猕猴桃细菌性溃疡病的研究进展_李黎

第32卷第5期2013年9月华中农业大学学报JournalofHuazhongAgriculturalUniversityVol．32No．5Sep．2013，124～133

猕猴桃细菌性溃疡病的研究进展

李

摘要

黎

1

钟彩虹

1

李大卫

1

张胜菊

1

黄宏文

1，2

1．中国科学院武汉植物园，武汉430074;2．中国科学院华南植物园，广州510650

猕猴桃细菌性溃疡病是一种严重威胁猕猴桃生产的毁灭性病害。近年来，该病在新西兰和意大利等

猕猴桃出口大国爆发，并有世界范围内进一步扩散之势，给猕猴桃产业的发展造成了严重威胁。笔者基于国内外最新的研究报道，对猕猴桃细菌性溃疡病的发病症状、病原鉴定、快速检测方法、致病力差异、病原菌侵染机病害发生流行规律及防治技术等方面进行了综述，并探讨了该病害未来的研究方向与防治策略。理、

关键词

猕猴桃；细菌性溃疡病；检测；侵染；防治

S432．4+2；S663．4

文献标识码

A

2421（2013）05-0124-10文章编号1000-中图分类号

猕猴桃细菌性溃疡病（bacterialcankerdisease

ofkiwifruit）是一种严重威胁猕猴桃生产和发展的毁疡病菌Pseudomonassyringaepv．actinidae（PSA）从

皮孔、落叶痕、枝条分叉处开始侵植株的茎蔓幼芽、

灭性病害，其发生具有范围广、传播快、致病性强、防染，潮湿时感病部位产生乳白色粘质菌脓，与植物伤

治难度大等特点，可在短期内造成大面积树体死亡，流混合后呈黄褐色或锈红色，病原菌借助风雨或修现已被列为中国森林植物检疫性病害。该病于剪工具，从植株的气孔、水孔、皮孔、伤口（虫伤、冻1983年在美国加利福尼亚州首次发现，目前已在美国、日本、法国、新西兰、韩国、伊朗、意大利、葡萄牙和智利等国家以及中国陕西、安徽、重庆、四川、湖北、湖南、河南和河北等地区发生，给世界猕猴桃产笔者业造成了严重的经济损失。2012年春秋季，所在课题组通过调查发现，猕猴桃细菌性溃疡病在中国陕西和四川等猕猴桃主产区普遍发生，病株率

［1］

伤、刀伤）等处侵入，随后扩延至整个枝蔓；春季时

叶片呈现黑褐色斑点，周围有黄色晕圈，随后由于上年生枝蔓溃疡、养分输送渠道被阻断，造成营养和水分缺乏，花蕾、幼芽及嫩枝逐渐感病枯萎；夏季时病颜色呈黑褐原菌侵染至木质部造成局部溃疡腐烂，色，影响养分的输送和吸收，造成树势衰弱；秋季时

气孔及果柄处定植，也可随病残病原菌主要在皮孔、

感染严重的果园达70%以上，体在土壤中定植，通常达到20%左右，侵染速度减弱。如此形成侵染的

［2-3］。很多果园因死树率过高而导致毁园，损失十分惨重。周年循环目前，猕猴桃细菌性溃疡病在全球感染范围正

随着苗木的远距离传播逐渐扩大，对该病的快速鉴

在中国，猕猴桃细菌性溃疡病一般在2月下旬

至3月上旬开始发病（图1）。植株主干和枝条感病

产生乳白色粘质菌脓，在3月中下旬至4月后龟裂，

下旬，与植物伤流混合后呈黄褐色或锈红色，韧皮部

局部溃疡腐烂，严重时可环绕茎秆导致树体死亡；叶片一般在4月开始感病，在新生叶片上呈现不规则形或多角形、褐色斑点，随后病斑周围有3～5mm的黄色晕圈，导致叶片焦枯、卷曲；藤蔓感病后部分

