明胶抗氧化多肽制备的酶法筛选和响应面优化

粮油食品科技第21卷2013年第3期

生物工程

明胶抗氧化多肽制备的酶法筛选

和响应面优化

1，22

张小强，董文宾

(1．咸阳师范学院，陕西咸阳712000;2．陕西科技大学化学与化工学院，陕西西安710021)

－

要：通过对六种酶水解明胶产物水解度(DA)和清除O2·功效的比较，筛选中性蛋白酶为水解用酶。进一步在单因素实验的基础上，通过响应面实验优化得到最佳酶解条件为温度43．65℃，pH值6．25，时间3．29h，酶含量3%(W/W)。在此条件下水解明胶，对酶解产物进行体外超氧阴离

摘

子清除活性分析，理论清除率为72．01%，实验值为71．15%。

关键词：猪皮明胶;水解度;中性蛋白酶;响应面分析;超氧阴离子自由基

中图分类号：TS201．2文献标识码：A文章编号：1007－7561（2013）03－0095－04

Enzymaticpreparationofgelatinantioxidantpeptideandoptimization

byresponsesurfacemethod

ZHANGXiao－qiang1，DONGWen－bin2

（1．XianyangNormalUniversity，XianyangShanxi712000；

2．CollegeofChemistryandChemicalEngineering，ShaanxiUniversityofScience＆Technology，

Xi'anShanxi710021）

－Abstract：DAandO2radicalscavengingrateof6kindsofgelatinenzymatichydrolysatewerecompared

andneutralproteasewaschosentohydrolyzepigskingelatin．ThehydrolysisconditionswereoptimizedbywhichwaspH6．25，alcalasecon-responsesurfacemethodologyonthebasisofsinglefactorexperiments，

－

tent3%（W/W）at43．65℃for3．29h．Underthecondition，theO2·scavengingrateofthehydrolyzatewasupto72．01%，andtheexperimentalresultwas71．15%．

Keywords：pigskingelatin；degreeofhydrolysis；neutralprotease；responsesurfacemethodology；superox-ideanionfreeradical

－O2·是生物活性最高的氧中心自由基之一，是

本身性质不太活泼，生物体系中自由基产生的根源，但产生时间早，寿命长，危害大，可以发生歧化反应、

－

单电子还原和氧化反应等。过量的O2·还会引起生物大分子过氧化等损伤，从而对生物膜等许多结构造成损害。所以，考察物质清除超氧阴离子的能力可作为体内抗氧化性能的重要指标之一。目前，

［1－3］

（如酪蛋白、已有应用食品源蛋白大豆蛋白、花

生蛋白、玉米蛋白、鱼骨胶原蛋白等）制备抗氧化活性肽的相关研究报道，许多实验证实水解度（DA）和抗氧化活性存在一定的关联。但是，猪皮明胶由于在体内条件下难消化、必须氨基酸组成有缺陷、蛋白质生物价很低、直接食用口感不好，在食品中主要利

收稿日期：2012－10－10

基金项目：咸阳师范学院科研基金重点项目（12XSYK083）

1970年出生，作者简介：张小强，男，陕西咸阳人，博士生．

用其理化性质改善食品质构，很少被用作补充蛋白

质营养的原料，以猪皮明胶为来源制备食用抗氧化肽的研究尚少见报道。

1

1．1

材料与方法

材料与试剂

食品级明胶：山东淄博宝恩生物科技有限公

胰蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性司馈赠；胃蛋白酶、

蛋白酶、中性蛋白酶：Wolsen；木瓜蛋白酶：北京

奥博星生物科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯。1．2

仪器

FA1004电子分析天平：上海精密科学仪器；JB－1型磁力搅拌器；756PC紫外可见分光光度计：上海雷磁新泾仪器公司；HHS21－6恒温水浴锅：北京长安科学仪器厂；SHA－B水浴恒温振荡器：北京

