鸡传染性法氏囊病病毒的反向遗传研究

第２２卷第３期病毒学报

Ｖ０１．２２

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鸡传染性法氏囊病病毒的反向遗传研究

祁小乐１，一，王笑梅１，高宏雷１，高玉龙１

（１．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨１５０００１；

２．中国农业科学院研究生院，北京

中图分类号：￥８５８．３１

文献标识码：Ａ

ｂｕｒｓａｌ

１０００８１）

文章编号：１０００—８７２１（２００６）０３—０２３７—０４

ＤＮＡ阶段，所以要对ＲＮＡ病毒进行分子水平上的操作，必需获得病毒基因组全长ｃＤＮＡ。然后通过体内或体外转录系统获得感染性转录本，进而使病毒重新再现，这个过程叫病毒拯救技术。近１０年来，拯救ＩＢＤＶ主要运用３个系统。１．１体外转录拯救系统

体外转录拯救系统是指由外源Ｔ７ＲＮＡ聚合酶将病毒基因组ｃＤＮＡ转录成ｃＲＮＡ再转染细胞进行拯救病毒的系

鸡传染性法氏囊病（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ染性法氏囊病病毒（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ

ｄｉｓｅａｓｅ，ＩＢＤ）是由传ｖｉｒｕｓ，ＩＢＤＶ）引起

ｂｕｒｓａｌｄｉｓｅａｓｅ

的一种危害鸡的急性、高度接触性、免疫抑制性传染病。该病由Ｃｏｓｇｒｏｖｅ于１９６２年作为一种新的疾病首次报道，最初病死率并不高（５％左右），但到了上世纪８０年代末９０年代初，陆续出现了变异株和超强毒株，病死率大大提高（８０％左右）。该病现已大面积流行于欧州、东南亚、非州、南美洲等［１Ｊ。我国的流行情况也十分复杂，变异株和超强毒株均有报道。

ＩＢＤＶ有两个血清型，即血清Ｉ型（鸡源型）和血清Ⅱ型（火鸡源型，对鸡不致病），属双ＲＮＡ病毒科（Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅｆａｍｉｌｙ），无囊膜，基因组由Ａ、Ｂ两个双链ＲＮＡ节段组成。Ａ节段（约３２００ｂｐ）编码区含有２个开放阅读框，小ＯＲＦ一２在前，编码对病毒复制非必需的非结构蛋白ＶＰ５；大ＯＲＦ０１在后，编码ｖＰ２．４—３。ｖＰ２具有能诱导中和抗体的构象依赖性抗原表位，是病毒的．主要宿主保护性免疫原；ＶＰ３具有一个非构象依赖性（连续）的、群特异性的抗原表位；ＶＰ２和ＶＰ３是ＩＢＤＶ的主要结构蛋白，构成病毒核衣壳；ＶＰ４具有蛋白水解酶活性，在病毒蛋白的成熟过程中起着重要作用。Ｂ节段（约２８００ｂｐ）含有一个开放阅读框，编码具有ＲＮＡ聚合酶活性、与病毒复制有关的ＶＰｌ。ＩＢＤＶ在遗传演化过程中发生了致病性和抗原性的变异，给防制带来了新的挑战。因此加强对ＩＢＤＶ的基础研究是控制该病的关键。ＩＢＤＶ反向遗传研究始于１９９６年，已取得了一定的成就，国内在该领域的研究也已经起步。本文从病毒拯救技术、基因功能研究、标记疫苗研发等多个方面对国内外ＩＢＤＶ反向遗传研究现状作一综述，并分析了该领域存在的问题和仍须重点研究的方向。

１

统。用于拯救的病毒基因组５’端带有ｗ启动子核心序列。

体外转录试剂盒一般在ｃＲＮＡ５’端引入帽子结构（ｍ７ＧｐｐｐＧ），可模仿连接ＩＢＤＶ基因组的ＶＰｇ，有利于提高病毒拯救效率。

１９９６年，Ｍｕｎｄｔ等运用该系统在世界上首次成功拯救了ＩＢＤＶ，开创了分节段双链ＲＮＡ病毒（特别是ＩＢＤＶ）分子水平研究的新局面【２Ｊ。当时克隆基因组采用的是“先分段扩增再拼接全长”的传统方法。包含减毒株１３７８的Ａ节段和疫苗株Ｐ２的Ｂ节段的重组载体，用Ｔ７ＲＮＡ聚合酶体外转录系统生成ｃＲＮＡ。ｃＲＮＡ经脂质体介导共转染Ｖｅｒｏ细胞而获得拯救病毒。２００１年，Ｂｒａｎｄｔ等在拯救减毒株Ｉ）７８的基础上，用体外转录系统拯救出了含有ＩＢＤＶ经典毒株ＩＭＶＰ２的嵌合病毒ｒＩＭＶＰ２。ｃＲＮＡ通过电击的方法转染Ｖｅｒｏ或ＣＥＦ细胞，然后将反复冻融后的细胞悬液在鸡胚尿囊膜上传代（因为经典毒株ＩＭ不适应Ｖｅｒｏ或ＣＥＦ细胞）获得嵌合病毒¨Ｊ。