水渍状，常形成1～3mm长的纵向裂变成深绿色、

缝；4月下旬到5月中旬，花蕾感病后不能张开，随

［4-7］。后变褐枯死并脱落

定、侵染机理、流行规律和防治方法等研究尤为重

要。笔者对猕猴桃细菌性溃疡病的最新研究状况进行了综述，并探讨了该病害未来的研究方向与防治策略，以期降低该病对猕猴桃产业的损失与风险。

1病害发生症状

猕猴桃细菌性溃疡病目前在世界各地的发病症状及侵染规律基本一致。以意大利典型地中海气候猕猴桃溃条件下的发病症状为例：冬季与早春时节，

03-30收稿日期：2013-基金项目：国家青年科学基金项目（Y211121N01）、中国科学院植物种质创新与特色农业重点实验室项目（Y152091t02）和中国科学院重要

方向性知识创新项目（2A200931121103535）mail：lily19851205@yahoo．com．cn黎，博士，助理研究员．研究方向：植物病理学与植物保护．E-mail：huanghw@mail．scbg．ac．cn通讯作者：黄宏文，博士，研究员．研究方向：植物资源保护与育种．E-李

第5期李黎等：

猕猴桃细菌性溃疡病的研究进展

125

A～C：主干产生细菌性分泌物Bacterialcankerexudatesproductionfromtrunks；D：木质部皮孔红化Ｒeddeningofthelenticels；E：叶片上产生褐色病斑，周围伴有黄色晕圈Typicalleafcankersymptomswithbrownspotssurroundedbyyellowhaloes；F～G：花蕾、幼芽及嫩枝枯萎Typicalcanediebackandwiltingofbuds，shootsandtwigs．

图1

Fig．1

红阳猕猴桃感染细菌性溃疡病的典型症状

ThetypicalbacterialcankerdiseasesymptomsofinfectedkiwiplantsHongyang

2病原菌鉴定

猕猴桃细菌性溃疡病的病原菌研究在世界多个

［8-15］

产芽孢；低温、强光照和高湿适于该病菌的生长；

菌体为好氧菌，在牛肉蛋白胨培养基上的菌落为乳白色、圆形、光滑、边缘全缘，在肉汁胨培养液中呈云雾状混浊且不形成菌膜，在金氏培养基上的菌落一

国家均有报道

。1983年，Opgenorth等［8］对美国

精氨酸双解酶加利福尼亚州的猕猴桃溃疡病植株进行了常规病原般产生黄绿色的荧光；氧化酶阴性，

［2-3，8，22］

。对烟草花叶有过敏反应学研究，根据病原菌的形态特征及病害的症状表现，阴性，

推论该病原菌为丁香假单胞杆菌（Pseudomonassy-近年来，分子生物学技术逐步被运用到PSA菌

ringae）。1989年，16S和日本学者根据该病在神州静冈县株鉴定中。2009－2012年，基于生物学特性、23S（ITS）rDNA序列比对分析，寄主范围以及病原菌的生物化学特性，16S-的症状表现、意大利、新西兰、认为病原菌与P．syringaepv．syringae和P．syringae法国、土耳其、葡萄牙、西班牙的病原菌分别被鉴定

23-27］［28］

pv．morsprunorum有明显区别，。2011年，且比后两者对猕猴桃为PSA菌株［13，张立新等对中国能在枝蔓、花及叶片上均表现出溃有更强的致病力，疡病的典型症状，并首次将该病原菌命名为丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种P．syringaepv．actinidae

16-17］

（PSA）［4，。1994年，意大利及韩国学者同样认

［10-11］

。中国为猕猴桃溃疡病的病原菌为PSA菌株

安徽、重庆和陕西等猕猴桃溃疡病重发区的代表性

菌株进行了16SrＲNA片段扩增比对，结果显示供试的3个代表性细菌16SrＲNA序列与NCBI收录的PSA菌株序列（GenBank序列号：AB001439．1）同

