鸡内金粘多糖提取中除杂脱色的研究

四，．）仓品与簋磅

Ｓｉｃｈｕａｎ

ＦｏｏｄａｎｄＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ

Ｖ０１．４４，Ｎｏ．６

第４４卷（第６期）

鸡内金粘多糖提取中除杂脱色的研究

杜林繁１，赵迎春１，梅军２，初兰娜１

（１．广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁５３０００４；２．郑州统一食品有限公司品保课，河南郑州４５０００２）摘要：探讨鸡内金粘多糖提取过程中脱蛋白、脱盐、脱色方法及多糖组分的初步分级。确定了酶解加三氯乙酸法扣氧化铝法为鸡内金粘多糖脱蛋白和脱色的方法．选截留量１０００的透析膜来脱盐。得到了７５％、５５％／两种乙醇浓度的鸡内金粘多糖的分级沉淀。

关键词：脱蛋白；脱色素；脱盐；粘多搪分级

中国图书分类号：Ｔｓ２０１．２文献标识码：Ａ文章编号：１６７１—６８９２（２００８）０６－－００４８－０００３

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粘多糖（ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）Ｘ称氨基多糖（Ｃ妒

ｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ），有广普抗癌作用，并在抗病毒、抗辐射、促进免疫、抗凝血等方面具有良好活性，同时对维持组织及机体的整体结构、保持细胞外液的稳定等起着重要作用ｏ－４１，目前已得到了广泛的重视和研究。并已应用于医药、化妆品等行业。国内自２０世纪８０年代开始对动物来源的粘多糖进行研究。但主要集中在海洋可食用动物上，其他动物的研究则很少有报道。鸡内金为雉科家禽多种鸡的干燥胃内壁皮层，又称鸡肫皮，即鸡胃内的一层黄色黏膜，为中医常用的一种动物药。刘其凤等对鸡内金蛋白质类成分的研究中，发现鸡内金的碱提物呈现氨基多糖（粘多糖）的阳性反应。而国内外有关鸡内金粘多糖的提取分离尚未见任何报道，鉴于此，本试验针对鸡内金粘多糖提取过程中脱蛋白脱色脱盐方法的选择进行

收稿日期：２００８—１０－２８

探索。并对该多糖进行初步的乙醇分级沉淀。

１

１．１

实验材料和方法实验材料、试剂与仪器

鸡内金：购买于南宁市国人大药房；７２１型分

光光度计（上海第三分析仪器厂）；牛血清蛋白（南京生光生物技术有限公司）；考马斯亮蓝Ｇ－２５０（华美生物技术有限公司）；木瓜蛋白酶（南宁庞博生

物有限公司１８０万ｕ／ｇ）；层析Ａｌ籼（１００目）、硫酸、

苯酚、葡萄糖、３０％Ｈ：０ｚ、氯仿、正丁醇、无水乙醇均为分析纯。１．２实验方法

１．２．１

测定方法糖含量：采用改良的苯酚一硫酸

法嘲；蛋白质含量：考马斯亮兰Ｇ一２５０比色法［６１。糖浓度和吸光度为坐标所得回归方程为：Ｙ＝０．０６２５ｘ＋０．０４３４，相关系数为Ｒ２＝０．９９９７。蛋白含量与吸光度

作者简介：杜林繁（１９泓）。硕士研究生，主要从事碳水化合物分离纯化。

第４４卷（总第１４７期）杜林繁等：鸡内金粘多糖提取中除杂脱色的研究４９

为坐标所得回归方程为：Ｙ＝０．０１２８Ｘ＋０．６９１，相关系数：Ｒ２＝０．９９８４。

１．２．２多糖提取液脱蛋白方法的选择

１．２．２．１

酶解加三氯乙酸法取一定体积鸡内金粘多

糖碱提取液Ａ，用木瓜蛋白酶在其适宜条件下对提取液Ａ进行酶解，酶解后用１０％三氯乙酸调滤液ｐＨ３左右离心去除变性蛋白质得滤液Ｔ－，重复上述方法两次。分别得滤液Ｔ２、Ｔ３，浓缩滤液至原体积，测滤液Ｔｌ、Ｔ２、Ｔ３的多糖与蛋白含量。