１．２基于ＷＲＮＡ聚合酶的体内转录拯救系统

基于１７ＲＮＡ聚合酶的体内转录系统，是指转染细胞的病毒基因组ｃＤＮＡ由内源Ｔ７ＲＮＡ聚合酶启动转录和复制的病毒拯救系统。直接转染ｃＤＮＡ比转染ｃＲＮＡ有更高的转染效率【４』。该系统比体外转录更确实、更方便、更经济。按照Ｔ７ＲＮＡ聚合酶来源的不同，该系统又可分为三类：①ＶＶ／ｒ７（痘苗病毒／１７ＲＮＡ聚合酶）系统：Ｔ７ＲＮＡ聚合酶由可以表达Ｔ７ＲＮＡ聚合酶的重组痘苗病毒提供。将ｖｖ／

ＩＢＤＶ拯救系统概述

由于非反转录ＲＮＡ病毒在复制表达过程中不经历

收稿日期：２００５—１０—０９；修回日期：２００５—１１—２８

基金项目：国家９７３项目“动物重大传染病病原变异与致病的分

１７和含有Ｔ７启动子的重组质粒先后转染细胞，ＶＶ／１７先在细胞内表达Ｔ７ＲＮＡ聚合酶，再由Ｔ７ＲＮＡ聚合酶去启动外源病毒基因组或反基因组的转录。但ＶＶ／１＿７的复制及其所产生的细胞病变（ＣＰＥ）会于扰病毒拯救。②以ＦＰＶ／

子机制”（２００５ＣＢ５２３２０２）资助。

作者简介：祁小乐（１９８０一），男，河南宜阳人，在读博士生，主要从事动物病毒学研究。

通讯作者：王笑梅（１９６２一），女，研究员，博士生导师。Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｍｗ＠ｈｖｒｉ．ａｃ．ｃｎ

Ｗ（禽痘病毒／Ｔ７ＲＮＡ聚合酶）为代表的替代系统【５】：ＦＰＶ

只能在禽类及其衍生细胞中复制，可感染哺乳动物细胞但不

能增殖和产生ＣＰＥ，更有利于病毒拯救。③直接表达Ｗ

２３８ 病毒学报２２卷

ＲＮＡ聚合酶的细胞系：如基于ＢＨＫ２１的ＢｓＲ１ｒ７／５细胞系，该细胞能够稳定表达Ｔ７ＲＮＡ聚合酶，运用该细胞拯救病毒，不需要共转染能够提供Ｔ７ＲＮＡ聚合酶的ＶＶ或ＦＰｖ，更加方便可靠。

Ｂｏｏｔ等首次运用一步法分别扩增出了ＩＢＤＶ减毒株ＣＥＦ９４和超强毒株Ｄ６９４８的基因组Ａ节段与Ｂ节段的全长№Ｊ。与传统的“先分段扩增再拼接全长”的基因组扩增思路相比，该方法简便、经济、保真性好。基因组３’端引入了丁肝病毒核酶序列（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ

ｄｅｌｔａ

ｒｏｌｏｏｚｙｍｅ，ＨｄｖＲｚ），作为顺式

作用元件，有助于在转录水平产生精确的基因组３’端，这对高效拯救病毒甚为关键＂Ｊ。以此为基础，Ｂｏｏｔ等运用ＦＰＶ／Ｔ７转录系统成功拯救了ＩＢＤＶ减毒株ＣＥＦ９４【８Ｊ。

由于ｖｖｌＢＤＶ只适应Ｂ淋巴细胞培养，所以关于ｖｖｌＢ—ＤＶ的反向遗传系统一直难以建立。以Ｂｏｏｔ为首的研究团队于１９９９年末运用ＶＶ／１７系统成功拯救了超强毒株Ｄ６９４８［引。病毒基因组先转染ＱＭ５细胞，然后在原代法氏囊细胞上增殖传代。这是世界上首次关于ｖｖｌＢＤＶ成功拯救的报道，为进一步研究ＩＢＤＶ毒力变异机制奠定了基础。

１．３

ＲＮＡ聚合酶Ⅱ表达拯救系统

ＲＮＡ聚合酶Ⅱ表达拯救系统直接利用真核生物ＲＮＡ

聚合酶Ⅱ启动子去驱动病毒转录，一般选用ＣＭＶ启动子。在提高外源基因表达特异性和表达量方面，真核细胞ＲＮＡ聚合酶Ⅱ不如噬菌体Ｔ７ＲＮＡ聚合酶功能强大。考虑到ＩＢ—ＤＶ基因组较小，ＲＮＡ聚合酶Ⅱ表达系统应该适用于ＩＢＤＶ的拯救。