［29］

赵利娜等对安徽岳西、源性达到99%。2012年，

陕西户县和重庆黔江等地病原菌的致病力、生化特

性及ITS序列进行了分析，结果证实得到的菌株ITS序列与已报道PSA菌株序列（GenBank序列号：JN172920．1）一致。

学者从该病原菌的致病性、生理生化性状和寄主范

分别研究了四川省苍溪市及都江堰市、重围等方面，

庆市、安徽省和陕西省关中地区的猕猴桃细菌性溃

疡病的病原菌，结果证实其病原均为PSA菌株

［14，18-21］

。综合对PSA菌株的生理生化、显微观察

可知PSA病原菌为短杆状与营养特征的研究结果，或稍微弯曲，单细胞，两端钝圆，多数具1根、少数具2～3根极生鞭毛；革兰氏染色为阴性，无荚膜，不

3病原菌快速检测

由于猕猴桃细菌性溃疡病已被列入中国森林检

疫对象名单，因此快速检测外来种子或苗木上是否

带有病原菌是防止该病扩散的有效手段，也是未来

Gardan等［30］运用DNA杂交的研究重点。1999年，设计了2对猕猴桃溃疡病病菌的特异性鉴定引物，

并将引物在与PSA病原菌亲缘关系较近的6个属

研究了48个丁香假单胞杆17个种共计56个菌株进行了特异性验证。目前，技术和核糖分型等方法，

菌及其他相关假单胞杆菌属菌株的遗传背景，并指该方法已被广泛应用在PSA菌株的分子鉴定

［13，25］

。但以上2种方法均无法将PSA菌株与其出所有菌株可划分为9个独立的基因类群，但遗憾中

的是其研究材料中并没包含PSA菌株。2002－2003亲缘关系最近的P．syringaepv．theae菌株区分开Scortichini等［31］和Manceau等［32］分别运用重复年，

PCＲ）、AＲDＲA及AFLP等技术，序列PCＲ（ＲEP-将

来。

2011年，Gallelli等［38］根据avrD1基因及KNF/KNＲ引物对重新设计了双重PCＲ检测手段，该方

PSA菌株划分到第8个类群中，并认为PSA菌株与

P．avellanae及P．syringaepv．theae亲缘关系较近。法能有效地区分PSA菌株及P．syringaepv．theae菌2011年，Marcelletti等［33］基于gyrB、rpoB、rpoD、ac-株，并直接用于快速检测疑似感染的猕猴桃叶片、花nB、fruK、gltA及pgi序列进行了MLST分析，认为PSA菌株与P．syringaepv．theae亲缘关系最近。

2002－2005年，有些国外学者分别基于特异性ＲAPD片段、16S序列及argK基因，分别设计了引物对KNF/KNＲ、PAV1/P22、OCTF/OCTＲ和

蕾、叶柄、树皮及花粉，并无需先进行组织分离、纯化及DNA提取工作，大大减少了检测工作的繁琐程hopA1、corA及度。目前，新西兰学者也正基于cts、hrpK1等基因，V菌株的快速设计特异性鉴定PSA-荧光定量PCＲ技术，以准确地分辨新西兰同时存在

34-36］

ArgKF3/ArgKＲ用于快速检测PSA病原菌［31，。的PSA-V和PSA-LV菌株，有效地防止病原菌的进2010年，Ｒees-geroge等［37］基于rDNA的ITS序列，一步蔓延（http：//www．kvh．org．nz/）。

表1

Table1

引物名称PrimerpairKNFKNＲPAV1P22OCTFOCTＲArgKF3ArgKＲPsaF1PsaＲ2PsaF3PsaＲ4AvrDdpx-F

AvrDdpx-Ｒ

引物方向SenseForwardＲeverseForwardＲeverseForwardＲeverseForwardＲeverseForwardＲeverseForwardＲeverseForwardＲeverse

目标基因GenePutativelipoprotein16SrＲNAargKargKITSITSKN-ampliconandavrD1

PSA菌株快速鉴定引物

引物序列Sequence（5'-3'）

CACGATACATGGGCTTATGCCTTTTCATCCACACACTCCG

GGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGATTCCCGAAGGCACTCCTCTATCTCTAAAG

TATTACCCTGATGAGCTCGAGATGATCGACCTTGTTGACCTCCCGTCCCCCCGGGAGGAAATTCAATGAAGATTAAACTGCAGTCAGGGGACGACTGTCTCTTTTGCTTTGCACACCCGATTTTCACGCACCCTTCAATCAGGATGACCTGGTGAAGTTGGTCAGAGCCGCACCCTTCAATCAGGATGTTTCGGTGGTAACGTTGGCATTCCGCTAGGTGAAAAATGGG