瑥瑝

生物工程

东南仪城实验室设备有限公司；ROTINA35台式离心机：德国Hettich；LGJ－10冷冻干燥机：北京四环科学仪器厂。1．3

试验方法

1．3．1明胶活性肽的酶法制备

依据相关文献

［4－5］

粮油食品科技第21卷2013年第3期

2%、3%、4%、5%、6%），2、3、4、5、酶解时间（1、

6h），35、40、45、50、55℃）对该指标酶解温度（30、的影响并确定各自最佳反应条件。每次试验重复3次，结果取平均值。（3）响应面（ResponseSurfaceMethod，RSM）试

－

验。根据单因素试验结果，选取对O2·清除率影响较大的酶解液，以pH（A）、温度（B）、时间（C）和酶

O2－·清除率为响应含量（D）4个因素作为自变量，

值，采用Design－Expert8．2．B软件设计4因素3水平试验并分析试验结果。

、酶结构特点和pH分类，用

缓冲液在80℃溶解明胶，然后在酶最适活力条件下水解明胶，水解完成后100℃加热25min灭酶，水解液用高速冷冻离心机离心、过滤，澄清后超滤机筛选分子量低于5K的上清液备用。1．3．2

猪皮明胶肽水解度和清除超氧阴离子自由

［6－7］

2

2．1

结果与分析

蛋白酶的选择朱夕波

［9］

基能力的测定

依据参考文献

，水解度的测定采用pH－

Stat法。采用邻苯三酚自氧化法测定猪皮明胶肽对

－

O2·的清除能力。参考文献［8］中的方法于15mL

4．5mL，试管中依次加入4．0mL去离子水，50mmol/l，pH值8．2的Tris－HCl缓冲液，0．2mL25℃保温10min。取出后迅速加入明胶肽，混匀，0．3mL，25℃保温10min的邻苯三酚溶液（3mmol/l，10mmol/lHCl配制）。混匀后立即在320nm下每隔30s测1次吸光值，记录4min内吸光值的变化，回归求出吸光度的变化斜率。空白管中用去离子水代替样品溶液，以10mmol/lHCl代替邻苯三酚用以吸光值调零。清除率计算公式为：清除率=

（k0－k）

×100%，式中：k0为空白管吸光k

采用胃蛋白酶→木瓜蛋白酶→菠萝

酶解液抗氧化活性蛋白酶复合水解猪皮胶原蛋白，

不存在统计学差异性变化，主要表现在水解时间的

［10］

经济方面。余东华选用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶解液清除O2·功效虽酶分步水解猪皮胶原蛋白，

有一定改善，同样不存在统计学差异，主要表现在水解度提高。结合以上两人的研究成果，本研究确定应用单酶水解的方式。

酸性蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶按照表1条件酶解所得

－

的酶解液水解度测定结果如表2，明胶肽清除O2·功效见图1。本实验中，酶解明胶目的是制备具有抗氧化活性的小肽，因此，以清除自由基能力为第一指标，水解度为第二指标进行研究。分析表2和图

－1数据，筛选清除率O2·效果最好，酶解时间最少，酶用量经济的酶为进一步水解用酶。在各自最适活性条件下，胰蛋白酶酶解物在水解时间段内的清除

中性蛋白酶和酸性蛋白酶的酶解物均作用都较小，

表现出相对较高的清除能力。虽然中性蛋白酶水解

－

k为样品管吸光度变化斜率。度变化斜率，1．3．3

明胶肽酶解工艺的优化

（1）蛋白酶种类的选择。本试验选用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶6种蛋白酶分别在其最适条件下对明胶进行酶解，试验条件见表1。