１９９９年，香港大学的Ｌｉｍ等将引入了点突变（Ｄ２７９Ｎ和Ａ２８４Ｔ）的ｖｖｌＢＤＶＨＫ４６毒株的基因组克隆到含有ＣＭＶ启

动子和ＳＶ４０ｐｏｌｙ（Ａ）的真核表达载体ｐＡＬＴＥＲ—ＭＡＸ中，然

后在ＣＥＦ上获得了ｗｌＢＤＶ的拯救【１０］。２００３年，浙江大学黄耀伟等运用ＲＮＡ聚合酶Ⅱ表达系统拯救出了ＩＢＤＶ减毒株ＨＺ２…Ｊ。２００５年，该课题组构建的重组质粒直接注射到１４日龄的非免疫鸡体内，１４ｄ后，发现拯救的病毒ｒＨＺ２和ｒＡｋＺＪ／ＨＺ能致法氏囊病变［他Ｊ。２利用反向遗传技术开展的研究２．１对非编码区功能的研究

借助反向操作平台，Ｂｏｏｔ等研究了ＩＢＤＶ基因组两端非编码区对病毒复制和转录的影响［８，”Ｊ。ＩＢＤＶ基因组Ａ节段３７末端通常有４个胞嘧啶。ＢＯＯｔ等通过引物对ＣＥＦ９４毒株Ａ节段编码链３’末端的长度进行修饰，然后拯救出一系列Ａ节段３’末端长度不同的病毒。研究发现，Ａ节段３７末端有３～６个连续胞嘧啶的拯救病毒，其ＴＣＩＤ５０与未修饰的ＣＥＦ９４差异不显著；Ａ节段３’末端少于３个连续胞嘧啶则严重影响病毒的复制【８Ｊ。这一结果有力地支持了基因组连接蛋白ＶＰｇ介导的蛋白引物假说¨４｜。有意思的是，拯救的病毒为保持３７末端ｓｔｅｍ—ｌｏｏｐ结构的完整性，其修饰过的３’末端有回复突变的现象。

最近，Ｂｏｏｔ等通过一系列突变修饰，对ＣＥＦ９４毒株Ｂ节段编码链３。末端的功能进行了系统研究［１３］。通过在ｓｔｅｍ—

ｌｏｏｐ结构不同位点引入突变，拯救出了１４株病毒。将这些病毒在ＱＭ５细胞或鸡胚上传４～１０代，序列分析发现，除了人工引入的突变外，在ｓｔｅｍ—ｌｏｏｐ的其它位点出现了补偿性突变。综合以上关于ＩＢＤＶ基因组两端非编码区的研究，可以得出这样的结论：①３’末端非编码区的ｓｔｅｍ—ｌｏｏｐ结构可防止３’一５’外切酶对ＲＮＡ的降解，有利于维持ＲＮＡ的稳定，它还能够直接或间接地与病毒或宿主相关蛋白因子结合，对病毒基因组的复制和转录至关重要；②决定ｓｔｅｍ—ｌｏｏｐ结构功能的是其二级结构而非原始序列；③补偿突变是由于引入的突变改变了ｓｔｅｍ—ｌｏｏｐ结构的稳定性而导致病毒对环境的适应性变化。２．２对细胞嗜性的研究

２００１年，Ｂｒａｎｄｔ等在拯救减毒株Ｄ７８的基础上，用体外转录系统拯救出了分别含有ＩＢＤＶ经典毒株１Ｍ

ＶＰ２、ＶＰ４、

ＶＰ４３和Ｂ节段以及变异株ＧＬＳＶＰ２的嵌合病毒ｒＩＭＶＰ２、

ｒＩＭＶＰ４、ｒｌＭＶＰ４３、ｒＩＭＢ和ｒＧＬＳＶＰ２ｔ３ｆ。只有ｒＩＭＶＰ２不

能在ＣＥＦ或Ｖｅｒｏ上得到拯救，说明控制ＩＢＤＶ对ＣＥＦ或Ｖｅｒｏ嗜性的分子基础在ＶＰ２上。ＶＰ２氨基酸序列比较发现，减毒株Ｄ７８与不适应细胞培养的囊毒ＩＭ、Ｅｄｇａｒ和ＳＴＣ只有四个位点不一样，即２５３、２７９、２８４、３３０位，其它囊毒株ＵＫ６６１、ＨＫ４６、ＯＫＹＭ也存在这个特点。囊毒ＧＬＳ与细胞适应毒ＧＬＳ－５的ＶＰ２氨基酸序列比较也发现，只有２５３和２８４位不同‘３｜。

