病毒抑制剂对蝴蝶兰病毒植株的脱毒效果_李正民

第4卷第1期2013年3月热带生物学报JOUＲNALOFTＲOPICALBIOLOGYVol．4No．1

Mar.2013

文章编号：1674－7054（2013）01－0056－05

病毒抑制剂对蝴蝶兰病毒植株的脱毒效果

12李正民，王安石，王1健，陶楚1

（1．海南大学园艺园林学院，海南海口5702282．海南出入境检验检疫局热带植物隔离检疫中心，海南海口570311）

摘要：选取感染建兰花叶病毒（CyMV）和齿兰环斑病毒（OＲSV）的蝴蝶兰植株进行离体培养，在芽增殖培

养基中添加不同的病毒抑制剂，研究对CyMV和OＲSV病毒的脱除效果。结果表明，氨基寡糖素具有很好的

对CyMV的脱除率为83．33%，对OＲSV的脱除率为66．67%；病毒唑次之，对CyMV的脱除率为脱毒效果，

83．33%，对OＲSV的脱除率为50%；中药类的脱毒效果不明显。

关键词：蝴蝶兰；脱毒；CyMV；OＲSV

+中图分类号：Q949．718．43文献标志码：A

蝴蝶兰（Phalaenopsisspp．）属热带或亚热带的气生兰，又称蝶兰，因其株型美观，花形奇特，色彩艳丽，

［1］“兰花皇后”花期长久，素有之美称，在国际花卉市场上有很高的经济价值。蝴蝶兰的病毒病是当今困

在蝴蝶兰上分离到的病毒超过25种，其中危害最重、分布最广的是建兰花叶扰兰界的一大难题。目前，

CyMV）和齿兰环斑病毒（Odontoglossumringspotvirus，OＲSV）［2］。病毒可通病毒（Cymbidiummosaicvirus，

过日常管理操作中的机械性伤口进行传播，感病兰株表现出花叶、坏死、畸形、花瓣变形等症状，严重影响其观赏价值和经济价值

病毒抑制剂及剂量。［3－4］。针对以上病状，笔者对11种病毒抑制剂进行了筛选，旨在寻找最佳的兰花

1

1．1材料与方法材料

1．1．1病毒检测样品的制备实验在海南省文昌市动植物隔离检疫农场进行，先从蝴蝶兰温室采集带

“满天红”），有疑似CyMV和OＲSV症状的蝴蝶兰成株（Dtps．QueenBeer“ＲedSky”选择经检测确认感毒

兰株作为病源母株，经低温催花使其萌发出花梗。待花梗长到一定程度，切取腋芽作为外植体进行离体培养，待增殖芽达到一定数量后，抽查10%的增殖芽进行检测，并确认携带病毒后，再将芽接种到添加了不同病毒抑制剂的增殖培养基中。

1．1．2病毒抑制剂供试的病毒抑制剂共11种，分三大类：1）中药类：连翘、黄芪、金银花、紫苏叶、黄

贯众、五味子、甘草，均购于当地广安堂药品店；2）农药类：w=0．5%的氨毒胜·氨基寡糖素，山东禾宜连、

w=20%的吗胍·乙酸铜，成都科利隆生化有限公司制；3）病毒唑。生物科技有限公司制，

1．2方法

1．2．1处理方法－1－1－1－1以花宝1号3g·L+BA5．0mg·L+NAA0．5mg·L+蔗糖20g·L+卡拉

－1pH5．8为蝴蝶兰增殖培养基。中药类设4个质量浓度：3，6，9，12g·L－1，胶9g·L，用传统的煎熬法来

所得液体当做溶剂加入培养基中。农药类用量范围参考产品介绍，氨毒胜用量为：0．1，提取中药成分，

0．3，0．5，1．0，2．0mL·L－1；乙酸铜设5个质量浓度：1，2，3，4，5g·L－1。病毒唑设5个质量浓度：5，10，

收稿日期：

基金项目：

作者简介：

通信作者：2012－12－28“蝴蝶兰脱毒苗工厂化繁育技术研究”（2010YD59）三亚市院地合作项目李正民（1988－），男，山东泰安人，海南大学园艺园林学院2010级硕士研究生．mail：wjyym@yahoo．com．cn王健（1967－），男，海南大学教授．E-

