各类微生物脂肪酶酶学性质及应用的研究进展

粮油食品科技第22卷2014年第1期

生物工程

各类微生物脂肪酶酶学性质及应用的研究进展

黄

1，21，21，21璜，李宗军，王远亮，侯爱香

(1．湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙410128;

2．食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙410128)

摘

要：微生物脂肪酶作为一类功能强大的催化剂，越来越受到人们的关注。微生物脂肪酶种类繁

多，广泛存在于霉菌、酵母和细菌中，且不同微生物来源的脂肪酶其酶学性质、基因结构各不相同。对目前国内外研究较多的根霉脂肪酶、曲霉脂肪酶、青霉脂肪酶、毛霉脂肪酶、地霉脂肪酶、酵母脂肪酶和细菌脂肪酶的最适作用温度、最适pH及pH稳定性、底物特异性、酶活性影响、基因结构及其应用等方面进行了综述，并论述了食品加工业中脂肪酶的研究进展。关键词：微生物;脂肪酶;多样性

+

中图分类号：TS201．25

文献标识码：A文章编号：1007－7561（2014）01－0109－10

Progressinenzymaticpropertiesofmicrobiallipaseandapplications

222

HUANGHuang1，，LIZong－jun1，，WANGYuan－liang1，，HOUAi－xiang1

（1．CollegeofFoodScienceandTechnology，HunanAgriculturalUniversity，ChangshaHunan410128；2．KeyLaboratoryofFoodScienceandBiotechnologyofHunanProvince，ChangshaHunan410128）Abstract：Microbiallipasesarebeingdrawnmoreandmoreattentionasaclassofcatalystwithpowerfulfunction．Therearemanykindsofthem，whichwidelyexistinmold，yeastandbacteria．Furthermore，themicrobiallipasesfromdifferentsourceshavedifferentenzymaticpropertiesandgenestructure．Thepresentresearches，bothdomesticandabroad，abouttheoptimumtemperature，thepHandpHstability，substratespecificity，theeffectofenzymeactivity，genestructureandapplicationofＲhizopuslipase，As-pergilluslipase，Penicilliumlipase，Mucorlipase，Geotrichumlipase，Candidalipaseandbacterialli-pase，andtheirapplicationsweresummarized．Theprogressoflipaseinthefoodprocessingindustrywasdiscussed．

Keywords：microorganism；lipase；diversity脂肪酶（LipaseE．C．3．1．1．3）是一类特殊的酯

酶，能水解三酰甘油酯为脂肪酸、二酸甘油酯、单酸甘油酯及甘油，其天然底物一般是不溶于水的长链脂肪酸酰基酯，特点是在油水界面起催化作用。微生物脂肪酶广泛存在于细菌、酵母和霉菌中，具有种类多、周期短、繁殖快、易发生遗传变异的特点，且有比动植物脂肪酶更广的作用温度、作用pH和底物特异性，其可以在不需要辅酶的条件下催化酯类化合物的水解、醇解、酸解、酯交换及合成等，催化条件温和、能耗低、副产物少，具有高效、高选择性、环境友好等特点，改变了传统的酯化或转酯化反应所需

