鲜整胚及分割双半胚移植试验研究

第32卷第1期年月

文章编号:1001-9111(2006D01-0021-03

中国牛业科学VO1.32NO.1

鲜整胚及分割双半胚移植试验研究

魏建生1~张仕斌1~董载勇1~张明忠2~宋汝谋3

(1.贵州大学动物科技学院~贵州贵阳

550025;2.贵州省农业厅~贵州贵阳

561000D

550004;

3.贵州安顺畜牧局~贵州安顺

摘

要:本试验结合我省胚胎移植的现状~用7头纯种西门塔尔牛作供体~46头杂交牛作受体~进行同期发情和超数排卵~获得鲜整胚59枚~双半胚32枚;用鲜整胚22枚~双半胚24枚进行移植~研究鲜整胚与分割双半胚的移植效果0结果表明:鲜整胚单枚移植妊娠率为27.3%(6/22D~分割双半胚移植妊娠率为54.2%(13/24D~鲜整胚单枚移植妊娠率比分割双半胚移植妊娠率低26.9个百分点~经t检验差异显著(P<0.05D0关键词:鲜整胚;分割双半胚;胚胎移植

中图分类号:S823.3

文献标识码:A

胚胎移植是继家畜人工受精~同期发情之后本世纪最重要的家畜繁殖新技术0但牛目前通过超排和非手术采卵技术获得的可用胚相对较少~一般每头获得的可用胚平均约为5枚左右0我国20世纪80年代末期家畜胚胎分割研究进展很快~1989年潭丽玲等分割奶牛半胚移植成功~同年郭志勤等获得奶牛冻胚和鲜胚分割移植后代~本试验结合我省开展胚胎移植生产需要~通过对移植西门塔尔牛分割鲜双半胚和整胚妊娠率进行对比试验~为胚胎移植技术推广提供参考依据0

尔牛~受体选自贵州本地~健康无病~体况良好~无繁殖障碍和无生殖道疾病~发情周期正常~经产或育成母黄牛0对供~受体牛群进行补饲~加强饲养管理~促使其体况呈中等水平01.4

同期发情与超数排卵

同期发情

供~受体牛同时于阴道内埋

1.4.1

CIDR栓13d~并于埋栓当天注射VA-D-E10mL/头~撤栓后2~3d内观察发情0

1.4.2超数排卵埋栓后第8d下午开始给供体肌注FSH2.8mL~连续5d早晚定时~逐量递减注射~并于第一次同时注射VA-D-E10mL/头01.5

发情观察和记录

对同期发情处理及超排后的供体牛进行发情观察~作好记录并配种输精01.6

黄体分级和检查

在撤栓后第9d直肠检查受体牛黄体发育情况~并对黄体进行分级0通常黄体可分为A~B~C三级~A级:直径约2.5cm~有弹性~突起明显;B级:直径约2cm~黄体突起较小~稍有波动感;C级:直径1.5cm以下~黄体突起不明显~弹性差01.7

冲胚~分割与移植

供体配种后第7d采用非手术法冲胚~实验室检胚后进行胚胎分级~对部分致密桑椹胚和囊胚进行分割后移植~同时对部分鲜整胚进行移植~以作对照0

1

1.1

材料与方法

时间与地点

试验从2004年7月18日开始在贵州省种公牛站进行01.2

药品试剂及仪器

CIDR孕酮阴道栓为新西兰生产;FOLLTROPIN-V加拿大生产;氯前列烯醇(PGD:上海计划生育科学研究所生产~批号0304280.2mg/2mL/支;hCG:宁波第二激素厂生产~批号030228;兽用维生素A~维生素D和维生素E的混合剂(VA-D-ED中国农业科学院畜牧所生产;OLYMPUSCK40型倒置显微镜及胚胎分割仪(日产D01.3

