发育生物学教案-2015年

实验一 秀丽隐杆线虫的培养及其发育过程的观察

一、 实验目的

1. 理解线虫作为模式生物的优势以及在相关研究领域的应用；

2. 掌握线虫的基本培养技术，观察并且区分两种线虫个体发育过程的异同；

3. 理解线虫RNA干扰技术的基本原理，并学会使用该方法对目的基因进行干扰。

二、 实验原理

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegan）属于线虫动物门（Nematoda）隐杆线虫属（Caenorhabditis）秀丽隐杆线虫种（C.elegans），根据命名法则中的二名法命名为Caenorhabditis elegans。上世纪六七十年代分子遗传学的奠基人之一Sydney Brenner将线虫作为分子生物学和发育生物学研究的模式生物。

C.elegans为蠕虫状，长度约1mm，因其个体结构简单、体细胞数目恒定，特定细胞位置固定，生活史短、遗传背景清楚、基因组测序已经完成等，在遗传与发育生物学、行为与神经生物学、衰老与寿命、人类遗传性疾病、病原体与生物机体的相互作用、药物筛选、动物的应急反应、环境生物学和信号传导等领域得到广泛应用。如细胞凋亡现象及其机理以及RNA干扰技术最早都是在线虫中被揭示的。

C.elegans的基本结构以及生活史

C.elegans有雌雄同体（XX）和雄虫(XO)两种性别，在自然条件下， 成虫大多为雌雄同体，雄虫的个体数只占大约千分之一。其基本的结构包括口、咽、肠、性腺以及胶原蛋白角质层，雌雄同体有两个卵巢、输卵管、储精囊，及单一一个子宫（图1，2），雄性有个单叶的性腺、输精管及一个特化为交配用的尾部（图3，4）。

C.elegans是唯一一个身体中的所有细胞能被逐个盘点并各归其类的生物。其幼虫含有556个体细胞和2个原始生殖细胞，而它的成虫则根据性别不同具有不同的细胞数。最常见的雌雄同体成虫在发育期间，共产生1090个细胞，其中131个在特定时期凋亡，因此，其成熟后含有959个体细胞和2000个生殖细胞，而较少见的雄性成虫则只有1031个体细胞和1000个生殖细胞。

C. elegans有五对常染色体和一对性染色体，是一个染色体数很少的二倍体。

图1 雌雄同体线虫解剖示意图

1

图2 雌雄同体线虫

A．DIC（微分干涉显微镜）拍

摄的图；

B. 雌雄同体线虫解剖示意图

图3 雄虫

A. 雄虫解剖示意图；

B. DIC（微分干涉显微镜）

拍摄的图；

C. 性腺放大图；

D. 成虫尾巴放大图；

E. L3 L4时期雄虫尾巴图

（上面是L4，下面是L3）

图4：电镜下的雄虫 图5 雄虫和雌雄同体线虫交配

C.elegans的生活史包括胚胎期、幼虫期（L1-L4）、成虫期三个阶段（如图6）。一个雌雄同体线虫一生约可以产300个卵，卵经过L1、L2、L3、L4 4个幼虫时期，进入成虫期，如果外部条件比较恶劣，比如：拥挤、缺乏食物等，线虫会进入一个特殊的L3时期——dauer时期来抵抗外部的不良环境。C.elegans在实验室20-22℃的条件下，约3.5天长成成虫，可存活两到三周。线虫可以自体受精，当卵母细胞经过贮精囊时受精，也可以接受雄虫的精子进行异体受精（图5）。

2

图6 22℃下秀丽隐杆线虫的生命周期

3

（二）线虫RNAi技术：

RNAi （RNA-mediated interference）技术是指与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默现象。其作用机制是双链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达（图7）。RNAi技术已经发展成为基因治疗、基因结构功能研究的快速而有效的方法。

图7 RNAi原理示意图

1、长的双链RNA（Long double-stranded

RNAs， dsRNAs; typically >200 nt）被引

入细胞；

2、宿主细胞对这些dsRNAs产生反应，核

酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有

特定长度和结构的小片段RNA（大约21～

23 bp），即siRNA；

3、siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下

解链成正义链和反义链，反义siRNA再与

体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶

等)结合形成RNA诱导的沉默复合物

(RNA-induced silencing complex，RISC)；

4、RISC与外源性基因表达的mRNA的同

源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的

功能，在结合部位的两端切割mRNA，使

目标mRNA降解；

1998年，Fire建立了线虫RNA干扰技术，由于线虫RNAi操作简单、特异性高、干扰效果持久，并且也是一种最简单有效的抑制特定基因表达的方法，已经成为反向遗传学研究的一个有力的工具。

线虫RNAi 干扰的方法主要有三种：一、直接显微注射dsRNA；二、将线虫培养在含有dsRNA的液体培养基中；三、喂食能够表达dsRNA的大肠杆菌。其中第三种方法由于适用于大规模的操作，简单经济等原因，使用比较普遍。

本实验采用喂食能够表达dsRNA大肠杆菌的方法，来干扰线虫Chc-1以及DAF-16两个基因的表达。

Chc-1参与卵黄的内吞作用，当RNAi使其表达量下降后可导致线虫的胚胎死亡，线虫发育阻滞在幼虫期。在做RNAi干扰实验时，通常用这个基因作为阳性对照。

4

Daf-16是FOXO家族的成员，该基因主要是通过其转录因子的功能调控一些基因的表达来参与细胞功能。研究表明，DAF-16基因同寿命、免疫力密切相关，是一种寿命调控因子。

实验用的大肠杆菌是OP50以及HT115（DE3）。HT115（DE3）菌株是RNAse III（dsRNA特异性降解酶）缺陷型，并且可以通过IPTG诱导T7 RNA聚合酶的大量表达。

实验用的质粒有三种：L4440空载质粒，Chc-1干扰质粒（多克隆位点插入Chc-1基因的L4440质粒），Daf-16干扰质粒（多克隆位点插入Daf-16基因的L4440质粒）。

图8 L4440质粒结构图

实验用的C.elegans有两种，野生型N2以及突变型TJ356。TJ356线虫的基因组中整合了DAF-16::GFP以及roller基因。DAF-16::GFP主要定位在肌肉细胞，肠道细胞和神经细胞，这些部位有绿色荧光产生，而roller基因可以导致线虫不能顺利呈S型游动，而是在原地转圈，所以在培养基上可看见一个一个圆圈。

三、 实验器材

（一） 实验用品

恒温生化培养箱、解剖显微镜、超净工作台、6cm培养皿、挑针、摇床、10ml离心管以及管架、1.5ml离心管以及管架、250ml锥形瓶、酒精灯、75%酒精棉球

（二） 实验材料

野生型N2线虫、TJ356线虫、E. coli OP50以及HT115、LB固体培养基、LB

液

5