参考文献Ｒeference［34］［31］［35］［36］［37］［37］［38］

PCＲprimersforrapiddetectedPSAstrains产物大小/bp

Productsize

4927621098800280175492226

4病原菌致病力

K）。该病原菌在过去仅感染美味猕猴桃系的海沃德品种，但近年来在中华猕猴桃系的Hort16A上也

［11，41］

，给韩国的猕猴桃产业带来严重经济损有发现

失。MLST（多位点序列分型）的研究结果表明，该病原菌含有一个编码冠菌素（coronatine）的质粒转

近年的研究发现，目前全世界分布的PSA菌株有4种致病力和基因型存在明显差异的群体。其中类群Ⅰ是1984－1989年和1992－2008年分别在日

［42-43］

。但缺失了编码菜豆毒素的基因本和意大利海沃德品种上采集的病原菌（简称PSA-载基因，

J），类群Ⅲ是自2008年以来在意大利、新西兰、法这个类群中的菌株都含有编码菜豆毒素（Phase-olotoxin）的基因。该类群在日本已造成严重的经济国、西班牙和葡萄牙等国家对当地猕猴桃产业造成

损失，但在过去20年对意大利的猕猴桃产业并未带

［17，39-40］

。这表明相同的病原菌在不同的来显著影响

气候环境及农艺栽培方式下，其侵染传播能力存在较大差异。

V）。该病原菌对毁灭性打击的病原菌（简称PSA-中华系黄肉猕猴桃品种的危害明显高于美味系绿肉

J、PSA-猕猴桃品种。2011年，国外学者分别对PSA-

K和意大利采集的PSA-V菌株进行持家基因cts的

PCＲ分析，J和PSA-K类群Ⅱ是仅在韩国发现的病原菌（简称PSA-测序和ＲEP-结果表明PSA-

同属于一个单倍体型，但目前在意大利肆虐的PSA-说明产生毒素并不是PSA病菌侵染的必须条

［48-51］

V菌株属于另一个不同的单倍体型［44-45］。。该毒素的结构与作用机制还有待研究。件

2011年，Marcelletti等［33］对1984年采集自日1992年采集自意大利的PSA-J及2008年采集本、

V菌株分别进行自意大利Hort16A品种上的PSA-PSA基因组的了基因组框架图分析，研究结果表明，

V较大小为6Mb左右，共编码5670个基因；PSA-PSA-J菌株编码了4个额外的效应器蛋白，获得了1

个160kb的质粒以及前噬菌体序列，但缺少了1个50kb的质粒、编码菜豆毒素的基因簇以及argK毒

Mazzaglia等［46］对中国、素基因。2012年，日本、韩国、意大利、新西兰及葡萄牙的PSA菌株进行了基

因组全测序分析，研究结果表明，中国与新西兰、欧洲的PSA菌株核心基因组几乎完全一致，并指出新西兰及意大利的PSA菌株可能是通过不同途径分Butler等［47］也指出新西别从中国引进。2013年，

兰、意大利及智利的PSA菌株可能来源于中国陕西地区。

类群Ⅳ是目前仅在新西兰南岛的少数果园和澳

LV）。该大利亚部分区域发现的病原菌（简称PSA-病原菌致病力较弱，仅在叶片上形成病斑。MLST

与受体蛋白分析也显示，该类群与前三者之间存在着明显的差异。

2011年张立新等［28］调查了安徽、在中国，重

［43］

5病原菌侵染机理

PSA病原菌能快速侵染猕猴桃植株，并在短时间内大规模地流行爆发，与其侵染机理密不可分。

NO（一氧化氮）本身作为一种信号因子，首先，可诱导寄主植物合成一系列与抗病相关的化合物，在植物的抗病防御中起着重要的作用，但PSA菌株可以抑制寄主的NO代谢能力，从而提高PSA病原菌在

［52］

PSA-J与PSA-寄主中的定植及生长能力；其次，

K病原菌均已对高铜制剂产生了一定的抗性［53-54］，

［55］

如2002年Nakajima等发现1984－1987年采集的PSA菌株内仅含有抗铜因子copA和copB，但经过长时间使用了高铜制剂进行防治后，病原菌产生了2PSA菌株可以种新的抗铜因子copＲ和copS；第三，产生一种脱水酶蛋白，用以抑制抗菌素的活性，目前J与PSA-K病原菌对链霉素具的研究已证实PSA-［56-58］

