碱性蛋白酶水解小麦面筋蛋白制取谷氨酰胺肽的研究

碱性蛋白酶水解小麦面筋蛋白

制取谷氨酰胺肽的研究

1，2

马洪龙，韩

22

飞，李爱科，陈

光

1

(1．吉林农业大学生命科学学院，吉林长春130118;2．国家粮食局科学研究院，北京100037)要：采用单因素和正交实验研究碱性蛋白酶Alcalase酶解小麦蛋白获得高谷氨酰胺肽的优化

工艺。使用氨基酸分析仪测定肽中有效谷氨酰胺含量。结果表明:碱性蛋白酶Alcalase水解小麦摘

面筋蛋白的最适条件为pH8．0，温度70℃，酶浓度4%，底物浓度7%，反应时间150min。在此条件下，酶解产物中的有效谷氨酰胺含量为17．65%，占酶解样品中Glx(Gln与Glu之和，含量22．83%)的77．31%，三氯乙酸氮溶指数(TCA－NSI)为77．86%，蛋白含量76．03%，游离氨基酸含量2．06%，说明酶解产物的有效Gln含量高，且肽含量高。关键词：碱性蛋白酶;小麦面筋蛋白;谷氨酰胺;酶解

+

中图分类号：TS210．1；TS201．25文献标识码：A

文章编号：1007－7561（2014）01－0054－04

Studyontheproductionofglutamine－bioactivepeptidesby

hydrolysisofwheatglutenwithalkalineprotease

2

MAHong－long1，，HANFei2，LIAi－ke2，CHENGuang1

（1．SchoolofLifeSciences，JilinAgriculturalUniversity，ChangchunJilin130118；

2．AcademyofStateAdministrationofGrain，Beijing100037）

Abstract：Wheatglutenwashydrolyzedbyalkalineproteasetoobtainhighcontentofglutaminepeptideandthetechnicswasoptimizedbysingle－factorandorthogonalexperiment．TheeffectivecontentofGlninpeptidewasdeterminedbyaminoacidanalyzer．Theresultsindicatedthattheoptimalparameterstohy-drolyzewheatglutenwereasfollow：pH8．0，temperature70℃，enzymeconcentration4%，substrateconcentration7%，reactiontime150min．Undersuchconditions，theeffectivecontentofGlncouldreach17．65%，accountfor77．31%ofthetotalGlx（Glu+Gln，content22．83%），TCA－NSIwas77．86%，theproteincontentwas76．03%，thefreeaminoacidcontentwas2．06%．TheproducthadhighcontentoftheeffectiveGlnandthepeptide．

Keywords：alkalineprotease；wheatgluten；Gln；enzymolysisGln）是存在于体液以及谷氨酰胺（Glutamine，

骨骼肌细胞中最丰富的游离氨基酸之一复胃肠蠕动、营养肠道的重要作用

［1－2］

。有研

碱性蛋白酶Alcalase是一种内切酶，具有水解效率

［6］

高，对酰胺基团水解作用弱的特点，利用其水解小麦面筋蛋白可获得优质Gln肽产品。

目前，蛋白或肽中的谷氨酰胺的测定都基于双三氟乙酸基碘苯（Bis－trifluoroacetoxy－iodobenzene，BTI）保护非氮端的谷氨酰胺法，pH值在1～3时，双三氟乙酸基碘苯（BTI）与酰胺反应可经过Hofinalm重排生成相应的胺，而N端保护的Gln残基可转变

4－二氨基酸（L－2，4－diami-为对酸稳定的L－2，

nobutyricacid，DABA），此时天冬酰胺（Asn）转变成

L－2，3－二氨基丙酸，使蛋白质和肽中Gln的测定

［7］

成为可能。在此原理的基础上，使用高效液相

［8］

［6，9］

、氨基酸分析仪或超高效液相色谱仪（UP-

究表明，肠道是利用Gln最多的器官，同时Gln有恢

［3－5］

。但是Gln

单体在酸性条件下不稳定，加热易生成有毒的焦谷

氨酸，而Gln和其他氨基酸形成的二肽或多肽的溶解度和稳定性都比Gln单体好。Gln结合肽在医药、功能食品和特殊饲料中具有较好的应用前景。我国是小麦生产大国，但对小麦的深加工和转化研究较少。小麦面筋蛋白中的Gln含量高达30%，并且来源广泛，价格低廉，是生产Gln肽的理想原料。