Ｍｕｎｄｔ对细胞嗜性的研究集中在ＶＰ２的２５３、２８４和３３０位氨基酸上｝１５｜。他将带有以上３个位点突变各种排列组合的欧洲变异株Ｅ／ＤＥＬ的部分ＶＰ２序列嵌合迸减毒株Ｄ７８，运用体外转录系统进行细胞嗜性研究。由于变异株Ｅ／

Ｄｅｌ不适应细胞培养，所以源于嵌合有Ｅ瓜ｌ株ＶＰ２部分序

列的ｐＤ７８Ａ—Ｅ／Ｄｅｌ与ｐＤ７８一Ｂ的ｅＲＮＡ共转染不能在ＱＭ一７或ＣＥＣ细胞上得到拯救。在ｐＤ７８Ａ－Ｅ／Ｄｅｌ的单位点突变０２５３Ｈ、Ａ２８４Ｔ、ｓ３３０Ｒ以及双位点突变（Ａ２８４Ｔ＆Ｓ３３０Ｒ、Ｑ２５３Ｈ＆ｓ３３０Ｒ）均不能改变ＩＢＤＶ的细胞嗜性，因此不能在ＯＭ一７或ＣＥＣ细胞上获得拯救。而双位点突变（Ｑ２５３Ｈ＆Ａ２８４Ｔ）和３位点突变（０２５３Ｈ＆Ａ２８４Ｔ＆ｓ３３０Ｒ）使病毒适应了ＱＭ一７或ＣＥＣ细胞而获得拯救。接着，Ｍｕｎｄｔ又从反方向验证了这３个位点对细胞嗜性的影响。单位点突变Ｈ２５３Ｑ、Ｔ２８４Ａ和３位点突变（Ｈ２５３Ｑ＆Ｔ２８４Ａ＆Ｒ３３０Ｓ）使Ｄ７８不再适应细胞培养，而Ｒ３３０Ｓ却无此作用。

Ｖａｎ．Ｌ０∞等对细胞嗜性的研究集中在ＶＰ２的２５３、２７９、２８４位氨基酸上【ｌ６｜。单位点突变Ｑ２５３Ｈ或Ｄ２７９Ｎ均不能使超强毒株ＵＫ６６１适应细胞培养，而Ａ２８４Ｔ能使ＵＫ６６１在细胞培养上得到拯救但滴度不高。双位点突变

（Ａ２８４Ｔ＆观７９Ｎ）使超强毒株ＨＫ４６在ＣＥＦ上能够复制［１０】。

这一结果令人振奋：它不仅使超强毒能够适应细胞培养，还能使毒力致弱。该突变株对ＳＰＦ鸡不致死，法氏囊无盟显病变。用该毒株免疫还能产生对经典强毒攻击的保护。２．３毒力分子基础研究

虽然一直认为ＶＰ２（特别是高变区）决定ＩＢＤＶ的毒力

３期

祁小乐等：鸡传染性法氏囊病病毒的反向遗传研究 ２３９

及其变异，但越来越多的证据表明，ＶＰ２以外的其它基因组部分对于构成病毒的毒力也是不可或缺的。

Ｂｏｏｔ等继拯救出超强毒１３６９４８后，又用同样的策略拯救出节段重组病毒ｓｒｌＢＤＶ—ＤＡＣＢ和ｓｒｌＢＤＶ—ＣＡＤＢ（一个病毒的两个节段分别来自ＣＥＦ９４和１３６９４８）。ｓｒｌＢＤＶ—ＤＡＣＢ和ｒＤ６９４８、１３６９４８一样能够导致严重的法氏囊病变甚至致鸡死亡。ｓｒｌＢＤＶ—ＣＡＤＢ在细胞嗜性和毒力上几乎与ｒＣＥＦ９４、ＣＥＦ９４一样，只是病毒复制有轻微的延迟［９］。这说明ＶＰｌ的变异对毒力影响很小。

紧接着，Ｂｏｏｔ等以ｐＨＢ３６Ｗ为骨架，用融合ＰＣＲ的方法分别将Ｄ６９４８的ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４置换ＣＥＦ９４的相应部位，拯救出了一批嵌合病毒ｍＣＥＦ９４一ｖｖＶＰ２、ｍＣＥＦ９４一ｖｖｖＰ３、ｍＣＥＦ９４．ｖｖＶＰ４。ｍＣＥＦ９４一ｖｖＶＰ２同ｒＤ６９４８和Ｄ６９４８具有同样的细胞嗜性，只能在原代法氏囊细胞上增殖。但在毒力方面，ｍＣＥＦ９４一ｗＶＰ２只能引起法氏囊病变却不能致死感染鸡∽Ｊ。这说明，ＶＰ２决定了ＩＢＤＶ的细胞嗜性，但并非是决定毒力的唯一因素。

