灰树花多糖诱导HeLa细胞凋亡的体外实验

范晓艳等灰树花多糖诱导HeLa细胞凋亡的体外实验第18期·3543·

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〔2010-12-23收稿2011-03-02修回〕

4

1

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（编辑曹梦园）

灰树花多糖诱导HeLa细胞凋亡的体外实验

范晓艳

〔摘

刘娜

1

金岳雷朱金玲吕冬霞（佳木斯大学基础医学院，黑龙江佳木斯154007）

要〕目的观察灰树花多糖（PGF）对HeLa凋亡的影响。方法HE染色观察采用MTT法研究PGF对HeLa细胞增殖的体外抑制作用，

3蛋白表达。结果凋亡细胞形态，免疫组化法检测caspase-3蛋白高表达。结论免疫组化检测到caspase-学改变，

〔中图分类号〕R730.52

〔文献标识码〕A

PGF以时间和剂量依赖的方式抑制HeLa细胞的生长，HE染色观察到凋亡细胞的形态

PGF促进HeLa细胞凋亡，3蛋白表达增高有关。其作用机制可能与caspase-〔文章编号〕1005-9202（2011）18-3543-02

〔关键词〕灰树花多糖；宫颈癌HeLa细胞；半胱氨酸蛋白酶；凋亡

化疗是宫颈癌较为传统的治疗方法，传统的化疗药物有不长期应用后其毒副作用给患者带来极大的同程度的毒副作用，痛苦甚至危及生命

〔1～3〕

响，为抗肿瘤天然药物的开发和利用提供实验依据。11.1

材料与方法材料

人宫颈癌HeLa细胞购于武汉大学典型培养物冷

。寻找毒性小、药物不良反应少且有一

定疗效的药物治疗肿瘤成为肿瘤治疗的途径之一。研究表明，PGF）具有稳定血灰树花多糖（Polysaccharideofgrifolafrondosa，

压、降低血糖、改善脂肪代谢、增强免疫功能、抑制肿瘤、抗HIV病毒等生理活性

〔4〕

二氧化碳培养箱（美藏中心。净化工作台（苏州净化设备厂），

国），倒置相差显微镜（日本），酶标仪（LABSYSTEMS），小牛血RPMI-1640培养液（杭州四季青），清、二甲基亚砜（DMSO）、噻PGF粉末（浙江方唑蓝（MTT）（上海普飞生物技术有限公司），

顺铂粉剂（山东齐鲁制药厂），半胱氨酸蛋格药业有限公司），

3）免疫组化试剂盒（武汉博士德生物公司）。白酶3（caspase-1.21.2.1

方法

细胞的培养和传代

配制含10%灭活小牛血清的RP-

。本实验探讨PGF对HeLa细胞凋亡的影

343）基金项目：黑龙江省卫生厅研究项目（No.2009-1

白城实验中学

制与生物学治疗研究。

），第一作者：范晓艳（1979-女，讲师，主要从事肿瘤发生机制与生物学

治疗研究。

），通讯作者：吕冬霞（1965-女，教授，硕士生导师，主要从事肿瘤发生机

MI-1640完全培养液。将宫颈癌HeLa细胞按1×105个/ml的5%CO2，37℃饱和浓度分别接种在含完全培养液的培养瓶内，

湿度培养箱内培养。2～3d传代一次，所有实验均在细胞处于

·3544·中国老年学杂志2011年9月第31卷

对数生长期进行。1.2.2

药物配制

供试药物均用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液配制。PGF设3个浓度：0.01、0.05、0.10mg/L。顺铂：1mg/L。1.2.3

