玉米赤霉烯酮降解酶ZLHY6活性影响因素研究

粮油食品科技第21卷2013年第3期

生物工程

玉米赤霉烯酮降解酶ZLHY6活性

影响因素研究

1，22232

郝小龙，常晓娇，伍松陵，吴子丹，孙长坡

(1．河南工业大学生物工程学院，河南郑州450001;2．国家粮食局科学研究院，北京100037;

3.国家粮食局，北京100038)摘要：以玉米赤霉烯酮降解酶ZLHY6为研究对象，采用高效液相色谱(HPLC)法，检测玉米赤霉pH值、烯酮(ZEN)的降解率，考察温度、金属离子对酶活性的影响。结果表明，该酶最适反应温度

2+

为37℃;酶降解反应的最适pH值为8．5，并对酸性环境有一定耐受能力;Mg对该酶有激活作用，Cu2+、Mn2+、Co2+、Ca2+对该酶有抑制作用。

关键词：玉米赤霉烯酮;降解酶;温度;pH值;金属离子中图分类号：TS201．3

文献标识码：A

文章编号：1007－7561（2013）03－0099－03

StudyonthefactorstoaffecttheactivityofzearalenonedegradingenzymeZLHY6

2

HAOXiao－long1，，CHANGXiao－jiao2，WUSong－ling2，WUZi－dan3，SUNChang－po2（1．CollegeofBioengineering，HenanUniversityofTechnology，ZhengzhouHenan450001；

2．AcademyofStateAdministrationofGrain，Beijing100037；

3.StateAdministrationofGrain，Beijing100038）

Abstract：Thedegradationrateofzearalenones（ZEN）wasdeterminedbyhigh－performanceliquidchro-matography（HPLC）withZLHY6aszearalenonedegradingenzyme．Theeffectoftemperature，pHandmetalionsonenzymaticactivitywasstudied．Theresultsindicatedthattheoptimumreactiontemperature

ofzearalenonedegradingenzymeswas37℃；theoptimumpHforenzymatichydrolysisreactionwas8．5，andthedegradingenzymehadacertaintolerancetoacidity．Mg2+hadactivationbutCu2+、Mn2+、Co2+、Ca2+inhibitedtheactivityofthedegradingenzyme．

Keywords：zearalenone；degradingenzyme；temperature；pH；metalionAbilityZEN）是由禾谷镰玉米赤霉烯酮（zearalenone，

克地镰刀菌（Fusari-刀菌（Fusariumgraminearum）、umcrookwellense）、黄色镰刀菌（Fusariumculmorum）等多种镰刀霉菌产生的次级代谢产物，广泛污染全

是世界上污染范围最广泛的真球谷物及农副产品，

菌毒素之一，具有很强的生殖毒性和致畸、致癌作［1－2］

，给人类和动物健康造成了极大的危害。每用

年因毒素污染造成数千亿美元的经济损失，因此研究ZEN的去毒方法具有重要经济意义。

ZEN的去毒方法可以分为物理、化学和生物三大类，由于传统的物理和化学方法有一定的局限性，易改变食品的品质，造成营养物质的流失，以及存在化学残留等缺点，所以欧盟不允许在食品生产过程中应用化学方法消除真菌毒素。生物学方法与传统的物理、化学方法相比具有解毒专向化、反应条件温

收稿日期：2012－10－12

基金项目：国家重点基础研究发展计划（2013CB127805）

1988年出生，作者简介：郝小龙，男，在读硕士．1975年出生，通讯作者：孙长坡，男，博士，研究员.

和、无化学残留等优点，日益成为研究热点并取得了

［3］［2］

一些进展。2004年Naoko等从粉红粘帚霉（clonostachysrosea）IFO7063菌株中克隆到一段大小为30Kd的内酯水解酶基因zhd101，该酶能将ZEN

［4］

降解为无毒物质。Orsolya等从白蚁肠道中分离到一株酵母菌，经高效液相色谱（HPLC）检测该酵母24h能完全降解ZEN。

［5］

国内相关的研究较少，刘海燕等于2011年从粉红粘帚霉中克隆到玉米赤霉烯酮降解酶基因zl-hy6，构建了pPIC9K－zlhy6表达载体，导入毕赤酵母（GS115）中得到表达的玉米赤霉烯酮降解酶ZL-HY6，本试验在对该酶进行诱导表达后，考察了温

pH值、度、金属离子对降解酶活性及稳定性的影响。

1材料与方法

1．1材料

1．1．1主要仪器pp－50型pH计：sartorius；HH．S11－Ni3B型电热恒温水浴锅：北京长安永创科学仪器有限公司；Multitron2型恒温震荡培养箱：IN-FORS；VCX130型超声波细胞破碎仪：SONICS；Wa-