Ｂｒａｎｄｔ等用其拯救的病毒ｒＤ７８、ｒｌＭＶＰ２、ｒｌＭＶＰ４、ｒｌＭＶＰ４３、ｒｌＭＢ和ｒＧＬＳＶＰ２感染３周龄ＳＰＦ鸡，３ｄ后取法氏囊组织进行病理分析［３］：ｒＤ７８、ｒｌＭＢ、ｒｌＭＶＰ４等３组均未出现任何病变，这提示ＶＰｌ和ＶＰ４与ＩＢＤＶ的毒力无关；ｒＧＬＳＶＰ２组法氏囊萎缩，ｒｌＭＶＰ２组和ＩＭ组法氏囊出血并有２０％～２５％的死亡率，这３组法氏囊皮质和髓质界限模糊、单核细胞大量浸润、淋巴滤胞破坏严重。这清楚地表明：ＩＢＤＶ毒力分子基础和致病性的分子标志主要在ＶＰ２上。ｒｌＭＶＰ４３组法氏囊出现了中等程度的显微病变，这预示了ＶＰ３可能与毒力相关。２．４标记疫苗研究

目前，由于ＩＢＤＶ商用疫苗都源自自然毒，无法用血清学方法鉴别疫苗免疫和野毒感染，所以利用反向遗传技术将有助于开发能被血清学方法鉴别的ＩＢＤｖ标记疫苗。

２．４．１

ＶＰ５缺失的研究

一：

ＩＢＤＶ的ＶＰ５是高度保守的，血清工型各毒株ＶＰ５的同源性大于９５％。ＶＰ５编码一个１７ｋＤ的非结构蛋白，该蛋白不参与组成病毒粒子，但在ＩＢＤＶ感染的细胞中可以被检测到【ｌ引。而且，ＶＰ５对ＩＢＤＶ的体内或体外复制是非必需的［１８＇１９】。这些特点把ＶＰ５引入了ＩＢＤＶ缺失疫苗研究者的视线。

Ｍｕｎｄｔ等在首次拯救出ＩＢＤＶ嵌合病毒的基础上，将ＶＰ５的起始密码子ＡＴＧ突变为精氨酸密码子ＡＧＧ，构建并拯救出了ＶＰ５缺失毒株ＩＢＤＶ／ＶＰ５－【１８Ｊ。拯救病毒感染ＣＥＣ细胞，１６ｈ后，未突变病毒ＩＢＤＶ／ＥＫ的滴度（ＴＣＩＤＳ０）比ＩＢＤＶ／ＶＰ５一高约１００倍；４８ｈ后，两者的滴度却相差无几。这表明，ＶＰ５对病毒的复制是非必需的；虽然ＶＰ５缺失不影响病毒的最终滴度，但却较严重地延迟了病毒的复制与释放。

１９９７年，Ｙａｏ等采用相似的思路和策略对ＶＰ５缺失进行了更为系统的研究。他们在拯救Ｄ７８的基础上，将ＶＰ５

的起始密码子ＡＴＧ突变为终止密码子ＴＡＧ，拯救出了ＶＰ５缺失毒株ｒＤ７８ＮＳ／ｘ【１９｜。基于噬斑试验测绘的病毒生长曲线显示，与未突变病毒ｒＤ７８相比，ｒＤ７８ＮＳＡ复制缓慢。动物（ＳＰＦ鸡）试验也显示同样的结果：ｒＤ７８在鸡体内复制速度极块，感染后４ｄ病毒滴度达到最高，６ｄ显著下降，９ｄ被完全清除；而ｒＤ７８ＮＳｚ生感染后第６ｄ病毒滴度才达到最高，第９ｄ法氏囊内仍能检测到病毒。这再一次证实，ＶＰ５虽然对病毒复制非必需，但却延缓了病毒的复制速率和释放时间。有意思的是，ＶＰ５缺失导致的病毒复制速率延迟并不影响宿主对ＩＢＤＶ的体液免疫反应强度，病毒感染后１４ｄ和２１ｄ的特异性抗体滴度，ｒＤ７８组和ｒＤ７８ＮＳＺＸ组差异不显著。

另外，ＶＰ５的缺失对ＩＢＤＶ的毒力致弱有一定影响［１９］。用ＭＴＴ法和台盼蓝染色法检测感染ＩＢＤＶ后的ＣＥＦ细胞活性：ＣＥＦ感染病毒后６ｄ，ｒＤ７８ＮＳ△组的活细胞量是ｒＤ７８组的３倍。病毒对ＣＥＦ的凋亡试验（ＴＵＮＥＬ法）显示：感染后７２ｈ，ｒＤ７８ＮＳＡ组的凋亡细胞比例（２３％）小于ｒＤ７８组（６９％）。对３周龄的ＳＰＦ鸡进行攻毒，分时段采取法氏囊进行组织病理观察：ｒＤ７８组法氏囊结构遭到破坏，Ｂ细胞减少，单核细胞大量渗出；ｒＤ７８ＮＳＺＸ组法氏囊未见宏观或显微病变。

