NAA对葡萄果实中糖酸含量及相关基因表达的影响

园艺学报，2015，42 (3)：425–434.

Acta Horticulturae Sinica doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0922；http：//www. ahs. ac. cn 425 NAA对葡萄果实中糖酸含量及相关基因表达的影响

王西成，吴伟民*，赵密珍，钱亚明，王壮伟

（江苏省农业科学院园艺研究所，江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室，南京 210014）

摘 要：以‘里扎马特’葡萄为试材，于果实始熟期分别利用50、100和200 mg · L-1的NAA喷施

果实。结果表明：NAA处理可显著抑制果实中葡萄糖、果糖、蔗糖以及可溶性总糖的积累，阻碍酒石酸、

苹果酸、柠檬酸、草酸及总酸的降解，且以200 mg · L-1处理最为显著，但处理并未改变果实中的糖酸组

分。NAA处理还可显著抑制可溶性糖代谢关键基因SS和SPS的表达，但对NI表现为前、中期抑制，后

期促进，对FRK表现为前、中期促进，后期抑制。对于有机酸代谢相关基因而言，NAA处理显著促进

MDH和PEPC的表达，抑制ME基因的表达，但对IDH基因表达的影响并不显著。由此推断，外源NAA

处理抑制果实成熟的原因可能在于其改变了部分糖酸代谢相关基因的表达，进而阻碍了可溶性糖的积累

和有机酸酸的降解。

关键词：葡萄；萘乙酸；可溶性糖；有机酸；基因表达

中图分类号：S 663.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）03-0425-10

Effect of NAA Treatment on Sugar Acid Content and Related Gene Expression in Grape Berries

WANG Xi-cheng，WU Wei-min*，ZHAO Mi-zhen，QIAN Ya-ming，and WANG Zhuang-wei

（Institute of Horticulture，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement，Nanjing 210014，China）

Abstract：‘Rizamat’grape berries were treated with 50，100 and 200 mg · L-1 NAA separately at veraison. The results showed that the accumulation of glucose，fructose，sucrose and soluble sugar was significantly inhibited，and the degradation of tartaric acid，malic acid，citric acid，oxalic acid and total acid was also hindered by the treatment of NAA. Comparing three different treatments，the effect of NAA with 200 mg · L-1 was the most remarkable，but sugar and acid compositions were not changed. The expression of SS and SPS，which were the soluble sugar-metabolism related genes，was also inhibited by the treatment of NAA. But the expression of NI was inhibited in prometaphase and promoted at later stage. The expression of FRK was contrary to the NI. For organic acid related genes，the expression of MDH and PEPC was promoted by the treatment of NAA，and the expression of ME was inhibited. But the effect on the expression of IDH was not significant. Therefore，we speculate that the reason for delaying fruit 收稿日期：2014–11–21；修回日期：2015–01–29

基金项目：江苏省农业科技自主创新资金项目[CX（13）5017，CX（10）202]

* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：5wm@http://wendang.chazidian.com）

Wang Xi-cheng，Wu Wei-min，Zhao Mi-zhen，Qian Ya-ming，Wang Zhuang-wei.

Effect of NAA treatment on sugar acid content and related gene expression in grape berries.

426 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (3)：425–434. ripening of exogenous NAA is that parts of the sucrose and acid-metabolism related genes expression are changed，and then the accumulation of sugar and degradation of acid are hindered.

Key words：grape；naphthylacetic acid；soluble sugar；organic acid；gene expression

葡萄果实中最主要的可溶性糖是葡萄糖和果糖，蔗糖含量较低（卢彩玉 等，2011）；最主要的有机酸是酒石酸和苹果酸，约占总酸含量的90%，同时还有少许柠檬酸以及一些其它不含氮的有机酸（Lamikanra et al.，1995）。

葡萄果实糖分以蔗糖的形式从源器官（叶）经韧皮部长距离运输到浆果内，然后在转化酶（INV）的作用下转化为葡萄糖和果糖并在果肉（中果皮）细胞的液泡内储存（Liu et al.，2006；Agasse et al.，2009；娄玉穗 等，2013）。葡萄果实糖分积累主要受糖代谢相关酶的调控，转化酶和蔗糖磷酸合成酶在葡萄果实中分别起分解和合成蔗糖的作用，而蔗糖合成酶既可以合成蔗糖也可以分解蔗糖（Pan et al.，2009）。对于有机酸代谢而言，苹果酸的合成与积累受苹果酸代谢关键酶的调控；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）和细胞质NAD依赖的苹果酸脱氢酶（MDH）主要负责苹果酸的合成，而细胞质NADP依赖的苹果酸酶（ME）则负责苹果酸的降解（Miller et al.，1998）。

