中国协和医科大学出版社，2005．

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［3］河南省疾病预防控制中心.《河南省全民健康生活方式行动工

作效果评估方案》的通知［EB／OL］.http：／／http://wendang.chazidian.com：

8002／jkzxoa／default.jsp．

［4］河南省卫生厅.《河南省卫生厅关于开展河南省全民健康生活

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［5］卫生部疾病预防控制局，中国疾病预防控制中心．健康生活方

式核心信息［M］．北京：人民卫生出版社，2011．

收稿日期：2012-09-30

以及所有参加该项工作的同仁

（上接第4528页）

收入来衡量。尽管这个评价方法为业内人士所诟病———因为衡量一个医院的效益，应该从人民群众的健康水平出发，而不是收益多少。而新的健康量化评价除了对个体健康状态评价，也可以进行医疗效益的评价。

从本研究创立的健康量化评价方法的灵敏度和特异度等指标可以看出，该方法的诊断方法简单实用、快捷，只需普通的血液分析仪及生化分析仪即可使用。而且该评价方检验步骤仅仅是在原检验的方法上进行数学分析，就可大致将病人的身体状况数据化，对其健康水平进行量化统计并做出健康状态的评估，不增加任何检测成本，易于被医院和患者接受。对机体健康状态进行量化评价，可以给临床医生和保健医生提供更加直观的指标，如营养不良指数、中毒指数和血液分布指数等，为制定正确的临床治疗方案和保健方案提供更加直接的指导。因此，本研究建立的健康量化评价方法可对健康状态进行量化评价和直接评价临床方案和保健方案的效果，也可作为今后医院检验科和体检机构进行其

他检测项目开展的依据，降低检测成本，提高其他检测项目实施的科学性，减少其他检验项目实施的盲目性，有着较好的经济效益，具备一定的临床应用前景。

参考文献

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收稿日期：2012-08-11