第1期李正民等：病毒抑制剂对蝴蝶兰病毒植株的脱毒效果5715，20，30mg·L－1。为方便统计，用符号T1～T5表示各病毒抑制剂浓度由低到高的处理，但中药类处理无T5。另外，设不添加组做CK，共计48个小组，每组各配1L培养基，接种20组培袋，每袋3个芽。培养60d后，统计其生长状况。在相同病毒抑制剂添加物中，选择添加浓度高、长势较好的处理组，抽查其中6袋进行病毒检测。

1．2．2病毒检验方法CyMV和OＲSV检测用ADGENPhytodiagnostics公司相对应病毒的SPOT√CHECKLFTM（2min快速检测试纸条），其工作原理是以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔膜的毛细管作用，样品在膜上从一端向另一端的渗透移动过程中发生相应的抗原抗体反应，并通过颜色显示出来。

培养环境培养温度为（25±2）℃，光照强度1500～2000lx，每天光照12h。1．3

2

2．1结果与分析不同病毒抑制剂对蝴蝶兰增殖芽成活率和长势的影响表1中可以看出，中药类处理的增殖芽成活率与质量浓度无明显相关性，各处理均表现良好，成活率均在80%以上；乙酸铜处理的增殖芽，随着质

－1其成活率降低，当质量浓度达到5g·L时（T5），成活率为0；氨毒胜的增殖芽，除T5处理量浓度的升高，

（2．0mL·L－1）的成活率达不到80%外，其余处理的成活率均超过90%，长势好，有增殖现象；除CK外，病毒唑处理的增殖芽成活率最高，长势良好，增殖生叶现象明显。在观察中还发现，与CK组比，其余处理都存在随药物浓度升高新生叶片发黄的现象，这可能与药物浓度过高，影响生物膜的平衡有关。乙酸铜处理的增殖芽，叶片较其他处理更显灰暗，有些叶片带有猩红色斑，这可能与铜浓度过高有关。根据各处

－1－1理的表现，以有较高成活率为基本原则，选择中药类T4（12g·L）、氨毒胜T4（1．0mL·L）、乙酸铜

－1T3（3g·L－1）、病毒唑T5（30mg·L）和CK组处理的增殖芽进行病毒检测试验（见表2）。

表1不同病毒抑制剂对增殖芽成活率和长势的影响

Tab．1Growthofproliferationbudsundervarioustreatments

抑制剂

Virusinhibitors成活率Survivalrate/%T1T2T3

90T495T5—生长描述Descriptionofgrowth整体长势好，有增殖现象，浓度升高，新叶叶色变淡Budsgrewwell，tendedtoproliferate；newleavesturnedpale

withincreasingconcentration

长势好，有增殖现象，新叶健康正常，浓度升高后，长势略显

下降

Budsgrewwell，tendedtoproliferate；newleavesnormal；growth

vigordecreasedslightlywiththeincreasingconcentration

长势好，增殖效果好，与贯众相当；新生叶片较多，各浓度间

无明显差异

Budsgrewandproliferatewell，similartothosetreatedwithCyr-

tomiumrhizome；morenewleaves；nosignificantdifferencesbe-

tweentheconcentrations

长势不及连翘，老叶浓绿扭曲，新叶细小发黄，颜色差异明

显；浓度升高，长势变缓

Growthvigorwasnobetterthanthattreatedwithweepingforsyth-

ia；oldleavesweretwistedanddarkgreenincolour，significantly

differentfromthenewtinyyellowleaves．Withtheincreasein

concentration，growthvigordecreased

长势好，增殖效果与生叶现象显著，叶色健康正常

Budsgrewwellwithobviousproliferationandleafemerging；

leavesnormal连翘Forsythiasuspense96．783．3贯众Cyrtomiumrhizome1009010096．7—中药类黄连Coptischinensis10083．396．7100—黄芪Astragalusmembrana-96．793．381．7ceus85—甘草Glycyrrhizauralensis9591．788．386．7—

58热带生物学报

续表1

金银花

Lonicerajaponica

五味子

Schisandrachinensis2013年10098．398．396．7—长势略差，仅萌发几片小叶，增殖效果不显著Budsgrewslightlypoor；onlyafewsmallleavesemerged；budproliferationwasnotobvious整体长势一般，有增殖生叶现象Budsgrewnotbad，andtendedtoproliferateandfoliate