供~受体牛选择与处理

供体牛选自贵州省种公牛站的7头纯种西门塔

\

收稿日期:2005-06-30

基金项目:国家科技部攻关课题2002BA901A18和黔科合农社字20011143资助0

作者简介:魏建生(1981-D男~贵州石阡人~在读硕士研究生~主要从事家畜繁殖研究0

221.8

妊娠诊断

中国牛业科学

2.1

同期发情和超数排卵

第32卷

受体移植后60~75d进行直检 判断受体牛妊娠情况 并记录双半胚和整胚移植妊娠率 2.1.1同期发情结果期发情率100

处理牛65头 发情65头 同

2

结果与分析

表1

牛号90J030260506046937J2J共计

胚胎质量

4M12M1A5M23M2A4EB14EB1A2EB2

1M11M1A1M23M2A1M2A2EB11EB1A

2M11M21EB13EB1A1EB21EB2A

1M1A1M21M2A2EB21M14M1A2M22M2A2EB2

胚胎总数枚 2411411241690

2.1.2超数排卵~冲胚结果试验通过对供体牛进

行超排 得到了较为显著的超排效果 详见表1

超排结果

退化胚数枚

未受精数枚

数 枚24

5

64

261

134

951159

可用胚

比率 100.0054.55100.0081.8220.8368.7565.56

数 枚141361732

可切胚

比率 58.339.0975.0054.554.1643.7533.68

注:字母前数字:胚胎数;M:桑椹胚;EB:囊胚;字母下数字:胚胎等级

除1头供体母牛因子宫颈畸形未能进行冲胚

外 其余6头共冲出胚胎90枚 平均每头15枚;经鉴定可用胚为59枚 其中可分割胚32枚 可用胚比例为33.68 超排效果显著 2.2

胚胎分割结果和胚胎移植结果

试验将32枚可切胚中胚胎质量较好的24枚进行分割 将不可切胚胎中22枚进行整胚移植 鲜双半胚和鲜整胚移植妊娠结果详见表2

表2

类型鲜双半胚鲜整胚

移植受体 头

2422

8细胞以前 每个卵裂球都有相同的发育能力 晚期

桑椹胚分割后分离的卵裂球仍具有调整发育的能力 而重新致密化使卵裂球重新分布而发育至囊胚 自然情况下的同卵双胎的发生机理表明 从早期分裂至原肠胚发育期间的胚胎都能复制[2] Voelkel等和Warfield等的研究表明 分割牛晚期桑椹胚和囊胚 装与不装透明带对半胚的体内存活率并无明显影响 Catica等简化了操作方法分割后立即移植 进一步促进了胚胎分割技术的推广应用

Leibo等和Lambeth等报道移植整胚和分割半胚妊娠率差异不显著 在生产实践中尽管同期发情和超数排卵均在人为控制下进行 但由于生物个体间存在差异 采集的胚胎发育阶段~可用胚数和可切胚数并非一致 加上人为技术高低差异 半胚和整胚移植妊娠也受一定影响 据研究 受体牛妊娠率随半胚移植数目增加 移植双胚较单一整胚妊娠率高 效果好

妊娠早期胚胎的滋养层细胞分泌抗黄体溶解蛋白是胚胎在子宫内存活的重要机制 文献报道 双半胚移植数量比整胚增加了一倍 其总妊娠率超过整胚 本试验结果表明 采用两枚半胚移植 妊娠率比整胚高26.9个百分点 除其他原因外 可能与移植了双半胚具有较多的滋养层细胞 有利于胚胎着床~存活相关 胚胎分割后立即移植不仅可增加可用胚胎数量 而且可有效地降低成本 对提高移植妊娠率效果明显~实用有效~具有广泛的应用价值