１．２．３．２酶解加ｓｅｖａｇｅ法取相同体积碱提取液Ａ用上述酶解方法进行酶解。酶解后用按样液：ｓｅｖａｇｅ试剂（氯仿：正丁醇－－－４：１）（ｖ／ｖ）＝５：１｝Ｊ１１）ｋｓｅｖａｇｅ试剂于振荡器里振摇２０ｍｉｎ而后离心去除变性蛋白质，得脱蛋白液Ｓ，。再将Ｓ－用ｓｅｖａｇｅ试剂脱蛋白两次得脱蛋白液Ｓ２、Ｓ，，浓缩滤液至原体积，测脱蛋白液Ｓ１、ｓ２、Ｓ３多糖、蛋白质的含量。

１．２．３粗提液的脱色研究取粗提液Ａ在３６０砌一

６００ｎｍ波长范围内进行扫描，发现溶液在可见光区

无最大吸收峰，而从３６０ｎｍ到６００ｎｍ吸收呈递减趋势。由于该脱蛋白液为橙黄色，从互补色角度考虑，选择蓝光的波长中间段４５０ｎｍ作为检测波长。

１．２．３．１

Ａ１２０，柱层析脱色：用Ａ１２０，粉末填人柱中（柱

底附有砂芯过滤片），加入粗提液１０ｍＬ，用抽虑装置对柱施压，吸出样液。测其吸光度。

１．２．３．２过氧化氢脱色阎：取１０ｍｌ脱蛋白液调ｐＨ８左右，加入过氧化氢使之终浓度为５％，于６０℃保温脱

色１２ｈ，加热驱除Ｈ如，以高锰酸钾溶液作为脱尽之

检测试剂，浓缩至原体积后测定吸光度。

１．２．４脱盐方法的探索由于氯化钠在乙醇水溶液中溶解度很低，多糖浓缩液醇沉时，氯化钠也易沉淀析出，使产品的纯度偏低。

１．２．４．１

透析脱盐取３份１０ｍｌ脱蛋白液Ｔ２分别装进

截留分子量分别为５００、１０００、８０００中，自来水透析４８

ｈＡ，蒸馏水透析２４ｈ。然后浓缩至原体积得‰、

Ｔ，咖、７ｒ姗的脱盐液，测Ｔ２、Ｔ如、Ｔ，咖、Ｔ咖的Ｃｌ一含量与多

糖含量。

１．２．５乙醇分级沉淀［９１取用乙醇溶胀的１９层析硅胶加入有编号的２０个５０ｍｌ锥形瓶中，加ｌｍｌ多糖提取液搅匀，并依次加入５ｍｌ９５％，９０％，８５％，．．…１０％，５％，０％的乙醇，摇荡１５ｒａｉｎ过滤，将滤液经苯酚一硫酸法显色测其于４９０ｎｍ处吸光值。

