发育生物学教案-2015年
上传者:胡长原|上传时间:2015-04-21|密次下载
发育生物学教案-2015年
实验一 秀丽隐杆线虫的培养及其发育过程的观察
一、 实验目的
1. 理解线虫作为模式生物的优势以及在相关研究领域的应用;
2. 掌握线虫的基本培养技术,观察并且区分两种线虫个体发育过程的异同;
3. 理解线虫RNA干扰技术的基本原理,并学会使用该方法对目的基因进行干扰。
二、 实验原理
秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegan)属于线虫动物门(Nematoda)隐杆线虫属(Caenorhabditis)秀丽隐杆线虫种(C.elegans),根据命名法则中的二名法命名为Caenorhabditis elegans。上世纪六七十年代分子遗传学的奠基人之一Sydney Brenner将线虫作为分子生物学和发育生物学研究的模式生物。
C.elegans为蠕虫状,长度约1mm,因其个体结构简单、体细胞数目恒定,特定细胞位置固定,生活史短、遗传背景清楚、基因组测序已经完成等,在遗传与发育生物学、行为与神经生物学、衰老与寿命、人类遗传性疾病、病原体与生物机体的相互作用、药物筛选、动物的应急反应、环境生物学和信号传导等领域得到广泛应用。如细胞凋亡现象及其机理以及RNA干扰技术最早都是在线虫中被揭示的。
C.elegans的基本结构以及生活史
C.elegans有雌雄同体(XX)和雄虫(XO)两种性别,在自然条件下, 成虫大多为雌雄同体,雄虫的个体数只占大约千分之一。其基本的结构包括口、咽、肠、性腺以及胶原蛋白角质层,雌雄同体有两个卵巢、输卵管、储精囊,及单一一个子宫(图1,2),雄性有个单叶的性腺、输精管及一个特化为交配用的尾部(图3,4)。
C.elegans是唯一一个身体中的所有细胞能被逐个盘点并各归其类的生物。其幼虫含有556个体细胞和2个原始生殖细胞,而它的成虫则根据性别不同具有不同的细胞数。最常见的雌雄同体成虫在发育期间,共产生1090个细胞,其中131个在特定时期凋亡,因此,其成熟后含有959个体细胞和2000个生殖细胞,而较少见的雄性成虫则只有1031个体细胞和1000个生殖细胞。
C. elegans有五对常染色体和一对性染色体,是一个染色体数很少的二倍体。
图1 雌雄同体线虫解剖示意图
内容需要下载文档才能查看
1
图2 雌雄同体线虫
A.DIC(微分干涉显微镜)拍
摄的图;
B. 雌雄同体线虫解剖示意图
图3 雄虫
A. 雄虫解剖示意图;
B. DIC(微分干涉显微镜)
拍摄的图;
C. 性腺放大图;
D. 成虫尾巴放大图;
E. L3 L4时期雄虫尾巴图
(上面是L4,下面是L3)
图4:电镜下的雄虫 图5 雄虫和雌雄同体线虫交配
C.elegans的生活史包括胚胎期、幼虫期(L1-L4)、成虫期三个阶段(如图6)。一个雌雄同体线虫一生约可以产300个卵,卵经过L1、L2、L3、L4 4个幼虫时期,进入成虫期,如果外部条件比较恶劣,比如:拥挤、缺乏食物等,线虫会进入一个特殊的L3时期——dauer时期来抵抗外部的不良环境。C.elegans在实验室20-22℃的条件下,约3.5天长成成虫,可存活两到三周。线虫可以自体受精,当卵母细胞经过贮精囊时受精,也可以接受雄虫的精子进行异体受精(图5)。
2
图6 22℃下秀丽隐杆线虫的生命周期
内容需要下载文档才能查看
3
(二)线虫RNAi技术:
RNAi (RNA-mediated interference)技术是指与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默现象。其作用机制是双链RNA被特异的核酸酶降解,产生干扰小RNA(siRNA),这些siRNA与同源的靶RNA互补结合,特异性酶降解靶RNA,从而抑制、下调基因表达(图7)。RNAi技术已经发展成为基因治疗、基因结构功能研究的快速而有效的方法。
图7 RNAi原理示意图
1、长的双链RNA(Long double-stranded
RNAs, dsRNAs; typically >200 nt)被引
入细胞;
2、宿主细胞对这些dsRNAs产生反应,核
酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有
特定长度和结构的小片段RNA(大约21~
23 bp),即siRNA;
3、siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下
解链成正义链和反义链,反义siRNA再与
体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶
等)结合形成RNA诱导的沉默复合物
(RNA-induced silencing complex,RISC);
4、RISC与外源性基因表达的mRNA的同
源区进行特异性结合,RISC具有核酸酶的
功能,在结合部位的两端切割mRNA,使
