番茄3个抗疮痂病菌T3小种基因的等位性测定和序列分析

462 园艺学报，2015，42 (3)：462–470. Acta Horticulturae Sinica doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0762；http：//www. ahs. ac. cn

番茄3个抗疮痂病菌T3小种基因的等位性测定和序列分析

赵白梅，曹海鹏，段俊杰，杨文才*

（中国农业大学蔬菜学系，设施蔬菜生长发育调控北京市重点实验室，北京 100193）

摘 要：将分别携带抗番茄疮痂病菌Xanthomonas perforans T3小种基因Xv3、Rx4和RxLA1589的番

茄材料Hawaii7981、PI128216和LA1589相互杂交，获得了包含535 ~ 1 655个单株的3个F2分离群体

Hawaii7981 × PI128216、Hawaii7981 × LA1589和PI128216 × LA1589。采用注射法对这3个F2群体的每

个单株及亲本和感病对照OH88119进行抗T3小种鉴定，结果显示除OH88119外的所有单株对T3小种

都具有过敏型抗性反应，表明Xv3、Rx4和RxLA1589为等位基因。根据Rx4基因的序列设计引物，从

Hawaii7981、PI128216和LA1589中扩增该基因并测序，序列比对显示，来自于3个材料的Rx4位点编码

区序列完全一致，表明这3个材料所携带的对番茄疮痂病菌T3小种的抗性由同一基因控制。

关键词：番茄；番茄疮痂病；T3小种；过敏型抗性基因；等位性测定

中图分类号：S 641.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）03-0462-09

Allelic Tests and Sequence Analysis of Three Genes for Resistance to Xanthomonas perforans Race T3 in Tomato

ZHAO Bai-mei，CAO Hai-peng，DUAN Jun-jie，and YANG Wen-cai*

（Beijing Key Laboratory of Growth and Developmental Regulation for Protected Vegetable Crops，Department of Vegetable Science，China Agricultural University，Beijing 100193，China）

Abstract：Three crosses，Hawaii7981 × PI128216，Hawaii7981 × LA1589 and PI128216 × LA1589，were made to develop F2 populations for testing allelisms among three genes Xv3，Rx4，and RxLA1589 for resistance to bacterial spot caused by Xanthomonas perforans race T3. Each population consisted of 535–1 655 individuals. Infiltration method was used to inoculate the parental and F2 plants as well as the susceptible control OH88119. The results showed that all plants had hypersensitive resistance to race T3 except for OH88119，indicating that Xv3，Rx4 and RxLA1589 were allelic genes. Sequences of Rx4 alleles were amplified from Hawaii7981，PI128216，and LA1589 using the gene-specific primers. No sequence variation was observed in the coding region，suggesting that the resistance to race T3 in the three resistant lines was conditioned by the same gene. These results will provide useful information for understanding the mechanism of resistance to race T3 and developing resistant variety in tomato.

Key words：tomato；tomato bacterial spot；race T3；hypersensitive resistance gene；allelic test 收稿日期：2014–10–15；修回日期：2014–12–01

基金项目：国家自然科学基金项目（31372073）；现代农业产业技术体系北京市创新团队果类蔬菜项目（GCTDZJ2014033001）

* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：yangwencai@http://wendang.chazidian.com）

赵白梅，曹海鹏，段俊杰，杨文才.

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园艺学报，2015，42 (3)：462–470. 463

由疮痂病菌（Xanthomonas perforans）优势小种T3引起的疮痂病（bacterial spot）是番茄生产中的一种细菌性病害（孙福在 等，1999；杨文才，2013）。近十多年来，随着种植方式的改变，该病逐渐成为保护地番茄的主要病害之一（王振学 等，2005；郭士成 等，2008；刘艳岩 等，2008；张伟亮 等，2010），对番茄产业的持续发展造成严重威胁。

