酶解玉米胚芽粕制备ACE抑制肽的条件优化

粮油食品科技第22卷2014年第1期

营养与品质

酶解玉米胚芽粕制备ACE抑制肽的条件优化

吴

1迪，任

1，21，2

健，宋春丽

(1．齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江齐齐哈尔161006;

2．齐齐哈尔大学农产品加工黑龙江省普通高校重点实验室，黑龙江齐齐哈尔161006)要：采用碱性蛋白酶酶解玉米胚芽粕制备血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽，并以ACE抑制率

4

为指标，在单因素的基础上，通过L9(3)正交试验来确定酶解的最佳工艺条件。最佳酶解条件为:摘

pH8．5、底物浓度5%(w/v)、加酶量3%(w/w)、温度60℃、水解时间2．5h，在此条件下，水解物对ACE抑制作用最强，抑制率可以达到86．38%(此时水解度为22．76%)。以截留分子量为6KDa的超滤膜分离该水解物，测定两组分的ACE抑制活性。酶解液经超滤后组分Ⅱ(M＜6kDa)的IC50值达到1．38mg/mL，优于未超滤的酶解液的IC50值(3．16mg/mL)。关键词：玉米胚芽粕;ACE抑制肽;碱性蛋白酶;超滤

+

中图分类号：TS201．25文献标识码：A文章编号：1007－7561（2014）01－0051－03

OptimizationofpreparationofACEinhibitorypeptidesbyhydrolysisofcorngermmeal

22

WUDi1，ＲENJian1，，SONGChun－li1，

（1．CollegeofFood＆Bioengineering，QiqiharUniversity，QiqiharHeilongjiang161006；2．KeyLaboratoryofAgriculturalProductsProcessingofHeilongjiangProvince，QiqiharUniversity，

QiqiharHeilongjiang161006）

Abstract：CorngermmealwashydrolyzedbyalkalineproteasetoprepareACEinhibitorypeptides．Basedonthesingle－factorexperiments，theorthogonalexperimentofL9（34）wasusedtooptimizeenzymaticconditionsandtheACEinhibitoryratewasusedastheindicator．Theoptimalconditionwasasfollows：substrateconcentrationwas5%（w/v），enzymeconcentration3%（w/w），temperature60℃，pH8．5，hy-drolysistime2．5h．UndertheconditiontheinhibitionofthehydrolysateagainstACEwasthestrongest，theinhibitoryratewas86．38%andthedegreeofhydrolysiswas22．76%．Thehydrolysatewasseparatedbytheultrafiltrationmembranewiththemolecularweightcutoff6KDa．Theinhibitoryactivitiesofthetwofractionsweredetermined．The50%inhibitoryconcentration（IC50）offractionⅡ（M＜6kDa）was1．38

mg/mL，whichwasbetterthanthatoftheun－ultrafiltrationfraction（3．16mg/mL）．Keywords：corngermmeal；angiotensinconvertingenzymeinhibitorypeptide（ACEinhibitorypep-tide）；alkalineprotease；ultrafiltration

高血压是最常见的慢性病，在中国估计至少有2亿人正面临高血压及其并发症的威胁。上世纪70

Ferreira等人首次从美洲茅头蝮蛇毒液中发现年代，

具有血管紧张素转化酶（ACE）抑制活性的多肽，并

［1］

经过临床证明具有明显的降血压效果。近年来已有许多学者从不同来源的蛋白质中提取了多种ACE抑制肽，并验证了其降压效果。其中植物性蛋

收稿日期：2013－05－02

基金项目：教育部科学技术研究重点项目（210067）

1989年出生，作者简介：吴迪，女，在读研究生．

：，1970，，通讯作者任健年出生男教授，博士．

［2－3］

、白来源获得的ACE抑制肽，主要包括大豆花

［4］［5－6］［7］［8］

、玉米葵花籽粕、亚麻籽等。食源性生、

蛋白ACE抑制肽无毒副作用，安全性高，且对血压

正常者无降血压特点，现已成为研究热点并且是治

［9］

疗和控制高血压药物的理想替代品。

玉米胚芽粕是玉米胚芽经制油后的残渣，是玉米加工的主要副产品。玉米胚芽粕含有较高的玉米纤维和蛋白质，其中粗蛋白含量一般为20%～25%。目前玉米胚芽粕主要用于饲料，这样使得其经济价值较低，同时也造成了粮食资源的浪费