α–萘乙酸（NAA）具有促进细胞分裂与膨大，提高坐果率等功能，可经由叶片、树枝的嫩表皮及种子进入植株体内，在促进果树开花、防止落果、提高果实产量以及推迟果实成熟等方面已得到广泛应用（Jeong et al.，2004）。近年来有关NAA对葡萄果实品质影响的研究已见诸报道（Böttcher

，但有关NAA对葡萄果实糖酸组成成分及其et al.，2010；赵权和高静，2011；周莉和王军，2011）

代谢相关基因表达的影响尚未见报道。

本研究中通过使用不同浓度的NAA处理‘里扎马特’葡萄果实，测定其对果实生长发育、糖酸含量，以及部分可溶性糖代谢相关酶和部分有机酸代谢相关酶编码基因表达的影响，以期为NAA对葡萄果实糖酸的积累、代谢研究及其调控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料及其处理

试验于2013年6月10日—8月7日在江苏省农业科学院葡萄园内进行。园区位于南京市，属亚热带季风气候，年均气温15.4 ℃，年降雨量1 150 mm。试材为7年生‘里扎马特’葡萄，株行距为1 m × 3 m，双十字V型架，避雨栽培。供试葡萄植株生长健壮，常规管理。设置50、100和200 mg · L-1 NAA水溶液处理，清水处理作为对照。每个处理选定6株长势较为一致的植株，每2株为1个重复，共设3次重复。于果实始熟期（7月3日）进行喷施果穗处理，每小时喷施1次，共喷施3次，每次均喷施果穗至完全淋湿状态。处理后每1周取样1次，直至果实成熟（8月7日）。

1.2 取样方法

每次分别从处理与对照植株选择有代表性的果穗4穗，每穗上、中、下3个部位别取2粒、2粒和1粒果实，每个处理每次取约120粒。样品采集后分成两部分保存，一部分立即投入液氮中速冻后带回实验室于–70 ℃冰箱中保存备用，用于RNA的提取；另一部分放入冰盒，带回实验室用于果实单果质量、可溶性固形物以及糖酸含量测定。

王西成，吴伟民，赵密珍，钱亚明，王壮伟.

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1.3 单果质量和糖酸测定

随机从每个重复中取20粒果实称其总质量，求得单果质量。随机取10粒果实，利用手持糖度可溶性总糖的提取参照Ding等（2002）的方法并加以改进。取0.5 mL样品提取液于旋转蒸发仪测定果实中可溶性固形物含量。 仪内（德国Heidolp）蒸干（45 ℃），加1 mL超纯水溶解，0.22 mm水系滤头过滤后采用Agilent 1100系列HPLC系统测定。色谱柱为CARBOSep CHO620 CA（6 mm × 250 mm，10 μm），流动相为超纯水，柱温80 ℃，流速0.5 mL · min-1，进样量5 μL，示差折光检测器。设置3次重复。

有机酸的提取参照王海波等（2010）的方法。取1 mL上清液，经0.22 mm有机滤头过滤后采用Agilent 1100系列HPLC系统测定。色谱柱为ZORBAX Eclipse XDBC18（416 mm × 250 mm，5 μm），

柱温25 ℃，流速0.5 mL · min-1，进样量为5 μL，检测波长214 nm。流动相为2 mg · mL-1偏磷酸溶液，

3次重复。试验所用葡萄糖、果糖、蔗糖、草酸、酒石酸、苹果酸和柠檬酸均购自Sigma公司。

1.4 糖酸代谢相关基因表达水平的测定

葡萄果实总RNA的提取采用北京华越洋生物科技有限公司生产的多糖多酚植物专用RNA提取试剂盒Quick RNA isolation Kit进行。cDNA第一链的合成是以提取的果实总RNA为模板，参考TaKaRa Prime ScriptTM RT-PCR试剂盒说明书进行。

基因的表达分析采用大连宝生物公司生产的SYBR Premix Ex TaqTM实时定量PCR试剂盒进行定量分析。根据GenBank中NI、SS、SPS、FRK、PEPC、MDH、ME和IDH的全长序列，利用Primer 5.0设计PCR引物，UBI（XM_002266714）作为内参基因。内参及目的基因引物均交由上海捷瑞生物工程有限公司（http://wendang.chazidian.com）合成（表1）。PCR反应体系为20 μL：cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.8 μL，反应MIX 10 μL（Toyo），ddH2O 7.4 μL。反应程序如下：95 ℃变性1 min；95 ℃变性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。设置3次重复。反应结束后采用??Ct法对荧光定量PCR扩增数据进行处理，目的基因的相对表达量通过计算2-??Ct值来确定。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