；第四，PSA菌株含有一系有非常明显的抗性

列编码含铁物质的基因，如荧光嗜铁素、血晶素及肠

菌素等，从而可以有效地摄取及利用寄主植物中的铁离子，增强毒力效应

；最后，PSA菌株可以降解木质素衍生物及相关酚类物质，如氨基苯甲酸盐、

［59-60］

陕西等地的12个代表性猕猴桃溃疡病菌株的致庆、

结果表明来源于安徽的2个菌株致病力最强，目前，对PSA病原菌的侵染途径也正在开展一病力，

而来源于安徽、重庆和陕西的其他菌株致病力较弱。些新的研究，如新西兰学者认为本国现在大规模流

V病原菌应该是由于进口国外带菌花粉这说明在中国猕猴桃溃疡病菌种群的致病力也存在行的PSA-一定分化，有必要进行更深入的研究，且在进行猕猴

桃抗病品种筛选时，应采用致病力最强的标准菌株作为试验材料。

目前，学者们对PSA菌株的致病因子也进行了一些深入研究，如部分PSA菌株可以产生菜豆毒这一毒素会可逆性地抑制鸟氨酸氨基甲酰转移素，

酶（OCTase）的活性，阻碍精氨酸的生物合成，致使猕猴桃植株叶片上产生黄色的病斑；随着病变的加

而引进的，并已经开展花粉热处理等相关试验，以期在保持花粉活力的前提下降低PSA病原菌的侵染

［38，63-64］

（http：//www．kvh．org．nz）。2011年Mar-力

celletti等［33］的研究结果表明，PSA病原菌在已修剪

原儿茶酸、扁桃体酸及苯酚等，有利于病原菌在寄主

［61-62］

。体内的定植生长

的猕猴桃枝条和嫩枝中仍有侵染能力并延至修剪后

的第45天，故对感病枝条应尽快销毁。同时，研究PSA菌株还可能会附生在没有病征的结果还表明，果实、花朵、叶片及根中进行传播，但该结果还有待

［64-65］

。深，毒素被氨肽酶水解，从而产生PSOrn，导致OC-进一步证实

Tase的活性不可逆地被抑制且大大降低，毒素在植

PSA菌株物组织中的代谢能力也显著增加。同时，基因组也含有一种基因（argK），可编码一种ＲOCT6．1酶降解该毒素对自身的毒害作用。但是，并非所有的PSA菌株都会产生该毒素，如最近在意大利肆虐

6病害发生流行规律

病害发生与栽培品种的关系

猕猴桃栽培品种间抗病性差异很大，因此，种植

抗病品种是降低猕猴桃溃疡病危害最有效的途径之

V菌株已被证实不含产生该毒素的基因簇，一［3］，的PSA-应刻不容缓地开展猕猴桃栽培种质抗病性研

究，筛选可靠且性状优良的抗病品种。

新西兰学者目前已经着手对本国的猕猴桃品种

初步研究结果表明红进行系统的溃疡病抗性鉴定，

酚类物质含量也可作为猕猴桃细菌性溃疡病抗病鉴

定的指标。

［76］

2009年，在基础分子水平研究方面，李淼等

利用ＲAPD技术发现抗溃疡病品种都可扩增出1条

Hort16A、Gold3、Gold9、阳感病率最高，海沃德的感

病率逐渐降低。同时，用美味系抗病品种与经济价1458bpDNA片段，而感病品系均没有此带，因此，值较高的中华系黄肉品种杂交，获得一批优良的杂交抗病品种如Green14。意大利、新西兰和韩国的学者在调查中也发现，中华系列猕猴桃Hort16A等在当地的感病程度明显高于美味系列的海沃德。在

［66］

这段DNA片段可能与抗溃疡病基因有关，可以用于

抗病品种的初步筛选。但是对于分子标记所得到的特异性条带，是否真实可靠地与抗病性相关，应该做抗病基因的克隆及结构分析、转化和转基因植株栽

2000年张学武等的研究结果表明，中国，秦美溃培和抗性评价等试验进行验证。

疡病发病最严重，而秦香、秦翠发病率很低；2004年6．2病害发生与气候因素的关系李淼等发现金魁为抗病品种，早鲜次之，魁蜜再次之，华美2号、海沃德中感病，秦美、金丰最感