收稿日期：2013－03－25

1987年出生，作者简介：马洪龙，男，吉林临江人，硕士研究生．

通讯作者：韩飞，女，副研究员．

中，用氨基酸分析仪测定谷氨酸的含量

肽中有效Gln含量按下式计算：

［9］

LC）［10］检测Gln含量。由于游离Gln或N端Gln不

［11］

氮端Gln或游离Gln在溶液中能转化成DABA，

［12－13］

，不能发挥极易发生环化生成有毒的焦谷氨酸

。

其作用，因而非氮端Gln被认为是有效Gln，该理论

也得到人们的广泛认可。本研究利用该方法测试酶解样品中的有效Gln含量，对碱性蛋白酶Alcalase水解小麦面筋蛋白进行研究，以获得制取Gln肽的最佳工艺条件。

有效Gln含量=（对照组Glu含量－BTI保护

组Glu含量）/样品总重×100%。

1．2．4三氯乙酸氮溶指数测定［15］

酸溶性蛋白提取：称取3g样品，加15mL20%

25℃下震荡2h后，的三氯乙酸（TCA），在4800r/min下离心10min，离心结束后取上清液。

［16］

使用凯氏定氮仪测定上清液中蛋白含量。三氯乙酸氮溶指数（TCA－NSI）含量计算公式如下：

1

1．1

材料与方法

材料与仪器

实验材料：小麦面筋蛋白（谷朊粉），河南中鹤集团；碱性蛋白酶Alcalase2．4L，诺维信公司。

TCA－NSI含量=上清液中的氮含量/样品中

总氮含量×100%。1．2．51．2．6

蛋白质含量测定

样品中Glx（Glu+Gln）含量及游离氨基酸

［9］

［17］

参照GB/T24318—2009，采用杜马斯燃烧法。

1－三氟乙酸基碘苯（BTI）、实验试剂：1，浓盐

酸、氢氧化钠、三氯乙酸、无水醋酸钠、柠檬酸钠、乙醇等均为分析纯，购于国药集团。

实验仪器：15L发酵罐，赛多利斯；喷雾干燥仪B－290，瑞士BUCHI；定氮仪2300，丹麦FOSS公司；氨基酸自动分析仪L－8800，日立公司；干燥箱PH070A，上海一恒科学仪器有限公司；氮吹仪，杭州奥盛仪器有限公司。1．2实验方法1．2．1

酶解反应步骤

pH值，发酵罐中加入5L水，设置实验温度、转

含量测定

总Glx测定：用水解管称取含蛋白7．5～25mg的酶解蛋白样品，加入酸解剂（6mol/LHCl）15mL，冲入氮气封口，放入110℃恒温干燥箱中，水解22～24h，冷却，混匀，开管，过滤，吸取200μL滤液，氮气吹干。加0．2mL纯净水，氮气吹干，重复此操作3～4次，用1mLpH2．2的稀释柠檬酸钠缓冲液振荡溶解，过0．45μm滤膜，经氨基酸分析仪测定。计算公式如下：

总Glx（Glu+Gln）含量=Glu含量/蛋白样品总重×100%。

游离氨基酸含量的测定：提取的酸溶性蛋白溶液，稀释100倍，过0．45μm滤膜，上机测定。计算公式如下：

游离氨基酸含量=游离氨基酸总含量/蛋白样品总重×100%。

速固定为400r/min。当条件达到设定值时，加入碱性蛋白酶，快速均匀加入谷朊粉，用2mol/L的NaOH调节pH值，保持整个酶解体系pH值恒定。反应一定时间，反应完毕后于85℃水浴10min，灭酶。灭酶完成后迅速放入冷水中降温至50℃，进行喷雾干燥，即得成品。1．2．21．2．3