收稿日期：2013－05－02

基金项目：湖南省科学技术重点项目（2011NK2004）；长沙理工大学

“生物能源高效清洁利用湖南省重点实验室开放基金资助

”（2011NGQ002）质能源转化工程技术及应用研究项目

1988年出生，作者简介：黄璜，女，湖南永州人，在读硕士研究生．1967年出生，通讯作者：李宗军，男，湖南岳阳人，教授．

要的高温、强酸、强碱等相对苛刻的条件。微生物脂

肪酶适合于工业化大生产，可生产出高纯度制品，在基础理论研究和实际应用中都具有重大价值

［1］

。

在微生物酯酶及脂肪酶数据库中，脂肪酶被分

39个同源家族。产脂肪酶的微生为16个超家族，

物种类很多，迄今己报道的有65个属，细菌28个

属，酵母菌10个属，放线菌4个属，其它真菌23个属

［2］

。大多数脂肪酶一级结构中都存在保守的五

X1一般为Gly或His，肽Gly－X1－Ser－X2－Gl，X2一般为Met、Leu、Ala或Gln，真菌的这一序列保守性更强，如霉菌Gly－His－Ser－Leu－Gly，酵母Gly－Gly－Ser－Ala－Gly，这五肽中的Ser是一种亲核残基，参与酶的催化。大部分脂肪酶的催化中心都有一段α－螺旋结构覆盖在左上方，形成类似“盖子”状的结构，只在特殊情况下，盖子结构打开，脂肪酶才表现催化活性。

生物工程

目前，微生物脂肪酶的研究主要集中于根霉属（Ｒhizopus）、曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicilli-um）、毛霉属（Mucor）、地霉属（Geotrichum）、假丝酵母属（Candida）、假单胞菌属（Pseudomonas）、伯克霍尔德菌属（Burkholderia）等具有工业应用价值的菌株。

粮油食品科技第22卷2014年第1期

置，在食品工业中有强大的应用潜力

［3］

。

典型的根霉脂肪酶一级结构由26个氨基酸信

97个氨基端前导序列和269个氨基酸成熟肽号肽、

组成。如将华根霉脂肪酶（Ｒhizopuschinensispro-ＲCL）基因扩增，ＲCL序列开放阅读框长1170bp，其不含内含子，编码389个氨基酸多肽，存在催化三

［4］

联体Ser145－His257－Asp204。有研究报道葡枝根霉YF6脂肪酶基因lipＲs基因编码区全长1173bp，不含内含子，编码26个氨基酸信号肽和365个氨基酸成熟肽，含有脂肪酶特征序列GHSLGGA，有5个可能的N－糖基化位点。表1列举了部分根霉脂肪酶酶学性质。

1

1．1

霉菌脂肪酶

根霉脂肪酶

根霉脂肪酶基因结构及酶学性质

根霉属主要包括微孢根霉（Ｒhizopusmicros-

1．1．1

porus）、匍枝根霉（Ｒhizopusstolonifer）和米根霉（Ｒhi-zopusoryzae）3类。根霉脂肪酶大多具有高度的sn-1，3位置专一性，sn-1，3位专一性脂肪酶因其高度的专一性可以精准的调节三酰甘油中脂肪酸的位