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terse2695型高效液相色谱仪：Waters。1．1．2主要试剂氯霉素、异丙基－β－D－硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）：Genview公司；氨苄青霉素、咪唑、玉米赤霉烯酮：Sigma公司；色谱级甲醇、乙腈：迪马公司；分析纯三羟甲基氨基甲烷（Tris）：Bio－Rad公司；其他试剂均为国产分析纯：北京鼎国。

1．1．3试验菌株导入玉米赤霉烯酮降解酶基因

由本试的重组大肠杆菌E．coliRossetta菌株ZPR6，

验室构建并保藏。1．2方法

1．2．1ZEN降解酶ZLHY6的表达及纯化降解酶

将菌株ZPR6接种于的诱导表达：按1%接种量，

200mL含氯霉素和氨苄青霉素（终浓度分别为20、100μg/mL）的Luria－Bertani（LB）液体培养基中，220r/min37℃培养2h，加入IPTG（终浓度为0．8%），150r/min18℃培养过夜。

降解酶的纯化：使用GE公司组氨酸标记亲和

TM

柱HisTrapHP对菌株ZPR6诱导表达的ZEN降解酶进行纯化，具体操作为：（1）发酵液预冷至4℃，

8000后续试验均控温在4℃；（2）发酵液于4℃、

r/min下离心10min，弃上清；（3）菌体称重，每克菌

使菌体悬浮，超声细胞破碎体加5mL结合缓冲液，

仪破碎菌体（超声时间10min，功率91W，间歇式超

12000r/min声，作用、间歇时间各10s）；（4）4℃，

离心10min，上清液过0．45μm水相滤膜，除去菌体碎片；（5）5倍柱体积纯水冲去亲和柱中残留的乙醇；5倍柱体积结合缓冲液以1mL/min流速平衡亲和柱；以0．5mL/min流速注入样液31．6mL；5倍柱体积结合缓冲液以1mL/min流速冲洗亲和柱；5倍柱体积洗脱缓冲液以1mL/min流速洗脱降解酶；纯化得到的酶液4℃保存。

1．2．2ZEN降解率的测定参照GB/T23504—2009方法，ZEN降解率的计算公式检测ZEN含量，

为：ZEN降解率（%）=（空白对照组含量－样品组含量）÷空白对照组含量×100

1．2．3温度对降解酶活性的影响通过研究不同温度条件下ZEN的降解率来考察温度对降解酶活性的影响，降解率越高说明酶活性越强，具体参数见

酶解反应时间为60min，沸水浴10min终止酶表1，解反应。

表1

温度/℃空白对照组样品组

温度对降解酶活性影响的试验设计

253037455035μgZEN+20μL去离子水+980μL洗脱缓冲液35μgZEN+20μL纯化酶液+980μL洗脱缓冲液

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Tris－HCl缓冲液；用一定pH值的Tris－HCl缓冲

分别测定不同pH值液代替表1中的洗脱缓冲液，

条件下的ZEN降解率。

1．2．6金属离子对酶活性的影响分别配制0．01M的8种金属离子溶液，使金属离子终浓度达

［6］

到1mmol/l；在最适温度下反应，具体参数见表2，其他条件均不变；以1．2．4中最适温度下，酶的降解

考察金属离子对降解酶活性的影响。率为空白对照，

表2

金属离子

金属离子对降解酶活性影响的试验设计

Mg2+Ca2+K+Co2+Cu2+Fe2+Mn2+Zn2+35μgZEN+880μL洗脱缓冲液+20μL去离子水

空白对照组

+100μL金属离子溶液样品组

35μgZEN+880μL洗脱缓冲液+20μL纯化酶液

+100μL金属离子溶液

2

2．1

结果与分析

温度对降解酶活性的影响

按照1．2．3的方法考察温度对降解酶活性的影响，结果见图1，从图中看出随着反应温度升高，酶

当温度达到45℃，该酶活性受到抑活力逐步提高，

温度升到50℃，酶活性受到强烈抑制，可知该降制，

解酶适宜反应温度在30～45℃之间，可以此为依据来进一步确定ZEN降解酶的最适反应温度

。

图1温度对降解酶活性的影响

2．2

最适反应温度

依据1．2．4的方法考察细化后温度对降解酶活

结果见图2，从图2可知当温度低于性的影响，

37℃随着反应温度升高，酶活力逐步提高，当温度高于37℃，该降解酶活性就会受到抑制，随着温度升高抑制作用逐步增强，故可知该降解酶最适反应温度为37℃

。

1．2．4酶解最适反应温度根据1．2．3的结果进一步细化温度梯度，其他条件均不变，测定ZEN降解率，降解率最高的反应温度即为酶解最适反应温度。1．2．5pH值对降解酶活性的影响分别配制pH

4．5，5．5，6．5，7．5，8．5，9．0的0．1M的值为3．5，图2最适反应温度对降解酶活性的影响

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起反应速率的改变。温度对酶促反应具有双重影响，升高温度可加快酶促反应速率，同时也会增加酶变性失活的机会。在一定温度范围内，酶催化反应的速率随温度升高而加快，若温度继续升高，酶活