水解度测定pH－star法［14］。

肽中Gln含量测定

谷氨酰胺的BTI保护反应：称取250mg酶解蛋白粉，用纯净水溶解定容至100mL，配制成2．5mg/mL的水解蛋白溶液，取100μL水解蛋白溶液，加入100μLBTI（10mg/mL）乙睛水溶液中，同时加入50μL50mM吡啶水溶液，混合均匀后充氮，加入到微量反应50℃反应4h后，瓶（2mL），氮气吹干备用。

在上述氮气吹干样品中加入200μL6mol/LHCl，110℃水解24h，充氮气后，作为BTI制备样；再取100μL2．5mg/mL水解蛋白溶液置于微量反应瓶中，氮气吹干，加200μL6mol/LHCl，同样置于110℃烘箱中水解24h，作为对照组。反应24h后，氮气吹干，加入200μL纯净水溶解，氮气吹干，反复溶解吹干3次，最后两组样品加入1．3mL柠檬酸钠缓冲液充分溶解，过0．45μm膜于进样瓶

2

2．1

结果与分析

单因素水解条件的工艺优化结果

2．1．1pH对碱性蛋白酶水解小麦蛋白效果的影响碱性蛋白酶Alcalase的理论最适反应条件为：

pH温度50℃，底物浓度8%，酶用量4%（w/w），

8．5，7．0、水解时间2h。实验pH值分别选择6．5、

7．5、8．0、8．5、9．0，其他条件选择理论最适条件，结果如图1所示。

随着pH值升高，小麦蛋白的水解度上升，蛋白肽中的Gln含量在pH值为7．5时达到最高（15．97%），肽中部分Gln被分当pH高于7．5时，解为游离的Gln，肽中Gln含量下降。

2．1．2温度对碱性蛋白酶水解小麦蛋白效果的影响

50℃、55℃、60℃、65℃、70温度分别为45℃、℃，其他条件选择理论最适条件，结果如图2所示。

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图1pH

对碱性蛋白酶水解小麦蛋白效果的影响

图4酶浓度对碱性蛋白酶水解小麦蛋白效果的影响

随着酶浓度的增加，酶解反应速率加快、水解度增加。水解度过高或过低都对蛋白肽中有效Gln（非氮端）含量有一定的影响，当酶浓度达到5%时，肽中有效Gln含量达到最高（17．21%）。

2．1．5时间对碱性蛋白酶水解小麦蛋白效果的影响

连续酶解180min，每隔30min取一次样，其他条件选择理论最适条件，考察水解时间对肽中Gln含量及水解度的影响，结果如图5所示

。

图2

温度对碱性蛋白酶水解小麦蛋白效果的影响

碱性蛋白酶Alca-温度过高会影响酶的活性，

lase在55～60℃时具有较好的活性，高于60℃时酶失去活性。蛋白肽中Gln含量在温度为55℃时

由于酶当温度高于55℃时，达到最高（16．95%），

Gln含量下降。活性降低，谷朊粉酶解受到影响，

2．1．3底物浓度对碱性蛋白酶水解小麦蛋白效果的影响

6%、8%、10%、12%、14%，底物浓度分别为4%、

其他条件选择理论最适条件，结果如图3所示

。

图5时间对碱性蛋白酶水解小麦蛋白效果的影响

图3底物浓度对碱性蛋白酶水解小麦蛋白效果的影响

随着底物浓度的增加，谷朊粉的溶解度受到一定的影响，水解度略微下降，蛋白肽中Gln含量在底物溶度为8%时达到最高（14．29%）。

2．1．4酶浓度对碱性蛋白酶水解小麦蛋白效果的影响

3．0%、4．0%、酶浓度分别为1．0%、2．0%、

5．0%、6．0%（w/w），其他条件选择理论最适条件，结果如图4所示

。

水解度越高，当反应时间达到反应时间越长，

120min后水解度开始趋于平缓。肽中有效Gln含量先随反应时间的延长而增加，最适反应时间为120min，当反应时间继续延长，水解度过高，蛋白肽中的有效Gln含量下降。2．2正交实验结果分析