表1

产酶菌种华根霉

Ｒhizopuschinensissaitopro27ＲCL/mＲCL

最适温度40℃/35℃

最适pH8．5/8．0

部分根霉脂肪酶酶学性质［5－10］

对脂肪酶活性的影响促进Ca2+、Mg2+

抑制

其他

参考文献王乐乐［5］

底物特异性C6～C8中链脂肪

酸酯/C2～C6短链脂肪酸酯中碳链脂肪酸

正庚烷和异辛Hg2+、SDS、在正己烷、

烷中具有较高的活力和良PMSF

好的稳定性Cu2+、Hg2+

在pH6．5～8．0的条件下

较稳定

华根霉

ＲhizopuschinensissaitoSSLl

米根霉

Ｒhizopusoryzae

40℃8．0K+孙舒扬［6］

35℃7．5

饱和脂肪酸链（C8～C18）

Mg2+

TritonX100、具有良好的l，3位置专一

3+

SDS、Fe、性、立体选择性2+2+Cu、Hg、Fe2+

pro－ＲOL具有比m－ＲOL更好的温度稳定性

HiolA［7］

米根霉

Ｒhizopusoryzae

pro－ＲOL/m－ＲOL根霉

ＲhizopusZM－10

35℃

8．0

短链底物（C4）/中等链长底物（Cl0、C12）

杨江科［8］

8．0

++2+2+

Na+、Cu2+、Zn2+、醇类有Na、K、Ca、Mg、

机溶剂、Ba2+及EDTA对其活性影SDSFe3+、

Tween－80、EDTA响较小

于忠良［9］

无根根霉

Ｒhizopusarrhizus

36℃7．5Tween－80

3位置专一性，良好的1，

在pH6．0～8．0范围内较为稳定

孙宏丹［10］

不同根霉所产的脂肪酶性质存从表1可发现，

在一定差异，可归纳为：1）多数根霉脂肪酶最适温度和pH范围分别是35～40℃和7．0～8．0，为弱碱性脂肪酶。2）多数根霉脂肪酶对中短链脂肪酸有底物特异性，但个别不同基因组成的根霉脂肪酶其底物特异性不同，如华根霉脂肪酶前体基因pro27ＲCL对C6～C8中链脂肪酸酯水解活力较高，而成熟脂肪酶基因mＲCL对C2～C6的短链脂肪酸酯水解活力较高；米根霉Ｒhizopusoryzae脂肪酶pro－ＲOL对短链底物（C4）具有更高的水解活性，而m－ＲOL更倾向于中等链长底物（C10和C12），再者

pro－ＲOL具有比m－ＲOL更好的温度稳定性。3）不同的金属和表面活性剂对不同的根霉脂肪酶作用

效果不一，但几乎对所有根霉脂肪酶酶活而言

2+Ca2+、Mg2+能起到促进作用，Hg2+、SDS则而Cu、

+

K+、Ba2+及能强烈抑制根霉脂肪酶的活性。Na、

EDTA对其活性影响较小。同一种金属离子对不同

3+

来源的根霉脂肪酶作用效果不一，如Fe能促进根霉ＲhizopusZM－10脂肪酶酶活，却抑制米根霉Ｒhi-

zopusoryzae脂肪酶的活性。1．1．2

根霉脂肪酶的应用

根霉脂肪酶常用于油脂加工，以提高油脂的品

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生物工程

［15］

物。Shin等用日本根霉降解壳聚糖获得的可溶性低分子壳聚糖适用于食品添加剂和功能性试剂。

质，如制备Q－亚麻酸（ALA）、亚麻酸（GLA）、花生四烯酸（AＲA）、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六

［11］烯酸（DHA）等，可用于廉价的棕榈油制类可可

［12］

脂，制备营养保健油脂和特种油脂等。Khare等

1．21．2．1

曲霉脂肪酶

曲霉脂肪酶基因结构及酶学性质

黑曲霉（Aspergillusniger）具有高效的异源蛋白

［16］

研究用固定在硅藻土中的日本根霉脂肪酶对豆油进

行油脂改性，使豆油含有25%的DHA，提高豆油的营养价值。此外，根霉脂肪酶具有较好的立体选择性、较高的转化率和稳定性，可用于芳香酯、生物柴油、手性化合物等有机化合物的制备，如徐岩

［13］

重组表达、分泌和修饰能力。舒正玉等分离纯化

了黑曲霉F044脂肪酶N－端氨基酸序列，得序列为S（E，H）－V－S－T－S－T－L－D－E－L－Q－L，cDNA全长将其扩增全长1044bp，含3个内含子，894bp，编码297个氨基酸（含信号肽27个氨基酸），与其它脂肪酶基因没有明显同源性。连英［17］

丽等人工合成了寄生曲霉脂肪酶基因LipAP，LipAP空间结构保守，具有催化三联体Ser173－Asp226－His288、活性部位盖子S111YSIＲNWVT-DAT122及保守五肽－G－H－S－L－G－这3个功能域，β－折叠位于脂肪酶分子的中央，α－螺旋包围在β－折叠外面，形成近似球形的蛋白质分子。表2列举了部分曲霉脂肪酶酶学性质。