自1995年T3小种在美国佛罗里达州出现（Jones et al.，1995）以来，人们在抗T3小种番茄材料的发掘、抗性遗传研究和基因定位等方面开展了大量的工作，筛选出具有田间抗性的樱桃番茄（Solanum lycopersicum var. cerasiforme）材料‘PI114490’、醋栗番茄（S. pimpinellifolium）材料‘PI 340905-S’及栽培番茄（S. lycopersicum）材料‘PI126428’和‘PI155372’，还发现了兼具田间抗性和过敏反应的醋栗番茄材料‘PI126932’、‘PI128216’和‘LA1589’，潘那利（S. pennelli）番茄材料‘LA716’，以及栽培番茄育种材料‘Hawaii7981’（Scott et al.，1995；Astua-Monge et al.，2000；孙会军 等，2011a）。进一步研究发现，过敏反应主要由单显性基因控制，而田间抗性则呈数

。迄量性状遗传模式（Scott et al.，1996，2001；Robbins et al.，2009；孙会军 等，2011a，2011b）

今已经鉴定出3个过敏反应基因Xv3、Rx4和RxLA1589，分别来自于‘Hawaii7981’、‘PI128216’和‘LA1589’，但都被定位到番茄第11号染色体的同一位置（孙会军 等，2011a；Wang et al.，2011；Pei et al.，2012）。根据遗传图谱位置和小群体等位性测定推测Xv3和Rx4可能为等位基因或同一个基因（Wang et al.，2011；杨文才，2013）。

为了明确Xv3、Rx4和RxLA1589之间的关系，本研究中将分别携带这3个基因的番茄材料‘Hawaii7981’、‘PI128216’和‘LA1589’进行杂交，获得3个F2分离群体，通过进行抗性鉴定以明确3个基因是否为等位基因，然后对3份亲本材料的Rx4候选基因序列进行PCR扩增，通过序列比对来确定这3个基因是否为同一个基因，为番茄抗疮痂病机理研究和在育种中利用这3个抗病材料提供参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料和试验设计

番茄材料包括抗疮痂病的栽培番茄‘Hawaii7981’（携带Xv3基因）、醋栗番茄‘PI128216’（携带Rx4基因）和‘LA1589’（携带RxLA1589基因），感病栽培番茄‘OH88119’，以及‘Hawaii7981’בPI128216’、‘Hawaii7981’בLA1589’、‘PI128216’בLA1589’的F1和F2群体。抗性鉴定分两批在中国农业大学上庄试验站日光温室中进行。第1批于2014年2月11日播种，3月21日定植，种植的材料包括‘Hawaii7981’、‘PI128216’及其F1和F2群体，以‘OH88119’为感病对照，4月10日进行接种抗性鉴定。第2批材料于2014年3月28日播种，4月26日定植，种植的材料包括‘Hawaii7981’、‘PI128216’、‘LA1589’及‘Hawaii7981’בLA1589’、‘PI128216’בLA1589’的F1和F2群体，以‘OH88119’为感病对照，5月18日进行接种抗性鉴定。

1.2 接种和过敏反应观察

所用菌系为番茄疮痂病T3小种病原菌Xv829，由美国佛罗里达大学植物病理系的Jeffery Jones教授提供。接种前3 ~ 4 d将保存于4 ℃的菌用接种环刮取少许涂到YDC（Lelliot & Stead，1987）平板培养基上，在28 ℃下培养2 ~ 3 d后，用无菌水悬浮并稀释成约1 × 108 cfu · mL-1的菌液。

接种前1 h，对生长于日光温室中的番茄植株喷水。采用叶背面注射法（Yang & Francis，2005）

Zhao Bai-mei，Cao Hai-peng，Duan Jun-jie，Yang Wen-cai.

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464 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (3)：462–470. 接种，每个番茄植株注射3片小叶，每片小叶的注射面积约为1 cm2。接种完成后，每天早、晚分别对番茄植株喷水1次，以增加病害发生所需要的湿度。

接种后24 h开始调查过敏反应，每24 h调查1次，直到感病亲本‘OH88119’出现水浸状病斑为止。

1.3 Rx4基因的序列扩增与分析

采用改进的CTAB法（Kabelka et al.，2002）分别提取‘Hawaii7981’、‘PI128216’、‘LA1589’和‘OH88119’的基因组DNA。根据已经克隆的Rx4候选基因序列（Pei et al.，2012）及番茄基因组序列（Sato et al.，2012）设计了基因特异引物（正向：5′-TATTATCGGCAGGAAGCAC-3′；反向：5′-CTTTCTTCTACAACGCCTC-3′），分别从4个材料的基因组DNA中扩增Rx4基因及上、下游部