由图２可基本判断，鸡内金粘多糖可能分为２种，其临界浓度分别为５５％、７５％。为使结果准确选择

＇伟蚺ｌ纬ｎ佻椭嗍聃蛐■蚋●，一●Ｏ■，确，“笛■辨ＩＭＬ

Ｉ假播０１，

圈２不同浓度乙醇洗脱液的吸光值

８５％、７５％、５５％、３５％的乙醇浓度进行分级沉淀探索。２结果与讨论

除杂率（％）＝（除杂前杂质含量一除杂后杂质含量）ｘ１００％／除杂前杂质含量；

多糖损失率（％）＝（除杂前多糖含量一除杂后多糖含量）ｘ１００％／除杂前多糖含量

２．１脱蛋白液中多糖和蛋白质含量的测定：结果如籼。

在动物多糖提取过程中，用蛋白酶酶解可以破坏糖链和蛋白问的糖肽链，由此可以脱除与糖连结合的蛋白质，且释放出糖链，采用酶解ＪＪｌｌｓｅｖｇｅ法、三氯乙酸法可以脱除大部分蛋白质，也提高了提取液中多糖含量。由表１和图１可以看出，ｓｅｖａｇｅ法和酶解结合除蛋白效果随着脱除次数的增加，脱除率也增大，不过增长趋势缓慢，由于该法第一次酶解后加入的ｓｅｖａｇｅ试剂其残留会大大影响木瓜蛋白酶的活性，只适宜进行一次酶解，且释放的多糖量在随后的两次ｓｅｖａｇｅ试剂处理后而被损失掉，其多糖增长率随着ｓｅｖａｇｅ试剂处理次数而逐渐降低，酶法结合三氯乙酸除蛋白效果比酶法结合ｓｅｖａｇｅ法明显要好，而且该法可以进行两次酶解，其释放的糖链也较多，该法重复两次的脱蛋白率已可达到９５．１％。多糖增长率达１５．３２％，重复三次的时候多糖释放量已不明显，反而前两次释放的多糖量被损失，而且脱蛋白率没有显著提高。所以确定用酶解结合三氯乙酸法重复两次

来脱除提取液中蛋白质。

表１提取液脱蛋白结果

１２０．００％

ｌ∞．００％∞Ｄｏ％

∞∞Ｏ％

４０．鲫６

２０．００％０ＪＯＯ％

四，．）食品白发磅

２００８年第６期

２．２脱色效果的研究

鸡内金多糖提取液呈红褐色，本文分别采用吸附法和氧化法对粘多糖进行脱色效果的对比研究。结果见表２。从表２可以看出氧化铝吸附脱色效果好于双氧水氧化脱色，而且多糖损失率也比较小，双氧水对多糖有氧化作用，而且还要加热驱除双氧水，这样很容易促进多糖的分解，而且氧化铝柱层析脱色操作简便。

表２粗提液脱色结果

２．３脱盐效果的研究

经透析脱盐使之盐含量约为５％左右，便于乙醇沉淀。从表３可以看出透析膜的孔径越大，透析除盐的效果也越好，但一些小分子多糖或线性构性的多糖可以透过膜孔而损失掉，截留分子量为１０００的透析膜除盐可达到本实验脱盐目的且多糖损失也较少。

表３脱蛋白液脱盐结果

２．４

乙醇分级沉淀

取ｌＯＯｍｌ粗提液经透析脱盐使之盐含量约为５％

左右，便于乙醇沉淀。加入无水乙醇使之终浓度为３５％放于４℃冰箱过夜，次日没有沉淀，继续加入无水乙醇使之终浓度为５５％同样条件，次日生成沉淀Ｉ，上清继续加入无水乙醇使之终浓度为７５％，次日收集沉淀Ⅱ。上清继续加入无水乙醇使之终浓度为８５％，次日没有沉淀生成。这与上述实验结果相符。将沉淀Ｉ、Ⅱ溶于超纯水。于高效凝胶渗透色谱进行图谱扫描。从图３和图４可以看出，沉淀Ｉ的图谱有一大的主峰及一小峰，成分较均一，沉淀Ⅱ的图谱只有一个峰，组分均一。

３结论

蛋白质、色素和小分子盐离子的去除是多糖提纯的必经之路。传统的脱蛋白法有三氯乙酸法、ｓｅｖａｇｅ法、酶解法，由于鸡内金里蛋白质含量高，且与多糖相

结合，本实验偶合酶解、三氯乙酸法、８ｅｖａｇｅ法来除蛋

白效果很好，两次酶解加三氯乙酸法脱蛋白率达９３％；脱色的方法主要有活性炭吸附，双氧水氧化法。氧化铝柱层析法等，活性炭吸附法对该多糖提取液色素作用很不明显，在此比较了后两者，氧化铝柱层析法脱色率可达８１．５７％，且操作简便，多糖损失也少；在乙醇沉淀过程中需要盐离子的存在，但量过多会随多糖沉淀而沉淀。透析法脱盐简便且效果好。比较了截留分子量５００、１０００、８０００的透析膜的脱盐效果，其中截留量１０００的透析膜可达到本实验的脱盐目的。经５５％、７５％的乙醇浓度对多糖分级沉淀，获得两份沉淀。经高效凝胶渗透色谱扫描，其中７５％的乙醇浓度分级沉淀的图谱只有一个峰，说明成分均一。

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图３：５５％乙醇浓度图４：７５％乙醇浓度沉淀Ｉ的图谱

沉淀¨的图谱

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