等

用华根霉全细胞脂肪酶在庚烷中催化短链脂肪酸（C2～C8）乙酯合成，除丙酸乙酯外，其他酯的转化率都高于90%，半衰期长840～981h，使更利于酶

［11］

法生产天然芳香酯。Ban等把米根霉全细胞脂肪酶固定在生物载体颗粒上催化大豆油与甲醇转酯化反应，甲酯在反应体系中含量高达90%，有利于生物

［14］

3－二酰柴油的合成。Yasohara等用德氏根霉对1，

基氧－2－取代－2－丙醇进行拆分，获得光学纯度为

97%的Ｒ型手性中间体，用于制造吡咯类抗真菌药

表2

产酶菌种黑曲霉

Aspergillusniger黑曲霉

AspergillusnigerF044

最适温度30℃

最适pH7．0

部分曲霉脂肪酶酶学性质［18－20］

对脂肪酶活性的影响促进TritonX－100

抑制

其他

在pH为5．5～10．0内稳定

参考文献薛静［18］

45℃7．0Ca2+

Mn2+、Fe2+、分子量约为34～40kD，在602+Zn、多种金℃以下和pH2．0～9．0之间有

很好的稳定性属离子

Fe2+、Zn2+、Mn2+几乎没有影响，在5．5～

2+

6．0之间脂肪酶稳定性较好Cu

舒正玉［16］

黑曲霉

AspergillusnigerLi－38

黑曲霉

AspergillusnigerF044

50℃5．5

Na+、K+Mg2+、Ca2+

唐凤仙［19］

50℃6．0Ca2+在40℃条件下保持稳定杨江科［20］

从表2可发现，不同黑曲霉菌株产生的脂肪酶性

质差异较大，可归纳为：1）多数黑曲霉脂肪酶的最适温度和pH范围分别是45～50℃和5．5～7．0，为中性偏弱酸性脂肪酶。2）金属离子和表面活性剂因其菌种的纯化方式或实验条件的不同而存在一定差异，

2+

Mg2+、K+能促进绝大多数黑曲霉脂肪酶活但Ca、

性，且能使黑曲霉F044脂肪酶结构发生明显变化，Fe2+、Cu2+等多种金属离子对脂肪酶则有显著Zn2+、

的抑制作用。此外，红曲霉脂肪酶（Monascuspurpu-reus）在pH4．0～6．0范围内能基本保持酶活力。1．2．2曲霉脂肪酶的应用

3－位曲霉脂肪酶具有良好的生物安全性和1，

选择性、最适底物脂肪酸碳链长为C6～C12等特点，被广泛应用于食品加工、油脂深加工、洗涤剂添

加剂、手性化合物拆分、有机合成及有毒物质降解等

诸多领域。近年来有关曲霉属的报道中，对黑曲霉的研究报道较多，对其他曲霉的报道很少。有研究报道黑曲霉脂肪酶能酰基化多糖、分解赫曲霉素A，

［16］

进一步拓宽了黑曲霉脂肪酶的应用领域。利用Aspergillusniger脂肪酶选择性水解鱼油，使n－3多不饱和脂肪酸含量提高。1．3青霉脂肪酶1．3．1

青霉脂肪酶基因结构及酶学性质

青霉脂肪酶普遍存在保守的五肽序列Gly－X1

［21］

－Ser－X2－Gl，国内外相关报道不多，林琳等测定扩展青霉（Penicilliumexpansum）PF898脂肪酶完

cDNA全长l050bp，整的cDNA序列，包括PEL编3’码区、非翻译区和部分5’非翻译区基因的序列，

生物工程

编码区全长855bp，编码1个由285个氨基酸残基组成的酶蛋白，其信号肽及前肽由27个氨基酸残基组成，成熟肽由258个氨基酸残基组成。该脂肪酶

表3

产酶菌种青霉

PenicilliumKB700A

扩展青霉

Penicilliumexpansum

最适温度35℃

最适pH

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的氨基酸序列130～134位上有各类脂肪酶中普遍存在的G－X－S－X－G保守序列。表3列举了部分青霉脂肪酶酶学性质。