Table 1 Primers of real-time quantitative PCR

基因

Gene

NI

SS

SPS

FRK

PEPC

MDH

ME

IDH

UBI

登录号 Accession number NM_001281047.1 引物序列（5′–3′） Sequence of primer（5′–3′） 片段大小/bp Size of amplified product F：TTGCAGCTAATGACCCAGGG 170 R：GCAGTCCACAGTCTTCTCCC BG273882.1 F：CCAGCCAACGTCATTAGCCT 250 R：CCATGACTTGTGGCCTTCCT BG273723.1 F：GAACTCCTGATGTCCGAGCC 158 R：CTTGGTGGGGTGCACAAAAC XM_003632657.1 F：AAGGTTGGGCGGGATGAATT 173 R：ATGATGTCTGCCTGGTTCCG XM_002280806.1 F：TACCTTCCGAGTTGCTGCTG 207 R：GCTCCCCTCAAGTCCTTCAC AF195869.1 F：GCTGAGGCCAATGTACCAGT 193 R：ATGCCATTGAGAGGGTTGCA FC061962.1 F：CAACTGTTGGTGAGGCTTGC 162 R：CCAGAATCCGCTCACCATCA FC065751.1 F：CCTGTGAGAAGCTGAGACCG 162 R：GTCTTGATGCCCAGAAGCCA XM_002266714 F：GCTCGCTGTTTTGCAGTTCTAC 150 R：AACATAGGTGAGGCCGCACTT

Wang Xi-cheng，Wu Wei-min，Zhao Mi-zhen，Qian Ya-ming，Wang Zhuang-wei.

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本试验采用随机区组设计，试验数据分别采用SPSS17.0软件及Excel 2007进行差异显著性及作图分析。

2 结果与分析

2.1 NAA对葡萄果实生长发育的影响

果实质量测定结果表明，NAA处理与对照果实的生长都呈线性增长趋势，外源NAA处理与对照差异并不显著（图1）。

随着果实的发育与成熟，果实中可溶性固形物含量也呈总体上升趋势，但自处理后14 d开始，NAA处理果实中的可溶性固形物含量一直显著低于对照，并以200 mg · L-1 NAA处理与对照之间差异最大（图1）。

值得注意的是，本研究中成熟单果质量主要介于5.9 ~ 6.4 g之间，低于常规的10 g左右，其原因可能与地区气候差异有关；同时本研究中并未对其进行疏花、疏果管理，也可能是导致果粒偏小的原因之一。

图1 不同浓度NAA对‘里扎马特’葡萄单果质量和可溶性固形物含量的影响

Fig. 1 Effects of different concentrations of NAA on fruit weight and soluble solids content of‘Rizamat’

2.2 NAA对果实可溶性糖含量的影响

葡萄糖和果糖在‘里扎马特’葡萄中所占比例相当，蔗糖相对较少（图2）。自转色期开始，随着果实的发育与成熟，蔗糖、葡萄糖、果糖及总糖含量均在持续增加，但较之对照，3种不同浓度NAA处理均抑制了糖分的合成与积累。

蔗糖含量测定结果（图2）表明，NAA处理前期蔗糖含量基本随着NAA处理浓度的提高而逐渐降低；但到果实发育成熟时（8月7日），100 mg · L-1处理果实中蔗糖含量约为1.18 mg · g-1 FW，显著高于50和200 mg · L-1处理（0.93和0.83 mg · g-1 FW）。

成熟果实中葡萄糖含量为100 mg · L-1 NAA处理显著高于200 mg · L-1处理，但与50 mg · L-1处理无显著差异。与之不同的是，成熟果实中的果糖含量在3种不同浓度NAA处理间差异均不显著。

对于总糖含量而言，对照果实多显著高于处理，处理后21 d时约为处理的1.3 ~ 1.5倍；对照果实总糖含量变化基本表现出先快后慢的增长趋势，而处理则均表现为先慢后快的趋势（图2）。

王西成，吴伟民，赵密珍，钱亚明，王壮伟.

NAA对葡萄果实中糖酸含量及相关基因表达的影响.

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图2 不同浓度NAA对‘里扎马特’葡萄可溶性糖含量的影响

Fig. 2 Effects of different concentrations of NAA on contents of soluble sugars in the flesh of‘Rizamat’berries

2.3 NAA对果实有机酸含量的影响

由图3和图4可看出，随着果实的发育与成熟，处理与对照果实中有机酸含量均呈逐渐降低趋势。

就总酸含量而言，对照果实中总酸含量始终低于处理，尤其在NAA处理后14 d时（7月17日）对照果实中总酸含量约为4.98 mg · g-1FW，显著低于50、100和200 mg · L-1 NAA处理（7.22、7.64和8.38 mg · g-1FW），但随后处理与对照果实间差异越来越小（图3）。

酒石酸和苹果酸变化趋势与总酸含量变化较为一致，且对照果实一直低于处理果实（图4）。

柠檬酸在处理后14 d时仅200 mg · L-1处理中可检测到，之后均检测不到柠檬酸的存在（图4）。

草酸含量在处理7 d时（7月10日）对照与处理之间均不存在显著差异；其次，随着果实的进一步发育，处理果实中草酸含量显著高于对照（图4）。