ＶＰ５虽是构成病毒毒力的因素之一，但对于ＩＢＤＶ的复制非必需，相应的单因子血清或单克隆抗体又可以用作鉴别诊断，故而是ＩＢＤＶ标记疫苗极有前途的侯选基因。２．４．２嵌合病毒的研究

ＩＢＤＶ血清Ⅱ型有广泛的细胞嗜性，但通常只感染火鸡且对火鸡不致病。作为两个重要的衣壳蛋白之一，ＶＰ３没有中和抗原表位，但有可诱导一过性免疫反应的线性表位，其中有些表位是血清型特异性的［２ｏ｜。那么，血清Ⅱ型ＶＰ３特异性抗体就可以鉴别嵌合有血清Ⅱ型ＶＰ３的疫苗毒和任何血清Ｉ型来源的野毒。

Ｂｏｏｔ等以ｐＨＢ３６Ｗ为骨架，分别将血清Ⅱ型ＴＹ８９的

ＶＰ３全长、ＶＰ３Ｎ端部分、ＶＰ３Ｃ端部分置换ＣＥＦ９４的相应部位，拯救出了３个双血清型嵌合病毒ｍＣＥＦ—ｓ２ＶＰ３、ｍＣＥＦ－ｓ２ＶＰ３Ｎ、ｍＣＥＦ－ｓ２ＶＰ３ＣＬ２“。与ｒＣＥＦ相比。ｍＣＥＦ—ｓ２ＶＰ３和ｍＣＥＦ—ｓ２ＶＰ３Ｎ的拯救效率较低，而ｍＣＥＦ—ｓ２ＶＰ３Ｃ却能够被高效拯救。这表明ＶＰ３的Ｎ端部分比Ｃ端部分对病毒的复制影响大，这可能是由不同斑清型ＶＰ３

Ｎ

端高级结构的不同折叠造成的。ｍＣＥＦ－ｓ２ＶＰ３Ｃ病毒释放时间比ｒＣＥＦ有所延迟，但不影响最终的病毒滴度。同时，单克隆抗体ＶｌＩ

ｓ

ｌＩ可以鉴别ｍＣＥＦ－ｓ２ＶＰ３Ｃ与ｒＣＥＦ９４。所

以，血清Ⅱ型ＶＰ３Ｃ端部分也是开发ＩＢＤＶ标记疫苗很有前景的研究对象。

那么，将血清Ⅱ型ＴＹ８９的ＶＰ３Ｃ端部分嵌合进ｖｖＩＢ—

ＤＶ

Ｄ６９４８又会是一种怎样的效果呢？按照这个思路，Ｂｏｏｔ

等拯救出了嵌合病毒ｍＤＴ—ＶＰ３Ｃ和ｍＤＣＴ．ＶＰ３Ｃｔ２２］。虽然法氏囊／体重比、组织病理变化和免疫组化仍显示这两株嵌合病毒能够导致法氏囊的病变，但致死率却明显降低甚至不致死。这表明ＴＹ８９ＶＰ３Ｃ端部分的嵌合降低了Ｄ６９４８对

２４０ 病毒学报２２卷

ＳＰＦ鸡的毒力。血清型特异性单抗（如ＶＩＩｓＵ）又可以区分该嵌合病毒和Ｄ６９４８。３问题与展望

自１９９６年Ｍｕｎｄｔ等在世界上首次成功拯救ＩＢＤＶ以来，ＩＢＤＶ研究进入了反向遗传研究时代，数十个研究团体倾近十年之力拯救出了几十个经典毒、变异毒、超强毒、疫苗毒以及以此为骨架的突变病毒、嵌合病毒、节段重组病毒，研究内容涉及ＩＢＤＶ的基因功能、细胞嗜性、毒力分子基础、致病机理、致弱机理、免疫抑制机理等多个方面，使ＩＢＤＶ的基础研究面貌焕然一新。但仍存在很多不足，需要在以后的研究中给予高度重视。

病毒拯救方法方面。体外转录拯救系统、基于Ｔ７

ＲＮＡ

聚合酶的体内转录拯救系统、ＲＮＡ聚合酶Ⅱ表达拯救系统在ＩＢＤＶ的拯救中都有应用，转染方法有脂质体介导的、电击介导的、直接转染动物的，载体构建也都各有特色，但能否研究出一套最适合ＩＢＤＶ的、高效确实的、经济方便的模式化拯救方法，值得思考。