目标mRNA降解;
1998年,Fire建立了线虫RNA干扰技术,由于线虫RNAi操作简单、特异性高、干扰效果持久,并且也是一种最简单有效的抑制特定基因表达的方法,已经成为反向遗传学研究的一个有力的工具。
线虫RNAi 干扰的方法主要有三种:一、直接显微注射dsRNA;二、将线虫培养在含有dsRNA的液体培养基中;三、喂食能够表达dsRNA的大肠杆菌。其中第三种方法由于适用于大规模的操作,简单经济等原因,使用比较普遍。
本实验采用喂食能够表达dsRNA大肠杆菌的方法,来干扰线虫Chc-1以及DAF-16两个基因的表达。
Chc-1参与卵黄的内吞作用,当RNAi使其表达量下降后可导致线虫的胚胎死亡,线虫发育阻滞在幼虫期。在做RNAi干扰实验时,通常用这个基因作为阳性对照。
4
Daf-16是FOXO家族的成员,该基因主要是通过其转录因子的功能调控一些基因的表达来参与细胞功能。研究表明,DAF-16基因同寿命、免疫力密切相关,是一种寿命调控因子。
实验用的大肠杆菌是OP50以及HT115(DE3)。HT115(DE3)菌株是RNAse III(dsRNA特异性降解酶)缺陷型,并且可以通过IPTG诱导T7 RNA聚合酶的大量表达。
实验用的质粒有三种:L4440空载质粒,Chc-1干扰质粒(多克隆位点插入Chc-1基因的L4440质粒),Daf-16干扰质粒(多克隆位点插入Daf-16基因的L4440质粒)。
图8 L4440质粒结构图
实验用的C.elegans有两种,野生型N2以及突变型TJ356。TJ356线虫的基因组中整合了DAF-16::GFP以及roller基因。DAF-16::GFP主要定位在肌肉细胞,肠道细胞和神经细胞,这些部位有绿色荧光产生,而roller基因可以导致线虫不能顺利呈S型游动,而是在原地转圈,所以在培养基上可看见一个一个圆圈。
三、 实验器材
(一) 实验用品
恒温生化培养箱、解剖显微镜、超净工作台、6cm培养皿、挑针、摇床、10ml离心管以及管架、1.5ml离心管以及管架、250ml锥形瓶、酒精灯、75%酒精棉球
(二) 实验材料
野生型N2线虫、TJ356线虫、E. coli OP50以及HT115、LB固体培养基、LB
内容需要下载文档才能查看液
5
下载文档
热门试卷
- 2016年四川省内江市中考化学试卷
- 广西钦州市高新区2017届高三11月月考政治试卷
- 浙江省湖州市2016-2017学年高一上学期期中考试政治试卷
- 浙江省湖州市2016-2017学年高二上学期期中考试政治试卷
- 辽宁省铁岭市协作体2017届高三上学期第三次联考政治试卷
- 广西钦州市钦州港区2016-2017学年高二11月月考政治试卷
- 广西钦州市钦州港区2017届高三11月月考政治试卷
- 广西钦州市钦州港区2016-2017学年高一11月月考政治试卷
- 广西钦州市高新区2016-2017学年高二11月月考政治试卷
- 广西钦州市高新区2016-2017学年高一11月月考政治试卷
- 山东省滨州市三校2017届第一学期阶段测试初三英语试题
- 四川省成都七中2017届高三一诊模拟考试文科综合试卷
- 2017届普通高等学校招生全国统一考试模拟试题(附答案)
- 重庆市永川中学高2017级上期12月月考语文试题
- 江西宜春三中2017届高三第一学期第二次月考文科综合试题
- 内蒙古赤峰二中2017届高三上学期第三次月考英语试题
- 2017年六年级(上)数学期末考试卷
- 2017人教版小学英语三年级上期末笔试题
- 江苏省常州西藏民族中学2016-2017学年九年级思想品德第一学期第二次阶段测试试卷
- 重庆市九龙坡区七校2016-2017学年上期八年级素质测查(二)语文学科试题卷
- 江苏省无锡市钱桥中学2016年12月八年级语文阶段性测试卷
- 江苏省无锡市钱桥中学2016-2017学年七年级英语12月阶段检测试卷
- 山东省邹城市第八中学2016-2017学年八年级12月物理第4章试题(无答案)
- 【人教版】河北省2015-2016学年度九年级上期末语文试题卷(附答案)
- 四川省简阳市阳安中学2016年12月高二月考英语试卷
- 四川省成都龙泉中学高三上学期2016年12月月考试题文科综合能力测试
- 安徽省滁州中学2016—2017学年度第一学期12月月考高三英语试卷
- 山东省武城县第二中学2016.12高一年级上学期第二次月考历史试题(必修一第四、五单元)
- 福建省四地六校联考2016-2017学年上学期第三次月考高三化学试卷
- 甘肃省武威第二十三中学2016—2017学年度八年级第一学期12月月考生物试卷
网友关注
- [2005-3]薪酬设计及绩效管理Word
- 最新汽车基础知识大全(完整版)Word
- 第15章 中国特色社会主义事业的领导Word
- 丰田人才培养方案Word
- 1306班小组组员评价细则
- 写给朋友·没有别离
- 冬日,一杯热茶,安于一份淡然。
- 起诉书Word
- 脱硝技术介绍Word