部分青霉脂肪酶酶学性质［22－25］

对脂肪酶活性的影响促进Ca2+、Mn2+、Cr2+

抑制

其他

在－5℃分子质量为49924，

下生存并产生脂肪酶

参考文献Ｒashid［22］

36℃9．4

无酯键位置选择性，在22～45℃具有较大活性，pH稳定范围在6．0～10．6

1．5%甲醇诱导可提高酶活，碱性条件下分解三酰甘油，产生脂肪酸和甘油

Ca2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+、在pH6．0～10．0时酶具有良

Cu2+、Pb2+、好的稳定性K+

Li2+

郑毅［23］

扩展青霉PenicilliumPF898黄青霉PenicilliumnumJ23

34℃

expansum

9．5

袁彩［24］

33℃

chrysoge-

7．5

李珍［25］

从表3可发现，不同来源的青霉脂肪酶其酶学性质存在较小的差异，可归纳为：1）多数青霉脂肪酶的最适合作用温度和pH范围分别为33～36℃和7．5～9．5，为典型的低温碱性脂肪酶，个别如黄青霉PenicilliumchrysogenumJ23菌所产脂肪酶的最适pH相对偏低为7．5；2）不同金属离子和表面活性剂对青霉脂肪酶作用效果不一，一种金属可能对一种脂肪酶起促进作用却抑制另一种脂肪酶酶活，如Mn2+能提高青霉PenicilliumKB700A脂肪酶酶活，却对黄青霉PenicilliumchrysogenumJ23脂肪酶有抑

2+

制作用，Ca可显著提高青霉脂肪酶活性，可能是因形成长链脂肪酸钙盐。此外，圆弧青霉（Penicilli-umcyclopium）脂肪酶对短链（C8以下）脂肪酸表现出强烈特异性，且可水解所有位置脂肪酸1．3．2青霉脂肪酶应用

［26］

脂肪酶，该脂肪酶产品已在洗涤添加剂、皮毛脱脂、

鱼皮脱脂、再生纸脱墨、面粉改良、白酒和面包增香等工艺中应用。此外，扩展青霉脂肪酶还具有预防

［27］

血脂升高和改善血液流变性的作用。施巧琴对NS、Co60－r、扩展青霉用NTG、紫外线等进行诱变，

得到的FS1884工业发酵菌株，其酶活性大大提高，比出发菌株提高了140倍，已经在深圳绿微康公司进行产业化，是目前国内唯一的国产碱性脂肪酶生产菌株。

1．4毛霉脂肪酶1．4．1

毛霉脂肪酶基因结构及酶学性质

毛霉脂肪酶（ＲML）的立体结构存在Ser－Asp

－His三联体，活性中心丝氨酸残基的侧链构象在空间结构方面与丝氨酸蛋白酶非常相似，不同的是活性中心隐藏在蛋白酶的内部，被一个亲水性的短α－螺旋覆盖。表4列举了国内外部分毛霉脂肪酶酶学性质。

。

青霉属脂肪酶中报道最多的是扩展青霉，扩展青霉碱性脂肪酶是目前国内唯一市场化的国产碱性

表4

产酶菌种米黑根毛霉

Ｒhizomucormiehei

最适温度40℃

最适pH8．0

部分毛霉脂肪酶酶学性质［28－29］

对脂肪酶活性的影响促进

抑制

其他

优良的sn－1立体特异性，在pH7．5～8．5和温度30～50℃下能保持较稳定的活力

吐温系列尤其是Tween－80

参考文献张宇［28］

底物特异性中长链脂肪酸酯

毛霉Mucor

28℃6．0

张卫国［29］

粮油食品科技第22卷2014年第1期

生物工程

椰子亚油酸甘油酯同短链脂肪酸甲酯进行酯交换，使产物中短链脂肪酸含量提高20%～25%。短链芳香酯是白酒工业常用的调香剂。1．51．5．1

地霉脂肪酶

地霉脂肪酶基因结构及酶学性质

白地霉脂肪酶（Gertrichumcandidumlipase，

从表4可发现：不同条件下不同的毛霉菌株所产生的脂肪酶其最适作用温度和pH相差较大，如米黑根毛霉脂肪酶最适温度和pH分别为40℃和8．0，毛霉脂肪酶最适温度和pH分别为28℃和6．0，可能菌种来源、实验条件和纯化方式等不同对这一明显的差异存在一定影响。因此，毛霉脂肪酶依其各自独特的酶学性质，具有很广的工业应用范围。