细胞嗜性方面。已经将影响细胞嗜性的分子基础定位在了ＶＰ２的２５３、２７９、２８４位氨基酸，并且初步阐明了２５３和２８４位的核心决定地位。但这几个氨基酸影响细胞嗜性的方式和机制仍未明了：仅有的几个氨基酸是如何通过改变病毒的表位而引起细胞嗜性的改变的？是单位点作用还是多位点协同作用？ＶＰ２之外的其它部分对病毒细胞嗜性有没有影响？太多的疑问等待着科研工作者去解答。

毒力分子基础方面。虽然已经阐明了一个“以ＶＰ２为主，多个基因及非编码区协同起作用”的毒力决定模式，但除了ｖＰ２之外，基因组还有哪些部分在起作用，起了什么作用，仍不清楚。至于具体的分子定位，更是需要进一步研究。

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ｖｅｒｙ

ｖｉｒｕｌｅｎｔａｎｄｍｏｓａｉｃ

ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｂｕｒｓａｌｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓｆｒｏｍｃｌｏｎｅｄｃＤＮＡ：ＶＰ２ｉｓ

ｎｏｔ

ｔｈｅｓｏｌｅ

ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｏｆｔｈｅｖｅｒｙ

ｖｉｒｕｌｅｎｔ

ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ［Ｊ］，ＪＶｉｍｌ，２０００，７４：

６７０１—６７１１．

［１０］Ｌｉｍ

Ｂ

Ｌ，Ｃａｏ

Ｙ

Ｃ，Ｙｕ

Ｔ，ｅｔ

ａｌ。Ａｄａｐｔｉｏｎｏｆ

ｖｅｒｙ

ｖｉｒｕｌｅｎｔｉｎｆｅｃ

ｔｉｏｕｓ

ｂｕｒｓａｌｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ

ｔｏ

ｃｈｉｃｋｅｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｂｙｓｉｔｅ－ｄｉ－

ｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｏｆｒｅｓｉｄｕｅｓ２７９ａｎｄ２８４ｏｆｖｉｒａｌ

ｃｏａｔ

ｐｒｏｔｅｉｎ

ＶＰ２

［Ｊ］．Ｊｖｉｒｏｌ，１９９９，７３（４）：２８５４—２８６２．［１１］ＨｕａｎｇＹＷ，ＬｉＬ，ＬｉＪＲ，ｅｔａ１．Ｒａｐｉｄ

ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ

ｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ

ｃｌｏｎｅｓｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｂｕｒｓａｌｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ［Ｊ］．ＳｈｅｎｇｗｕＨｕａＸｕｅＹｕ

Ｓｈｅｎｇ

ｗｕＷｕＬｉＸｕｅＢａｏ（Ｓｈａｎｇｈａｉ），２００３，３５（４）：３３８—３４４．

［１２］“Ｌ，ＨｕａｎｇＹＷ，Ｗａｎｇ

Ｌ

Ｓ，ｅｔａ１．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔｉｎｆｅｃ—

ｔｉｏｕｓ

ｂｕｒｓａｌｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓｉｎｃｈｉｃｋｅｎｓｉｎｊｅｃｔｅｄｄｉｒｅｃｔｌｙｗｉｔｈｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ

ｃｌｏｎｅｓｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔ

ｖｉｒｕｓ

ｓｔｒａｉｎｓ［Ｊ］．ＡｃｔａＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＳｉｎ，

２００５．３７（３）：１９２—１９８．

【１３］ＢｏｏｔＨｊ，ＳｙｌｖｉａＢＥ．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅ３’－ＵＴＲ

ｓｔ∞一ｌｏｏｐ

ｏｆ协一

ｆｅｅｔｉｏｕｓｂｕｒｓａｌｄｉｓｅａｓｅ

ｖｉｒｕｓａｒｅ

ａｌｌｏｗｅｄｗｉｔｈｏｕｔｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｒｅｐｌｉｃａ—

ｌｉｏｎ

ｏｒ

ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ［Ｊ］。ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，２００４，３２（１）：２１１～２２２．

［１４］Ｋｉｂｅｎｇｅ

Ｆ

Ｓ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅｔｈａｔｖｉｒｉｏｎ．ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＶＰｌｏｆａｖｉｂｉｒｎａｖｉｒｕｓｅｓ

ｃｏｎｔａｉｎｓ

ｖｉｒａｌＲＮＡ

ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ［Ｊ］．ＡｒｃｈＶｉｒｏｌ，１９９７，１４２：１２２７—

１２３６．

［１５］ＭｕｎｄｔＥ．Ｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔ

ｓｔｒａｉｎｓ

ｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ

ｂｕｒｓａｌｄｉｓｅａｓｅ

ｖｉｒｕｓｉｓ

ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｄｉｓｔｉｎｃｔａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎＶＰ２［Ｊ］．