［10］

。

营养与品质

目前以玉米胚芽粕为原料制备ACE抑制肽的文章还比较少，本试验采用碱性蛋白酶酶解玉米胚芽粕制备ACE抑制肽，并用超滤法将酶解液分离，得到不同抑制能力的ACE抑制肽。

粮油食品科技第22卷2014年第1期

各组分溶液冷冻干燥，比较各组分的ACE抑制活性，通过检测抑制率计算IC50，测定蛋白含量。1．3．4

ACE抑制率的测定

根据Cushman紫外分光光度法的基本原理进

［11］

行改进。

反应在2mL的离心管中进行，反应总体积200

80μL5μL。在离心管中依次加入10μL水解液、

mmolHHL（HHL溶液用含有0．3molNaCl的0．1mol/LpH8．3硼酸缓冲液配制）和100μL的去离子水。37℃恒温水浴5min后加入10μLACE（0．1U）启动反应，37℃恒温水浴30min，再加入200μLlmol/LHCl终止反应。加入1．2mL冷（－20℃）的乙酸乙酯，均匀混合15s，萃取反应生成的马尿3500r/min离心5min，100℃的酸，取酯层800μL，沸水中将乙酸乙酯蒸去，烘干，再加入800μL的去离子水涡旋振荡2min，使马尿酸溶解。在228nm处测定其吸光值；除对照组不加抑制剂、空白组在反应前先加入200μLlmol/LHCl终止反应以外，其余操作与反应管完全相同。抑制率计算公式如下：

抑制率/%=（ODA－ODB）/（ODA－ODC）×100，其中：ODA为不存在抑制剂时的吸光值（用去离子水代替水解液）；ODB为存在抑制剂与ACE酶时的吸光值；ODC为抑制剂与ACE酶都不存在时的吸光值（用去离子水代替水解液，并在反应前加盐酸终止反应）。

1．3．5蛋白质含量的测定

GB/T5009．5—2010。微量凯氏定氮法，

1

1．1

材料与方法

试验材料与试剂

玉米胚芽：齐齐哈尔中粮集团提供；碱性蛋白酶：丹麦Novo公司；血管紧张素转化酶（ACE）和马

尿酰组氨酰亮氨酸（HHL）：Sigma公司；其他试剂为国产分析纯试剂。1．2

主要试验仪器

紫外可见分光光度计：DU800型，贝克曼库尔

5-A型，特商贸（中国）有限公司；离心机：TDL-上海安亭科学仪器厂；电子天平：BS124S型，北京塞多

利斯仪器系统有限公司；酸度计：PB－10型，北京塞多利斯仪器系统有限公司；中空纤维膜组件：天津膜天膜工程技术有限公司。1．31．3．1

试验方法

玉米胚芽粕的制备玉米胚芽粉碎，粉碎后将其与石油醚按1∶5（w/

v）混合脱脂。混合液于室温下磁力搅拌3h，离心10min（4000r/min），旋转蒸发回收上清液。向沉淀中加入新的同比例石油醚脱脂，重复6次。测得脂肪含量为1．83%，烘干后过100目筛备用。1．3．2玉米胚芽粕酶解工艺的单因素试验和优化试验

玉米胚芽粕按一定浓度与缓冲液（Tris－HCl）混合，在适宜的温度和pH条件下，加入一定量的碱性蛋白酶，在水浴振荡摇床中进行酶水解反应，每隔半个小时取样，水解液100℃加热20min以钝化酶活力，再4000r/min离心30min，测定上清液的ACE抑制率，每组做3次平行试验。以加酶量、底物浓度、温度和pH为考察指标，其他因素条件为：pH8．5，加酶量3%（w/w），水底物浓度5%（w/v），