- 常熟葡萄牙语培训哪里好
- 多读一本书
- 国际贸易实务--东北财大版Word
- 典型燃油压Word
- 五1民族团结诗歌
- 天下没有不散的宴席
- 新标准英语四下M3U2-On-Monday-I’ll-go-swimmingWord
- 2016年九年级物理下册期末试题及答案(人教版)
- 哈尔滨葡萄牙语培训哪里好
- 京准通京挑客操作流程介绍Word
- 汽油发动机Word
- 第4章_国际直接投资方式Word
- 第三讲市政管理模式变迁与范式转换Word
- 多彩的季节
- 端午的鸭蛋教学案
- 学习党章党规做合格党员Word
- 定制巴士合作方案Word
- 酒店服务语言技巧Word
- 营销之道MBA(简约版)Word
- 2017.5月超星尔雅《音乐鉴赏》期末考试卷答案
- 05 瓷器礼物包装结构设计Word
网友关注视频
- 《小学数学二年级下册》第二单元测试题讲解
- 沪教版牛津小学英语(深圳用) 四年级下册 Unit 4
- 【部编】人教版语文七年级下册《逢入京使》优质课教学视频+PPT课件+教案,辽宁省
- 冀教版小学数学二年级下册1
- 化学九年级下册全册同步 人教版 第18集 常见的酸和碱(二)
- 七年级英语下册 上海牛津版 Unit9
- 人教版历史八年级下册第一课《中华人民共和国成立》
- 3月2日小学二年级数学下册(数一数)
- 第4章 幂函数、指数函数和对数函数(下)_六 指数方程和对数方程_4.7 简单的指数方程_第一课时(沪教版高一下册)_T1566237
- 沪教版牛津小学英语(深圳用) 四年级下册 Unit 7
- 第五单元 民族艺术的瑰宝_15. 多姿多彩的民族服饰_第二课时(市一等奖)(岭南版六年级上册)_T129830
- 【部编】人教版语文七年级下册《过松源晨炊漆公店(其五)》优质课教学视频+PPT课件+教案,辽宁省
- 3.2 数学二年级下册第二单元 表内除法(一)整理和复习 李菲菲
- 苏科版数学八年级下册9.2《中心对称和中心对称图形》
- 8 随形想象_第一课时(二等奖)(沪教版二年级上册)_T3786594
- 第12章 圆锥曲线_12.7 抛物线的标准方程_第一课时(特等奖)(沪教版高二下册)_T274713
- 沪教版牛津小学英语(深圳用) 六年级下册 Unit 7
- 二年级下册数学第三课 搭一搭⚖⚖
- 苏教版二年级下册数学《认识东、南、西、北》
- 七年级英语下册 上海牛津版 Unit3
- 六年级英语下册上海牛津版教材讲解 U1单词
- 沪教版八年级下册数学练习册20.4(2)一次函数的应用2P8
- 外研版英语七年级下册module1unit3名词性物主代词讲解
- 【部编】人教版语文七年级下册《泊秦淮》优质课教学视频+PPT课件+教案,天津市
- 外研版英语三起5年级下册(14版)Module3 Unit1
- 第19课 我喜欢的鸟_第一课时(二等奖)(人美杨永善版二年级下册)_T644386
- 北师大版数学 四年级下册 第三单元 第二节 小数点搬家
- 北师大版数学四年级下册3.4包装
- 二年级下册数学第二课
- 冀教版小学数学二年级下册第二单元《租船问题》
精品推荐
- 2016-2017学年高一语文人教版必修一+模块学业水平检测试题(含答案)
- 广西钦州市高新区2017届高三11月月考政治试卷
- 浙江省湖州市2016-2017学年高一上学期期中考试政治试卷
- 浙江省湖州市2016-2017学年高二上学期期中考试政治试卷
- 辽宁省铁岭市协作体2017届高三上学期第三次联考政治试卷
- 广西钦州市钦州港区2016-2017学年高二11月月考政治试卷
- 广西钦州市钦州港区2017届高三11月月考政治试卷
- 广西钦州市钦州港区2016-2017学年高一11月月考政治试卷
- 广西钦州市高新区2016-2017学年高二11月月考政治试卷
- 广西钦州市高新区2016-2017学年高一11月月考政治试卷
分类导航
- 互联网
- 电脑基础知识
- 计算机软件及应用
- 计算机硬件及网络
- 计算机应用/办公自动化
- .NET
- 数据结构与算法
- Java
- SEO
- C/C++资料
- linux/Unix相关
- 手机开发
- UML理论/建模
- 并行计算/云计算
- 嵌入式开发
- windows相关
- 软件工程
- 管理信息系统
- 开发文档
- 图形图像
- 网络与通信
- 网络信息安全
- 电子支付
- Labview
- matlab
- 网络资源
- Python
- Delphi/Perl
- 评测
- Flash/Flex
- CSS/Script
- 计算机原理
- PHP资料
- 数据挖掘与模式识别
- Web服务
- 数据库
- Visual Basic
- 电子商务
- 服务器
- 搜索引擎优化
- 存储
- 架构
- 行业软件
- 人工智能
- 计算机辅助设计
- 多媒体
- 软件测试
- 计算机硬件与维护
- 网站策划/UE
- 网页设计/UI
- 网吧管理