、分序列。PCR反应体系为25 μL，包括14.25 μL ddH2O、2.5 μL 10× LA PCR Buffer Ⅱ（Mg2+ Plus）

、4 μL dNTPs（各2.5 μmol · L-1）、2 μL DNA模板和0.25 μL（5 正反向引物各1 μL（10 μmol · L-1）

U · μL-1）TaKaRa LA Taq酶（宝生物工程有限公司，大连）。PCR扩增使用BIO-RAD热循环仪，反应程序如下：94 ℃ 4 min，34个循环包括94 ℃变性35 s、52 ℃退火35 s和72 ℃延伸5 min，最后在72 ℃下保持10 min。

PCR产物经0.9%琼脂糖凝胶电泳后，用天根生化科技（北京）有限公司的大量琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的DNA片段。将回收的PCR产物，与pMD-19T载体构建重组质粒，将连接产物转至大肠杆菌感受态细胞中，菌液经PCR检测获得阳性克隆。每个材料随机选取2 ~ 3个阳性克隆的菌液送北京三博远志生物技术有限责任公司测序。采用DNAMAN（Lynnon Biosoft，USA）去除测序片段中的载体序列并进行序列拼接，同时从SOL Genomics Networks（http：//www.sgn.cornell.edu/）上获取已经进行全基因组测序的两个材料‘Heinz1706’和‘LA1589’的Rx4位点相应序列，采用DNAMAN进行多重序列比对。

2 结果与分析

2.1 亲本材料和F1植株叶片在接种番茄疮痂病T3小种病原菌后的症状

抗病亲本‘Hawaii7981’、‘PI128216’、‘LA1589’和所有F1植株的叶片在注射接种病原菌T3小种后24 ~ 48 h都出现过敏反应症状，病斑边缘清晰，而感病对照‘OH88119’的叶片上没有任何症状（图1，24 h）。接种96 h后，感病亲本‘OH88119’的叶片上开始出现水浸状病斑，注射区域外围叶色褪绿，病斑向外扩展，此时抗病亲本及F1植株叶片上的病斑已经干枯坏死，病斑不再扩展（图1，96 h）。

2.2 Xv3、Rx4和RxLA1589的等位关系分析

对第1批材料进行抗性鉴定时，由于日光温室的温度（主要是夜温）略低于病害发生所需的温度，接种的植株叶片上出现过敏反应的时间推迟。在接种后24 h，‘Hawaii7981’（Xv3基因）、‘PI128216’（Rx4基因）及其F1和F2植株叶片上都没有出现过敏反应症状，感病对照‘OH88119’上也没有症状。在接种后48 h，除感病对照外，其余植株叶片上都出现了过敏反应症状，而且在F2群体的1 655个单株中没有观察到感病植株（表1），表明‘Hawaii7981’和‘PI128216’所携带的抗番茄疮痂病T3小种的基因Xv3和Rx4是等位的。

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图1 亲本植株在接种番茄疮痂病T3小种病原菌24 h和96 h后叶片上的症状

Fig. 1 Symptoms on leaves of parental plants 24 h and 96 h after infiltration of bacterial spot race T3

表1 亲本及各组合F1和F2对番茄疮痂病T3小种的抗性反应统计

Table 1 Summary of response to tomato bacterial spot race T3 in parents，F1 and F2 plants

亲本/世代

Parent/Generation Hawaii7981（Xv3） PI128216（Rx4） LA1589（RxLA1589） OH88119

（Hawaii7981 × PI128216）F1 （Hawaii7981 × PI128216）F2 （Hawaii7981 × LA1589）F1 （Hawaii7981 × LA1589）F2 （PI128216 × LA1589）F1 （PI128216 × LA1589）F2