［8］

性反而下降，从而导致酶催化反应速率的下降。从试验结果来看，该降解酶最适温度为37℃，同时

低于此温度时，酶活力和可耐受一定温度（37℃），

热稳定性较好。这为利用该酶降解粮食、饲料中的玉米赤霉烯酮含量，降低其危害提供了一定的理论基础。

3．2pH值对降解酶的影响

酶分子表面的许多极性基团，在不同的pH值条件下解离状态不同，酶活性中心的某些基团往往仅在某一解离状态时才容易与底物发生结合，因此pH值的改变影响底物与酶的亲和力。此外pH值

从而影响酶的活还可影响酶活性中心的空间构象，

pH值是影响酶活性和稳定性的重要因性。因此，

［8］

素。从试验结果可知，该降解酶对酸性环境具有一定的耐受性，但其活性会受到抑制；该降解酶最适pH值为8．5，碱性环境可激活其活性，表明该降解酶有良好的工业应用前景。

3．3金属离子对降解酶的影响

金属离子能够激活或者抑制降解酶的活性；Mg2+对降解酶有激活作用，考察的其他金属离子有抑制作用，但其抑制作用并不明显，表明该酶对金属离子有一定程度耐受作用，这些研究将为ZEN降解酶的高效利用提供帮助。参考文献：

［1］LabudaR．，ParichA．，BerthillerF．，etal．Incidenceoftrichoth-ecenesandzearalenoneinpoultryfeedmixturesfromSlovakia［J］．In-2005，（105）：19－25．ternationalJournalofFoodMicrobiology，

［2］NaokoT．A．，ShuichiO．，TakehikoS．，etal．Metabolismof

zearalenonebygeneticallymodifiedorganismsexpressingthedetoxi-．AppliedandEnvironmentalficationgenefromclonostachysrosea［J］Microbiology，2004，70（6）：3239－3249．

［3］．中国熊凯华，程波财，胡威，等．玉米赤霉烯酮降解研究进展［J］

2010，25（1）：138－142．粮油学报，

［4］OrsolyaMolnar，GerdSchatzmayr，ElisabethFuchs，etal．Trichosporon

mycotoxinivoranssp．nov．，Anewyeastspeciesusefulinbiologicaldetoxificationofvariousmycotoxins［J］．SystematicandAppliedMi-2004．27（6）：661～671．crobiology，

［5］刘海燕，孙长坡，伍松陵，等．玉米赤霉烯酮降解酶基因的克隆及在

J］．中国粮油学报，2011，26（5）：12－17．毕赤酵母中的高效表达［

［6］pH值和金属离子对不同果实转高旭，王永章，李培环，等．温度、

J］．天津农业科学，2010，16（3）：16－19．化酶活性的影响［

［7］．中国张予辉，张永安．导入外血对本地牦牛复壮的效果分析［J］

2006，32（5）：28－29．牛业科学，

［8］BergJM，TymoczkoJL，StryerL．Biochemistry5thed［M］．New-［6］

2．3

pH值对降解酶活性的影响

按照1．2．5的方法考察pH值对降解酶活性的影响，反应温度为37℃，反应时间为60min，由图3可知在酸性环境下，该降解酶的活性受到强烈抑制，pH值为3．5的缓冲体系下，ZEN的降解率仅为6．4%；随着pH值升高，pH值其酶活力逐步增强，

ZEN降解率为同样反应条件，为8．5的缓冲体系下，

98．2%。

由于ZEN在碱性条件下其酯键打开结构遭到破环，会直接造成ZEN的降解，而且ZEN是不溶于碱性溶液的，当pH值升高到9．0，样品和空白对照高效液相色谱（HPLC）均检出ZEN，由此可见，在该pH值条件下降解酶遭到破坏。故可得出该降解酶最适pH值为8．5。

图3pH值对降解酶活性的影响

2．4

金属离子对降解酶活性的影响

金属离子对于酶活性的影响是多方面的，其通

构成酶的辅基或作为酶的活化剂过参与酶的组成、［7］

等途径影响酶的活性。根据1．2．6的方法考察金属离子对降解酶活性的影响，结果如图4所示，Mg2+对降解酶活性有激活作用，提高7．6%，其他金

2+2+2+Co、Cu、Mn、Ca2+、属离子均有抑制作用，

Fe2+、Zn2+、K+抑制百分数依次为28．2%、25．9%、25．8%、21．4%、20．2%、17．2%、15．6%，其中Co2+、Cu2+、Mn2+抑制作用较K+、Zn2+明显。

图4金属离子对降解酶活性的影响

3

3．1

讨论

温度对降解酶的影响

温度的改变会使酶与底物的碰撞发生改变而引

York：W．H．FreemanandCompany，2002．●