长势一般，质量浓度升高后，叶片由卵圆形变为狭长形，低浓

度处理中有生根现象，而高浓度中却没有

Budsgrewnotbad．Withtheincreaseinconcentration，leaf

bladeturnedsuborbiculartolongandnarrow．Norootsinduced

onmediumathighconcentrations，butsomerootsinlowconcen-

trations9091．788．391．7—紫苏叶LeafofPerillafrutes-96．798．3100cens100—

氨基寡糖素

Amino-oligosaccharin93．390

农药类

乙酸铜

CopperacetateT5（2．0mL·L－1）处理死亡率较高，其余处理长势好，有增殖现象，浓度升高，叶片略变小，颜色由浓绿变为黄绿色T5hadahighermortalitywhilebudsofothertreatmentsgrewwell93．393．378．3withproliferation．Withtheincreaseinconcentration，theleavesturnedsmallerslightly，andleafcolourchangedfromdarkgreentoyellowishgreenT5（5g·L）处理全部死亡，长势最差，浓度升高，叶片颜色越灰暗，并有浅猩红色斑块出现，长势越差，死亡率越高，无增殖现象Budsgrewpoor．AllbudsofT5weredead．Withtheincreasein

concentration，theleafcolorturnedtograywithsomescarletpat-

chesandthemortalitybecamehigher．Noproliferation－19593．386．7600

病毒唑

Ｒibavirin100100100整体长势不错，有明显增殖生叶现象；浓度升高，增殖效果渐缓，叶片显黄绿色10096．7Budsgrewbetterwithsignificantproliferationandfoliation；With

theincreaseofconcentration，proliferationdecreasedslightlyand

leafcolourbecameyellowishgreen

长势好，叶色健康，有增殖生叶迹象

Budsgrewwell；leafhealthy；budstendedtoproliferateandfoli-

ateCK100

注：T1～T5表示各病毒抑制剂浓度由低到高的处理；成活率=存活芽体个数/接种芽体个数；下同

Note：T1－T5meanthetreatmentsofthevirusinhibitorsfromlowtohighconcentration；Survivalrate=thenumberofsurvival

buds/thenumberofinoculatedbuds；thesameasbelow

2．2病毒检测结果由表2可以看出，CK处理无脱毒表现；中药类中只有贯众、甘草、五味子和紫苏叶有脱毒表现，除甘草处理可以同时脱除2种病毒外，贯众、五味子和紫苏叶只能脱除1种病毒（OＲSV），但脱毒率仅为16．67%；乙酸铜处理中，仅有1芽脱除CyMV，脱毒效果也不理想；氨毒胜处理中，受检6芽体中有4芽脱除CyMV和OＲSV，剩余的有1芽有脱除CyMV表现；病毒唑处理中，有3芽脱除2种病毒，剩

1芽无脱毒表现。CyMV脱除率以氨毒胜和病毒唑处理最高，余有2芽仅脱除CyMV，均达到83．33%；

OＲSV脱除效果以氨毒胜和病毒唑处理较佳，CyMV较分别为66．7%和50%。综合2种病毒脱除情况，OＲSV更易脱除。

第1期李正民等：病毒抑制剂对蝴蝶兰病毒植株的脱毒效果

表2

Tab．2

CyMV和OＲSV的检测结果

59

DetectionofCYMVandOＲSVunderdifferentvirusinhibitors带CyMV和OＲSV芽数NumberofbudscarryingCyMVandOＲSV

6

仅带CyMV芽数NumberofbudsonlywithCyMV

仅带OＲSV芽数NumberofbudsonlywithOＲSV

无毒芽数Numberofvirus-freebuds

CyMV脱除OＲSV脱除率/%率/%EliminationEliminationrateofCyMVrateofOＲSV

药剂VirusInhibitors

用量Dosage

检测芽数Numberfortest

连翘Weepingforsythia贯众

Cyrtomiumrhizome黄连Coptischinensis黄芪Ｒadixastragali甘草Liquorice金银花Lonicerajaponica五味子Schisandrachinensis紫苏叶Perillaleaf氨基寡糖素Amino-oligosaccharin乙酸铜Copperacetate病毒唑ＲibavirinCK