表1

酶胃蛋白酶胰蛋白酶木瓜蛋白酶酸性蛋白酶碱性蛋白酶

酶活性/（U/g）3200025000500006000020000

不同酶解明胶工艺条件原料浓度/%

555555

酶含量

pH值/%555555

2．08．06．53．08．06．0

温度/℃373760406037

增力电动搅拌（40W，3000r/min）辅助条件

但中性酶来源于微生物代谢，价格便宜，酶度较低，

活性较动植物来源酶高，尤其是在较低浓度下表现出高于其他酶解物的水解活性。而且中性蛋白酶达

不同时间清除功效差异大，到最大清除率的时间少，

可以通过条件优化达到更好的酶解效果。因此，选定中性蛋白酶作为水解酶用于单因素及响应面优化试验的研究。

表2

水解酶胃蛋白酶酸性蛋白酶中性蛋白酶

明胶不同酶解产物的水解度

时间/h

11．41．562．1410．3315．477．06

26．151．643．0816．2220．328．57

38．462．165．2317．4920．8913．01

46．483．486．6917．5725．3810．88

57．791．629．6720．4436．739．38

68．340．0579．7130．1634．516．30

%

中性蛋白酶500000

（2）单因素试验。在前期工作基础上，选择中

－

性蛋白酶为水解用酶，以O2·清除率为指标，分别3、4、5、6、7），考察不同的pH值（2、酶含量（1%、瑝瑦

木瓜蛋白酶碱性蛋白酶胰蛋白酶

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生物工程

除率最大，继续水解酶进一步将抗氧化肽分解，促使

从而清除功效下降。活性肽浓度降低，

2．3响应面法优化中性酶解条件试验结果和分析

图2中清除率极大值出现的位置和单因子稍有不同，没有完全符合单因素试验，说明因素间有一定温度和pH值较低时，的相互影响。图2－a显示，清除率随着两者的增加，清除率快速上升；温度超过50℃时和pH值大于6．2以后，清除率不仅不增加反而下降。但是不管是温度还是pH值，他们的自

图1酶解明胶肽清除超氧阴离子功效

由基清除率均高于单因素实验中的功效，说明两者在一定的工艺条件下可以互补达到增加清除率的效果。图2－b同样显示，不同水解时间和不同的酶含量同样具有相互作用提高清除率功效的可能，所以，通过优化可进一步提高明胶抗氧化肽的得率。为此，应用DesignExpert8．0软件对工艺进行优化，结

pH值为果（如表3和图2所示）为：温度43．65℃、6．25、水解时间为3．29h、酶含量0．03，明胶酶解多

－

肽产物对O2·的清除率为72．01%。通过表4的

P＜0．001，方差分析可知，拟合性检验不显著，所得清除率的回归方程显著，说明此回归模型很理想。

从四个因素对清除率的影响来看，交差项之间的影响显著，各自间的交互作用显著，说明这四者的交互

－

作用对O2·清除率的影响相对较大。采用优化的酶解条件进行验证实验，为方便操作，条件设为：温pH值为6．2、水解时间为2．5h、酶含量度44℃、

－

0．03，经多次实验测得多肽产物对O2·清除率为（71．15±0．23）%，相对误差为0．0095，说明响应面法优化出的工艺可行。

表3

编号1234567891011121314151617

pH值7．57．57．57．514147．57．51417．5117．514147．5

响应面设计和结果

时间/h63．5613．53．513．53．53．5113．5613．56

酶含量0．0350．0350．060．010．0350．010．0350．0350．0350．010．060．0350．0350．010．0350．060．035

清除率/%0．470．690．620．540．310．370．510．710．350．670．490．620．650．630．390．370．57

温度/℃8055555580553055305555553055555530

2．2

酶解条件的单因素试验设计结果和分析依据前期实验结果，在其余因子较适合的酶解工艺环境下，研究中性蛋白酶在不同pH值、温度、

－时间、酶含量情况下水解物对O2·清除率的影响。（1）在水解温度为40℃、酶含量为4%、底物浓度为

4%的条件下，3、4、5、6、7时酶解明分别在pH值2、

53．96%，64．61%、胶，清除率分别为49．74%、70．38%、70．15%、63．7%。pH值为5时，水解酶活

pH清除率达到最大。（2）在酶含量为4%、性最大，

35、40、值5．5、底物浓度为4%的条件下，分别在30、

45、50、55℃时酶解明胶，清除率分别为48．01%、56．97%、62．3%、71．13%、70．03%，63．44%。45℃时的酶解产物对O2－·有较强的清除能力。根据可能奥博星公司提供的产品资料结合过度态理论，与中性蛋白酶的最适温度（40～45℃）有关，酶变性的活化能一般在210～630kJ/mol，低于或高于此温度，酶活力、稳定性都将受到影响，在相同酶解时间温度升高，酶活性减弱，生成抗氧化肽的产条件下，率降低，导致清除率降低。（3）在pH值5．5、温度底物浓度为4%的条件下，分别在酶含量为40℃、