1．4．2毛霉脂肪酶的应用

米黑根毛霉（Ｒhizomucormiehei）脂肪酶（ＲML）的工业应用性很强，广泛应用于乳制品工业（如制造人造黄油、具有不同熔点且零反式脂肪酸的三甘

“重构脂”酯及一些等）、家具清洁产品、油脂化学和医疗领域（治疗肥胖和动脉粥样硬化等），还更多地

应用于农业化肥和制药工业，生产手性化合物等

［30］

GCL）的保守五肽－Gly－Glu－Ser－Ala－Gly－，二

级结构α/β型折叠，是构成脂肪酶的底物结合区和Glu替活性中心，活性中心三联体为Ser－His－Glu，代了常见的Asp，丝氨酸残基三联体被α螺旋掩盖，不反应时脂肪酶α螺旋的盖子是关闭状态，反应时盖子打开，脂肪酶构象改变，疏水基团暴露出来，而

［34］亲水基团隐藏。韩均研究GeotrchumcandidumGXU08脂肪酶II的氨基酸序列，此脂肪酶基因长

。但天然的ＲML产量低、成分不稳定，存在较

大缺陷，使得其成本偏高、应用受限。目前，国内外

［31］

对毛霉脂肪酶酶学性质的报道不多。吴华昌等研究在非水相中，米赫毛霉脂肪酶催化硬脂酸甲酯

［13］

与棕榈油进行酯交换，制取类可可脂，徐岩等对比了10种脂肪酶在庚烷中合成短链芳香酯能力，其中Mucormiehei脂肪酶在48h合成芳香酯转化率达90%以上，Mucormiehei脂肪酶在正庚烷间歇同时，

Osborn［32］等利用Ｒ．式反应中稳定性较好。国外，

miehei脂肪酶催化牛脂与硬脂酸进行酸解，制得一种类可可脂，可与可可脂进行任意比例的互配，作为

［33］

巧克力涂层。Ghosh等用Ｒ．miehei对椰子油或

表5

产酶菌种地霉

Geotrichum－3

最适温度20℃

SYBCWU

最适pH9．5

1695bp、且无内含子，编码544个氨基酸其中信号肽57个bp，编码19个氨基酸。分子量预测为61542．3道尔顿，GC含其理论等电点PI值为5．39，

［35］

量50%。阎金勇等在国内首次克隆了Geotri-chumcandidumY162脂肪酶基因，基因全长1692bp，不含内含子，编码包括19个氨基酸信号肽在内的563个氨基酸，含有脂肪酶活性中心－G－E－S－A－G－区的保守五肽序列、催化活性三联体Ser236－Glu373－His482及两处潜在的糖基化序列－N－A－T，与NCBIGenBank中已报道的地霉属脂肪酶氨基酸序列有86%的一致性。表5列举了国内外部分地霉脂肪酶酶学性质研究进展。

部分地霉属脂肪酶酶学性质［34－37］

对脂肪酶活性的影响促进三丁酸甘油酯、橄榄油、坚果复合油、吐温20、吐温80和乳化剂OPTriton－100

Fe2+、Ca2+Tween－80对该脂肪酶活

在pHCu2+、Ni2+、性基本没有影响，

6．0～8．5能保持较稳定SDS

活力Cu2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+无明显抑制作

Ni+有一用Fe2+、

定抑制作用；Hg2+、A13+明显抑制

对甲醇、甘油、正己烷、环己烷等有机溶剂呈现耐受性，耐高温

抑制

其他

参考文献王蕾［36］

底物特异性LIP－1对长链脂

肪的水解能力强，LIP－2对短链脂肪的水解能力强

地霉

GalactomyceshumFL002白地霉GeotrichumGXU08

6．5

geotrie-

王琰［37］

40℃

candidum

9．0

长链不饱和脂肪

K+、Ca2+韩均［34］

白地霉

GeotrichumY162

50℃8．0

C9位顺式双键长Ca2+链不饱和脂肪酸

阎金勇［35］