12g·L－1600000

12g·L－165100016．67

12g·L－16600000

12g·L－16600000

12g·L－16500116．6716．67

12g·L－16600000

12g·L－16501016．670

12g·L－16501016．670

1．0mL·L－16101483．3366．67

3g·L－16501016．670

30mg·L－166

16

00

20

30

83．330

500

3讨论

［5－6］

CyMV和OＲSV病毒侵入寄主细胞复制增殖后，通过胞间连丝和维管束的转运，可对寄主植物造成系统性侵染

。随着越来越多的国家对进出口蝴蝶兰无上述病毒的明确要求，生产无OＲSV和CyMV病

［7］

毒的种苗是兰花产业发展的必然趋势。良好的脱毒技术应该具备以下3个特点：1）较高的脱毒率和成活率；2）操作简便；3）便于推广

。目前的植物脱毒技术有茎尖脱毒、热处理、病毒抑制剂处理、生物学法

60热带生物学报2013年

［8］（抗病毒品种、种子繁殖等）和玻璃化超低温处理等。茎尖脱毒法利用病毒在寄主体内分布不均性，取

最不易带病毒的茎尖生长点，利用组培技术诱导成无毒苗。但蝴蝶兰茎尖存在深藏较深，生长缓慢，摘取茎尖难度大、成活率低等缺点。热处理脱毒方法应用于蝴蝶兰研究较多，单独使用效果不好，常见与茎尖培养、病毒抑制剂处理法等结合使用。抗病毒育种需要一定育种周期且只能针对某些特定病毒，不能兼

如CyMV可随种子传播。玻璃化超低温处理是利用抗各种病毒。种子繁殖可剔除某些而非全部病毒，

含病毒细胞液泡大，超低温保存下可结晶致死来除去病毒，但存在成本太高、操作复杂的缺陷，故尚未见有应用于蝴蝶兰脱毒的报道。

本实验采用病毒抑制剂单独处理法，结合组培技术，对携带CyMV和OＲSV的待增殖芽进行脱毒试验，以寻找最佳的病毒抑制剂和适宜浓度。结果表明：单纯增殖培养无法脱除病毒；8种中药处理中，仅贯众有1芽脱除OＲSV，五味子、紫苏叶各有1芽脱除CyMV，甘草有1芽可同时脱除上述2种病毒，其余中药处理的无脱毒表现；农药类中乙酸铜恶化增殖苗的生长，降低成活率，抽检6芽中仅1芽脱除CyMV；氨

－1CyMV脱除率与病毒唑30mg·L－1毒胜（氨基寡糖素）1．0mL·L表现优异，有4芽全部脱除2种病毒，

－1处理的相当，均为83．33%；OＲSV脱除率与病毒唑30mg·L处理相差不大，都有50%以上的脱除效果。

［10－11］，中药作为一种添加物有应用于组培上的研究报道，如对组培苗长势和抑菌效果研究但应用于［9］

6g·L板蓝根结合蝴蝶兰茎病毒唑应用于植物脱毒研究较多。有研究指出，蝴蝶兰脱毒研究较少，

尖培养可脱除CyMV，脱毒率为77．33%，与本实验的中药类中CyMV脱毒效果最好的甘草、五味子、紫苏

－1－1叶12g·L处理的脱毒率相差很大，仅为16．67%；而50mg·L病毒唑脱除CyMV率仅为33．33%，低

－1于本实验中30mg·L病毒唑处理的脱毒率（83．33%），这可能与材料和具体处理方式不同有关。靖［12］－1

30mg·L－1病毒唑结合热处理茎尖培养，CyMV脱毒率为85．7%，研究表明，与本实验结果相差不

大；OＲSV脱毒率为81．2%，高于本实验中处理的脱毒率（50%）；成活率仅为23．3%，远低于本实验中处晶

［14］理的96．67%，这可能是病毒唑结合热处理茎尖培养方式不同所致。许传俊等研究认为，病毒唑对大

花蕙兰CyMV病毒脱除效果好于OＲSV，这与本实验结果一致。氨基寡糖素作为一种糖类生物农药，具有

［15－17］。笔者首对非靶标生物毒性低、影响小、用量低、安全性好等特点，在烟草花叶病毒防治上曾有报道

次将氨基寡糖素应用蝴蝶兰组培苗脱毒，脱毒效果与病毒唑相当，由于本实验检测的样品略少，两者的脱［13］

阻碍病毒穿毒效果仍需进一步对比。病毒抑制剂的作用机理主要有4种方式：竞争寄主细胞表面受体、

［18］入脱壳、阻碍病毒生物合成和提高寄主抗病能力。关于病毒唑和氨基寡糖素的脱毒机理、最适使用浓

度、降低对植株本身的不利影响和脱毒效果，是否受植物材料、培养基等因素的影响，还需进一步研究。参考文献：

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