ＪＧａｎＶｉｒｏｌ，１９９９，８０：２０６７—２０７６．

［１６］ＬｏｏｎＡＡ，ＨａａｓＮＤ，ＺｅｙｄａＩ．Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｏｆ

ｖｅｒｙ

ｖｉｒｕｌｅｎｔｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｂｕｒｓａｌｄｉｓｅａｓｅ

ｖｉｒｕｓ

ｒｅｓｕｌｔｓｉｎｔｉｓｓｕｅ

ｃｕｌｔｕｒｅａｄａｐ—

ｔｉｏｎａｎｄａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎｉｎ

ｃｈｉｃｋｅｎｓ［Ｊ］．ＪＧｅｎⅥｒｏｌ，２００２，８３：１２１—

１２９．

［１７］Ｂ６ｔｔｃｈｅｒＢ，ＫｉｓｅｌｅｖＮＡ，Ｍａｓｈｃｈｕｋ

Ｖ

Ｙ，ｅｔ

ａ１．Ｔｈｒｅｅ—ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ

ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ

ｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｂｕｒｓａｌｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉ－

ｅｒｏｓｃｏｐｙ［Ｊ］．ＪＶｉｒｏｌ，１９９７，７１：３２５—３３０。

［１８］ＭｕｎｄｔＥ，Ｋ６１１ｎｅｒＢ，ＫｒｅｔｚｓｃｈｍａｒＤ．ＶＰ５ｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｂｕｒｓａｌｄｉｓ—

ｅａｓｅ

ｖｉｒｕｓｉｓ

ｎｏｔ

ｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｖｉｒａｌｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ

ｉｎｃｅｌｌ

ｅｕｈｕｒｅ［Ｊ］．ＪＶｉ—

ｒｏＩ，１９９７，７（７）：５６４７—５６５１．

［１９］ＹａｏＫ，ＧｏｏｄｗｉｎＭＡ，ＶａｋｈａｒｉａＶＮ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｍｕｔａｎｔ

ｉｎ，

ｆｅｅｔｉｏｕｓｂｕｒｓａｌｄｉｓｅａｓｅ

ｖｉｒｕｓ

ｔｈａｔｄｏｅｓ

ｎｏｔｃａｕｓｅ

ｂｕｒｓａｌ

ｌｅｓｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｊ

Ｖｉｒｏｌ，１９９８，７２（４）：２６４７—２６５４．

［２０］ＭａｈａｒｄｉｋａＧＮ，ＢｅｃｈｔＨ．Ｍａｐｐｉｎｇｏｆｃｒｏｓｓ—ｒｅａｃｔｉｏｎａｎｄ

ｓｅｒｏｔｙｐｅ—

ｓｐｅｃｉｆｉｃ

ｅｐｉｔｏｐｅｓ

ｏｎ

ｔｈｅＶＰ３ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ

ｐｒｏｔｅｉｎ

ｏｆｔｈｅｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｂｕｒ—

ｓａｌｄｉｓｅａｓｅ

ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．ＡｒｃｈＶｉｒｏＩ，１９９５，１４０：７６５～７７４．

［２１］ＢｏｏｔＨＪ，ＡｇｎｅｓＨＭ，ＶａｓｔｅｎｈｏｕｗＳＡ，ｅｔａｌ．Ｒｅｓｃｕｅｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ

ｂｕｒｓａｌｄｉｓｅａｓｅ

ｖｉｒｕｓ

ｆｒｏｍｍｏｓａｉｃ

ｆｕｌｌ—ｌｅｎｇｔｈ

ｃｌｏｎｅｓ

ｃｏｍｐｏｓｅｄ

ｏｆ

ｓｅｒｏｔｙｐｅＩ

ａｎｄⅡｃＤＮＡ［Ｊ］．ＡｒｃｈＶｉｒｏｌ，２００１，１４６：１９９１—２００７．

［２２］ＢｏｏｔＨ３，ＡｇｎｅｓＨＭ，ＡｔｊａｎＪＷ，ｅｔａ１．ＥｘｃｈａｎｇｅｏｆｔｈｅＣ－ｔｅｒｍｉｎａｌ

ｐａｒｔｏｆＶＰ３ｆｒｏｍ

ｖｅｒｙ

ｖｉｒｕｌｅｎｔｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｂｕｒｓａｌｄｉｅａｓｅｖｉｒｕｓｒｅｓｕｌｔｓ

ｉｎ

８／１

ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ

ｖｉｒｕｓ

ｗｉｔｈ

ａｕｎｉｑｕｅ

ａｎｔｉｇｅｎｉｃ

ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ［Ｊ］．ＪＶｉｒｏｌ，

２００２．７６：１０３４６—１０３５５．