［68］［69］

病；2009－2011年，申哲等和高小宁等的研究结果表明，红阳感病率最高，海沃德、亚特及秦美感病率依次降低，徐香最低。但由于各项研究采用的操作和统计方法存在差异，且植株的生长环境、园区管理水平不同，因此，暂无法对各个品种的抗感病能力做出客观评价。

目前，国内外对猕猴桃抗病品种机理方面的研究还比较少，只有中国基于猕猴桃的形态学、细胞学及生理生化等特征进行了部分研究报道。在形态学

［5，70］

2002－2003年，方面，李淼等研究发现通常枝条

［67］

猕猴桃细菌性溃疡病的发生与气候的关系密

Serizawa和Ichikawa［16］证实了在意大切。1993年，

利早春时节的多雨、高湿和低温（12～18℃）气候有

利于PSA病原菌的快速繁殖，当温度升高至25℃，病原菌的危害减弱。

2011年，Marcelletti和Scortichini［40］的研究结果表明，冬季和早春时节的冰霜及风暴对病原菌的侵染起着重要作用，且相对而言，中华猕猴桃比美味猕猴桃更不适合在冰霜风暴严重的区域种植。新西兰学者也指出，猕猴桃细菌性溃疡病对新西兰造成严重损失的原因与其所处地理位置以及温暖湿润的海洋性气候特点有关。新西兰全年温度为9．5

皮孔和叶片气孔分布密度越低且气孔越小、叶片越～18．4℃，年降水量为1668mm，水量分布均衡，常

V生长［77］。品种的抗病性越强，枝条角质膜及皮层后壁细胞年无干旱，这样的气候特别适合PSA-厚，

2002－2003年，在中国也有研究表明猕猴桃细壁的厚度也与品种的抗性呈正比。2007－2008年，张小桐

［72］

和李庚飞等进一步的研究表明，一年

生枝条皮孔的长度、宽度、长×宽×深度及密度的比

［71］

菌性溃疡病发生的早迟、危害程度与极端低温出现

的早迟和低温程度关系密切。当极端低温达－12℃以下时，此年将成为重病年或严重病年；当旬平均气温达20℃时，病害停止蔓延危害。猕猴桃细菌性溃疡病的发生与无霜期的长短也存在一定的关系，霜冻时间长，树体容易受冻伤，树势也就相对衰弱，从而对病害的抗性降低，有利于病原菌的侵入和危［78-79］

。另外，由于海拔越高，冬季温度越低，冻害害

越严重，因此，海拔600m以上的园区病株率显著高

［19］

于海拔600m及以下的园区。

值越大，品种抗性越差；皮孔底部的木栓形成层越平坦厚实，枝干部皮层薄细胞平均长度、宽度越短，品2005年，种抗性越强。在生理生化研究方面，李淼［73］等发现感病前后，抗病品种中过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物岐化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）酶活的增加幅度高于感病品种，但蔗糖酶、α-淀粉酶活的增加幅度则低于感病品种，因此，可采用对不同

品种的酶活进行分析来鉴定其对猕猴桃溃疡病的抗6．3病害发生与农艺性状的关系

［74］

病指数。2008年，李庚飞等认为品种的抗病能通过对多地不同树龄发病情况的调查发现，一力与夏、秋、春季植物枝条韧皮部内的酚含量呈正年生猕猴桃幼树无细菌性溃疡病发生；随树龄的增

［75］比。2009年，李淼等发现未感染溃疡病菌前，抗病品种一年生枝条、叶片组织中酚类物质、可溶性蛋

大，树体的营养消耗增大，树势逐渐衰弱，对病害的

抗性降低，溃疡病的发生率和感病指数都随之增加

［78］

白、可溶性总糖及木质素含量显著高于感病品种，因

此，不同品种的可溶性蛋白、可溶性总糖、木质素及

。猕猴桃雌雄株间溃疡病的发生存在明显差

异，雄株发病较严重，而雌株发病较轻，其原因可能