根据上述单因素试验考察结果，选择对试验指标影响较大的因素和较合适的试验水平，采用L16（45）正交表进行正交试验，实验因素选择如表1所示，优选出碱性蛋白酶水解小麦面筋蛋白的最适条件。

表1

序号1234

ApH值7．07．58．08．5

正交实验参数

E时间/min90120150180

BCD

温度/℃酶浓度/%底物浓度/%55606570

3456

78910

表2实验

碱性蛋白酶酶解谷朊粉正交实验方案与结果

因素

A

B

C

D

E

有效Gln含量/%

7．799．709．468．8415．109．1410．9212．3610．5915．639．7717．6510．768．0111．5414．41

蛋白含量76．03%，游离氨基酸含量2．06%。

本实验单酶水解的效果显著。虽然双酶或多酶水解系统中，小麦面筋蛋白被两种或两种以上的酶联合水解，其水解效率或有效Gln含量会再次提升，但就碱性蛋白酶Alcalase特点而言，与其他非动物

［19］

再添加其他酶性蛋白酶相比其水解效率非常高，

进行水解，水解度可能会略微升高，但效果并不明显，反而会增加其生产成本。本实验采用单酶水解，小麦面筋蛋白水解直接得成品，成本低，产品中短肽含量高、有效Gln含量高。参考文献：

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111

2123134145216227238249311032113312341341144215431644K18．94712．825K211．88010．620K313．41010．422K411．18011．5504．4632．4031112223334442341434123213424311242134233142411328．4289．32811．83011．73210．64711．32011．87013．6509．98811．53711．79210．4301．5934．3223．182

碱性蛋白酶Alcalase水解小麦面筋蛋白的正交实验结果如表2所示，各因素对酶解产物中的有效谷氨酰胺含量影响大小依次为pH＞底物浓度＞时间＞温度＞酶浓度。正交试验中，产物中有效Gln

测得样含量最高的样品为实验12（A3B4C2D1E3），

品蛋白肽中有效Gln含量为17．65%，蛋白含量为76．03%，因此确定组合A3B4C2D1E3为最适条件，即最适条件为pH8．0、温度70℃、酶浓度4%、底物浓度7%、时间150min。2．3三氯乙酸氮溶指数

［18］

它可以沉淀三氯乙酸是一种蛋白质沉淀剂，

大分子蛋白质和较长的肽段，保留可溶性肽和游离氨基酸。TCA－NSI越高，表明肽含量越高，因此，TCA－NSI可以准确地反应蛋白质的酶解情况，并且是评价多肽溶液的一个直观有效的指标。

试验测得酶解产物的酸溶性蛋白含量为59．20%，通过计算得氮溶指数为77．86%，表明酶解蛋白样品中短肽的含量比较高。

2．4样品中Glx（Glu+Gln）及游离氨基酸含量

通过测定，酶解蛋白样品中总Glx含量为22．83%，酶解蛋白中有效Gln含量为17．65%。说明碱性蛋白酶Alcalase对酰胺基团水解率很小，保留了蛋白肽中77．31%的有效Gln。此外，游离氨基酸含量为2．06%，说明产品中游离氨基酸含量低，也进一步验证了酶解样品中的肽含量较高。

3结论

Alcalase水解小麦以小麦蛋白（谷朊粉）为原料，

面筋蛋白的最适条件为pH8．0，温度70℃，酶浓度4%，底物浓度7%，反应时间150min。以发酵罐作为反应容器，酶解液直接喷雾干燥，水解小麦蛋白中

TCA－NSI为77．86%，有效谷氨酰胺含量为17．65%，

．食品科技，2010（2）：18－22．●化多肽的研究［J］