总株数

Total number of plants 8 7 8 8 7 1 655 6 535 6 987

抗病株数

Number of resistant plants 8 7 8 0 7 1 655 6 535 6 987

感病株数

Number of susceptible plants 0 0 0 8 0 0 0 0 0 0

第2批材料中，除感病对照‘OH88119’外，其余植株的叶片上都在注射接种后24 h出现了过敏反应症状，‘Hawaii7981’（Xv3基因）בLA1589’（RxLA1589基因）和‘PI128216’（Rx4基因）×，表明‘LA1589’的两个F2群体（分别包含535和987个单株）中都没有观察到感病单株（表1）‘Hawaii7981’与‘LA1589’所携带的抗番茄疮痂病T3小种的基因Xv3和RxLA1589是等位的，‘PI128216’与‘LA1589’所携带的抗番茄疮痂病T3小种的基因Rx4和RxLA1589也是等位的。 2.3 抗性位点Rx4在‘Hawaii7981’、‘PI128216’和‘LA1589’中的序列比较

为了确认‘Hawaii7981’、‘PI128216’和‘LA1589’对番茄疮痂病的抗性是否为同一基因控制，

Zhao Bai-mei，Cao Hai-peng，Duan Jun-jie，Yang Wen-cai.

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采用Rx4候选基因特异引物从这3个材料及感

病材料‘OH88119’中扩增该位点的基因组

DNA。电泳结果显示，所有材料中都扩增到了

大小约为3.5 kb的单一条带，‘OH88119’的

PCR产物比其他3个材料的略小（图2）。

测序结果显示，‘Hawaii7981’、‘PI128216’

和‘LA1589’中Rx4位点的序列长度相同，都

为3 535 bp。‘LA1589’中该位点的序列与已

经公布的‘LA1589’基因组中Rx4序列完全一

致，感病对照‘OH88119’中的rx4位点序列

与‘Heinz1706’基因组中的rx4序列完全一致，

长度为3 411 bp。抗病材料和感病材料之间在编码区存在8个单核苷酸多态性（SNP）和1个插入/缺失（InDel）变异，与Pei等（2012）的研究结果一致，在上游序列中有2个InDel（105 bp和24 bp）

‘LA1589’、‘PI128216’和‘Hawaii7981’和11个SNPs，下游序列中有4个SNPs（图3）。3个抗病材料

之间在上游序列中还互有2 ~ 4个SNPs。

图2 番茄Rx4位点的PCR产物电泳图 Fig. 2 Image of electrophoresis for PCR products of Rx4 locus O：OH88119，P：PI128216，H：Hawaii7981，L：LA1589.

图3 ‘Hawaii7981’、‘PI128216’、‘LA1589’、‘OH88119’和‘Heinz1706’中的

Rx4位点及其上下游序列核苷酸变异

以‘Heinz1706’中的Rx4位点序列为标准，相同的核苷酸序列未列，“+”代表有插入片段，“-”代表无插入片段或核苷酸。

上、下游序列中的外显子用灰色方格显示，感病材料或与感病材料相同的碱基用浅灰色方格显示，

仅PI128216和Hawaii7981中相同的碱基用深灰色方格显示。

Fig. 3 Nucleotide variation of Rx4 locus，upstream-，and downstream- sequences among Hawaii7981，

PI128216，LA1589，OH88119 and Heinz1706

Sequence of Rx 4 locus from Heinz1706 is used as the standard. Invariable nucleotides are removed. A plus（+）indicates existence of the insertion，

and a dash（-）indicates absence of the insertion or nucleotide. Exon in up-stream and down-stream sequences is indicated with gray cell.

The base in the susceptible lines or the same as in the susceptible lines is indicated with light gray cell，while the base that is

only the same between PI128216 and Hawaii7981 is indicated with deep gray cell.

由于Rx4基因没有内含子（Pei et al.，2012），因此其基因组DNA也可视为cDNA。将cDNA序列用NCBI网站上的ORF Finder进行开放阅读框预测和氨基酸序列推导，得到感病材料‘OH88119’中rx4位点的开放阅读框为2 667 bp，编码888个氨基酸，而抗病材料‘Hawaii7981’、