酶解时间5h。底物浓度单因素试验解温度60℃，

3%、4%（w/w）；底物参数为：加酶量分别为2%、

7%、9%（w/v）；温度分别为55浓度分别为5%、

℃、60℃、65℃；pH分别为8．1、8．5、8．9。在单因素试验的基础上，确定影响反应的主要的3个因素进行正交优化试验，确定酶解的最优条件。1．3．3

酶解液的超滤分离

在最佳的酶解条件下酶解玉米胚芽粕，将酶解

4000r/min离心30min后取上清液，液离心，上清液经过Φ9cm的定性滤纸过滤，除去杂质。将过滤

后的酶解液通过截留分子量为6kDa的超滤膜超滤，分离出两种不同分子量的多肽组分：组分Ⅰ（M＞6kDa）和组分Ⅱ（M＜6kDa）。分别将超滤后的

2

2．1

结果与分析

单因素试验结果与分析

单因素试验以ACE抑制率为指标，限于篇幅，

单因素结果不在此文中报道，主要结论为：底物浓度7%、pH8．5、加酶量3%、温度60℃、酶解时间2．5h为各因素的较优水平。

由于温度对玉米胚芽粕酶解液ACE抑制率的

pH小，影响较加酶量、底物浓度、因此在正交过程中固定酶解温度为60℃，酶解2．5h，选取加酶量、底

物浓度和pH进行正交试验。2．2

正交试验结果与分析

正交试验各因素水平见表1。正交试验结果及方差分析分别见表2和表3。

表1

水平123

A加酶量/%

234

L9（34）正交试验因素水平表B

底物浓度/%

579

CpH8．18．58．9

D空列123

粮油食品科技第22卷2014年第1期

表2

试验序号123456789k1k2k3Ｒ

A11122233350．88783．72362．19332．836

L9（34）正交试验方案及结果B12312312366．40064．79765．6071．603

C12323131266．85767．24362．7034．540

D12331223165．20065．78765．8170．617

抑制率/%52．5451．9148．2186．3879．6285．1760．2862．8663．44

表4

营养与品质

超滤对玉米胚芽粕酶解液ACE抑制活性的影响

IC50值/（mg/mL）

3．163．581．38

蛋白含量/%24．8331．8851．20

组分

未超滤的酶解液Ⅰ（M＞6kDa）Ⅱ（M＜6kDa）

3结论

表3

方差来源

A

BCD误差总和

方差分析结果

均方差834．8141．92819．00550．36250．36

F值2302．935

5．31952．4291

*显著性＊＊

自由度离差平方和21669．62822228

3．85638．0110．7250．721712．94

2）=19．00，F0．01（2，2）=99．00；*表示差异显著，注：F0．05（2，

＊＊表示差异极显著。

以酶本试验采用碱性蛋白酶酶解玉米胚芽粕，

解物的ACE抑制率为指标，通过单因素和正交试验确定了碱性蛋白酶酶解玉米胚芽粕的最佳工艺条

加酶量3%（w/w），温度60件：底物浓度5%（w/v），

℃，pH8．5，水解时间2．5h，此时水解物上清液的ACE抑制率为86．38%（水解度为22．76%）。酶解液通过截留分子量为6KDa的超滤膜处理，其分子量小于6kDa的组分抑制活性较高（IC50值为1．38mg/mL）。ACE抑制活性与从试验中可以看出，

ACE抑其分子量的大小有关，分子量相对较低时，

［4，12］

的结论相符。制活性较明显，这与前人

具有ACE抑制活性的玉米胚芽粕酶解液仍为混合物，应该进一步分离纯化并收集一系列单体化合物，确定其肽片段氨基酸序列，以便研究其结构与构效关系。参考文献：

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由正交试验结果分析可知，影响ACE抑制活性

因素的主次顺序为：加酶量（A）＞pH（C）＞底物浓度（B），最佳组合为：A2B1C2。由方差分析表可以看出，加酶量对水解物ACE抑制活性的影响极其显

pH对水解物ACE抑制活性影响也具有显著性，著，

但较加酶量稍差，底物浓度对水解物ACE抑制活性影响不显著。通过正交试验可以确定碱性蛋白酶酶解玉米胚芽粕的最佳工艺条件为：加酶量为3%（w/w），底物浓度为5%（w/v），pH8．5，水解温度为60℃，酶解2．5h。此时上清液的ACE抑制率为86．38%（水解度为22．76%）。

2．3酶解液超滤分离组分的活性测定

在最适酶解条件下酶解玉米胚芽粕，酶解液通过截留分子量为6kDa的超滤膜超滤，分离出2种不同分子量范围的多肽组分：Ⅰ（M＞6kDa）、Ⅱ（M＜6kDa）。比较各组分的ACE抑制活性，通过检测抑制率计算IC50及测定蛋白含量，结果如表4所示。IC50值是半抑制浓度，即抑制率为50%时，酶解液的浓度，它比抑制率更能准确地表达其抑制ACE的活

IC50值越小抑制剂活性越大。从表4可以看出，性，

不同分子量范围的酶解物均具有ACE抑制活性，且组分Ⅱ（M＜6kDa）的IC50值比未超滤的酶解液和组分Ⅰ（M＞6kDa）的都低，说明经过简单的超滤处理，酶解液的ACE抑制活性增强。

tionalCongressSeries，2002，1245（2002）：485－486．●