2%、3%、4%、5%、6%时酶解，为1%、清除率分别56．58%、67．35%、70．91%、68．38%、为47．88%，

57．7%。底物浓度在每100mL0．04～0．05g之间，

－

酶解产物对O2·清除率达到最大；当质量浓度每100mL大于0．05g时，清除率下降。按照米氏理

论，在较低底物质量浓度时，随着浓度增加，利于原料较快和酶的活性中心结合，提高了酶切位点的数加快酶反应速率，有利于获得更多的明胶抗氧化量，

肽。但继续增加底物质量浓度，高浓度底物对反应具有抑制作用，过量的底物聚集在酶分子表面，形成另一种无活性的中间产物，抑制了蛋白酶解。此外，酶解过程中生成的产物也有可能抑制反应，从而影响明胶抗氧化肽的含量。（4）在酶含量为4%、温度pH值为5时，2、3、4、为40℃、测试在水解时间为1、5、6h时清除功效，61．4%、清除率分别为48．09%、71．12%、65．81%、52．01%、43．049%。在水解3h清

瑧瑝



生物工程

续表

编号18192021222324252627

pH7．57．517．57．51417．57．51

温度/℃30805555805555308080

时间/h3．53．53．53．51663．53．53．5

酶含量0．060．060．060．0350．0350．0350．0350．010．010．035

清除率/%0．590．520．640．720．470．370．620．610．530．

46

项目B2C2D2残差失拟性纯误差总离差

平方和0．0690．0350．0110．0140．0144．667E－0040．38

A2

0．11

粮油食品科技第21卷2013年第3期

1

0．11续表

自由度1111210226

方差0．0690．0350．0111．190E－0031．382E－0032．333E－004

5．92

0．1530

不显著

F值57．9829．589．58

P值＜0．00010．00020．0093

显著性

89．40

＜0．0001

3结论

不同酶水解明胶生产的活性肽抗氧化活性有差－

对O2·具有不同的清除作用，酸性蛋白酶和中异，

性蛋白酶功效最佳（不存在统计学显著性），碱性和胰蛋白酶清除功效弱于其他酶。但中性蛋白酶达到最大清除率所用时间较少，水解时间变化对活性肽生产影响较大，酶活力最大，可通过响应面法优化。

pH经实验获得的最佳生产工艺为：温度43．65℃、

值为6．25、酶含量为0．03，水解时间为3．29h，明胶

－

酶解多肽产物对O2·的清除率预计可达到

－

72．01%。依据优化工艺进行实验，对O2·清除率为71．15%。此外，水解前对原料先用缓冲液在较高温度预先溶涨，可提高底物浓度，水解中通过搅拌器搅拌，水解物通过超率法进行粗分，筛选分子量较小的肽段（＜5K），以上措施都可以不同程度提高

－

水解物清除O2·的功效。参考文献：

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J］．食品科技，2011，36（9）：271－275．脂质过氧化作用研究［

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图2表4项目模型A－pHB－温度C－时间

中性蛋白酶水解明胶制备活性肽的响应面优化清除O2－·单因子和优化实验回归方程方差分析表平方和

自由度141111111111

方差0．0260．190．0235．633E－0031．200E－0035．625E－0031．000E－0042．250E－0049．000E－0042．500E－0054．000E－004

F值21．73157．5318．934．731．014．730．0840．190．760．0210．34

P值＜0．0001＜0．00010．00090．05030．33520．05040．77690．67140．40160．88720．5728

显著性显著

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［D］．上海海洋大学硕士学位论文，2008．6．

［10］．华中农业余东华．猪皮蛋白两步酶解及其产物性质研究［D］

0．360．190．0235．633E－003

D－酶含量1．200E－003ABACADBCBDCD

5．625E－0031．000E－0042．250E－0049．000E－0042．500E－0054．000E－004

2011．6．●大学硕士学位论文，

瑝瑨