MTT法检测细胞抑制率

将对数生长期的HeLa细胞

2.33的表达免疫组化法检测caspase-PGF促进Hela细胞

3高表达，的caspase-其作用呈一定的浓度和时间依赖性。见表2。表2

组别对照组0.01mg/L0.05mg/L0.10mg/L

PGF对Hela细胞caspase-3表达的影响（%±s）

12h9.33±1.5212.90±2.711）24.76±1.972）37.16±2.932）

24h10.11±1.6712.58±1.451）33.61±3.352）38.93±3.622）

48h10.46±1.5014.76±1.841）38.65±3.132）49.85±3.312）

4

按1×10个/ml的密度移入96孔培养板，每孔加入200μl细

37℃、5%CO2的培养箱中培养。24h后，胞悬液，弃去原培养液，每孔加入不同浓度的PGF溶液200μl，其终浓度分别为0.01、0.05、0.10mg/L；空白对照组中仅加10%小牛血清的RP-MI-1640培养液。

每个浓度设立8个复孔，把培养板移入培养箱中继续培养12、24、48h。经过12、24、48h后分别加入MTT（5mg/L）20μl，继续培养4h，吸弃孔内培养上清液，每孔再加入150μlDMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪选择490nm波长，以空白孔调零，测定各孔吸光度值上，

（OD）。实验重复3次。

细胞抑制率=（1－实验组OD值/对照组OD值）×100%1.2.4

苏木素-伊红（HE）染色法观察凋亡细胞形态

将用多

5聚赖氨酸处理的盖玻片置于6孔板中，按1×10个/ml浓度接

3讨论

24、本实验利用MTT法观察PGF作用于HeLa细胞12、48h后的抑制率，PGF对HeLa细胞具有一定抑制作结果表明，用，其抑制率呈现时间和剂量依赖性。HE染色观察到典型的3是caspase家族中的成员，凋亡细胞。caspase-位于细胞凋亡caspase级联反应的下游，通过下游效应因子切断细胞间的信号传递，诱导形成凋亡小体，执行凋亡功能

〔5〕

。本实验运用免疫

培养24h后，加入不同浓度的PGF溶液，分别于12、种细胞，

24、48h进行常规HE染色。在显微成像系统下观察结果。1.2.5

3蛋白的表达免疫组化方法检测caspase-免疫组化

用常规链酶亲合素-生物素-过氧化物酶复合物（SABC）法，具体操作按说明书进行。镜下观察细胞膜和细胞质出现棕黄色或3表达阳性细胞。显微镜下每个区域选取不重褐色为caspase-3阳性细胞数，复的随机10个高倍视野（×400），计算caspase-求平均值。1.3

统计学处理

应用SPSS11.5统计软件进行处理，实验数

参数统计采用t检验。据以±s表示，22.1

结

果

PGF对HeLa细胞的体外抑制率

MTT结果显示，PGF

24、48h后HeLa细胞的caspase-3组化法检测了PGF作用12、

PGF促进Hela细胞的caspase-3高表蛋白的表达，结果显示，达，其作用呈一定的浓度和时间依赖性，表明PGF诱导肿瘤细3高表达有关。胞凋亡与促进caspase-大量实验证实，许多真菌多糖如香菇多糖、云芝多糖等具有抗肿瘤作用，有研究显示PGF对S180肉瘤的生长具有抑制作用

〔6〕

。本研究进一步证实了PGF在体外能诱导肿瘤细胞凋

3高表达有关。其作用机制可能与caspase-亡作用，4

1

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对Hela细胞的增殖抑制作用均有明显的剂量-效应和时间-效应依赖关系。见表1。

3

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表1

剂量（mg/L）

PGF对Hela细胞的抑制率（%±s，n=8）

12h

OD值抑制率

－

24h

OD值抑制率1.016±0.054

－

48h

OD值抑制率0.932±0.039

－

对照组1.056±0.0980.01

0.973±0.056

7.860.889±0.0281）12.500.756±0.0371）18.88

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〔2011-06-29收稿2011-07-12修回〕

0.050.881±0.0221）16.570.768±0.0322）24.410.654±0.0512）29.830.100.711±0.0682）32.670.623±0.0502）38.680.512±0.0482）45.06

2）P＜0.01；下表同与对照组比较：1）P＜0.05，

2.2PGF对Hela细胞形态的影响倒置显微镜下观察HE染

PGF处理组可见典型的细胞体积缩小、色细胞，与对照组比较，变圆皱缩，细胞核深染，染色质浓缩和断裂。

（编辑袁左鸣/徐杰）