胚胎移植结果

妊娠 头136

妊娠率 54.227.3

P<0.05差异性

由表2可见:鲜胚单枚移植妊娠率比双半胚移

植妊娠率低26.9个百分点 差异显著<P<0.05D 说明鲜双半胚移植效果比鲜整胚单枚移植效果好

3

讨论与结论

20世纪30年代Tarkowski等的试验证明哺乳动物2细胞胚的每一个卵裂球都可以发育成正常胎儿 Williams将分割的28枚半胚移植给14头受体 妊娠率为64.28 <9 14D 双胚率为42.85 <6 14D 大多数哺乳动物的早期胚胎均具有调节发育的功能 去掉早期胚胎的一半 仍可以发育成一个完

[1]

整的胎儿 调节能力随发育进程逐渐减弱甚至消失

第1期参考文献:

[1][2]

魏建生等:鲜整胚及分割双半胚移植试验研究

23

郭志勤~张继慈~张沅 等.家畜胚胎工程[M].北京:中国科学技术出版社 1998:165-177.岳文斌~杨国义~任有蛇 等.动物繁殖新技术[M].北京:中国农业出版社 2003.263-272.

ExperimentalStudyonEmbryoTransferwithFreshWholeand

SeparatedDoubleHalfEmbryos

11123

WEIJian-sheng Z~ANGShi-bin DONGZai-yong Z~ANGMing-zhong SONGRu-mou

(1.COllegeOfanzmalSczenceandTec nOlOgyG/zZ O/UnzUe7Szzy G/zyang G/zZ O/550025 C zna;

2.Depa7zmenzOfag7zc/lz/7eOfG/zZ O/p7OUznce G/zyang G/zZ O/550004 C zna;3.B/7ea/OfanzmalH/Sband7yOfanS /ncO/nzy anS /n G/zZ O/561000 C zna>

Abstract:BasedonthecurrentsituationofembryotransferinGuizhouproVince 7donorcoWsofpurebredSimmentalcattleand46recipientcoWsofcrossbredsWereusedforsynchronizedestrousandsuperoVulationtoobtain59freshWholeembryosand32doublehalfembryos.EffectsofembryotransferWith22Wholeembryosand24doublehalfembryosWereanalyzed.TheresultsshoWedthattheconceptionrateofsinglefreshWholeembryoWas27.3%(6/22> doublehalfembryoWas54.2%(13/24>WhichWas26.9percentpointhigherthansingleWholeembryotransferWiththesignificantdifference(P<0.05>.

Keywords:FreshWholeembryo;Embryocutting;Embryotransfer

(上接第20页>

[4][5][6]

吕文发 张英霞 欧阳红生 等.猪肌生成抑制素C末端80氨基酸基因合成及原核表达[J].中国兽医学报 2003 23(3>:130-132.

WehlingM CaiB TidballJG.Modulationofmyostatinexpressionduringmodifiedmuscleuse[J].FasebJ 2000 14:103-110.

LeeSJ McPherronAC.Myostatinandthecontrolofskeletalmusclemass[J].CurrOpinGenetDeV 1999 9:604-607.

CloningandAnalysisofCodingSeguenceofMyostatinGene

inSimmentalCattle

L Wen-fa Z~AOJing Y ANGTian-xiang

(COllegeOfanzma1SczenceandTec nOlOgy Jzlznag7zc/lz/7alUnzUe7Szzy C angc /n Jzlzn130008 C zna>

Abstrct:TheprimeraddedBam~IandEcORIrecognitionsiteseguenceWeredesignedaccordingtothecattlemyostatingeneseguenceintheGenbank.1125bpfragmentofmyostatingenematurationregionWasamplifiedbyRT-PCRfrommusculartissueofSimmentalcattle andligatedWithVectorpMD18-TandtransfectingJM109competentcell.TheseguenceofidentifiedpositiVeclonebyPCRanddigestedWithrestrictionenzymeWasanalyzed thesameseguencebetWeencloneanddesignedseguenceindicatedthatthemyostatingeneofSimmentalcattleWasclonedsuccessfully.

Keywords:Simmental;Myostatin;Clone