大鼠脂肪间充质干细胞培养-杭州赫贝

上传者：陆忠
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上传时间：2015-04-24
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大鼠脂肪间充质干细胞培养-杭州赫贝

大鼠脂肪间充质干细胞培养-杭州赫贝

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大鼠脂肪间充质干细胞原代培养及

R基因瞬转实验

赫贝公司总部地址: 杭州市文一西路1378号杭州师范大学科技园F楼7层电话：0571-28313118

大鼠脂肪间充质干细胞培养-杭州赫贝

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1材料与方法

1.1材料

DMEM-H培养基：GIBCO公司。

胎牛血清FBS：GIBCO公司。

I型胶原酶：SIGMA公司。

Opti-MEM培养基：GIBCO公司。

Lipofectamine2000TransfectionReagent：GIBCO公司。胰

酶：GIBCO公司。

100×青-链霉素(100×P.S.)：GIBCO公司。

RunX2：分子室提供。其余试剂均为国产

分析纯。

1.2仪器

二氧化碳培养箱：3111型，Thermo公司。

倒置显微镜：DMIL型，Leica公司。

台式低速离心机：80-2型，上海医疗器械（集团）有限公司。

细胞培养瓶：Corning公司。

细胞培养板：Corning公司。

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微量加样器：Thermo公司。

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纯水仪：Millipore公司

1.3方法

1.3．1原代培养

无菌条件下剪取SD大鼠双侧腹股沟脂肪垫，冷PBS漂洗三遍，剪碎，加入适量 0.075%I 型胶原酶，在37℃条件下震荡消化约50min。100目筛网过滤消化悬液，用等量含有10%FBS的DMEM培养基终止消化，1500rpm，10min。弃上清，收集细胞沉淀，以10%FBS的DMEM培养基调整细胞浓度为105/ml,接种于T25培养瓶中。37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。每3d换液一次。至贴壁细胞长满瓶底后，0.25%胰酶消化传代， 1:2接种于T25培养瓶中，记录传代次数并拍照。

1.3.2瞬转

取P3至P4代对数生长期大鼠脂肪间充质干细胞，0.25%胰酶消化，离心收集沉淀，以Opti-MEM培养基轻轻吹打混匀细胞，细胞计数，以2*105/孔的细胞量接种于6孔板，待细胞贴壁。依照Lipofectamine2000转染说明书，对R质粒进行转染操作，设两个空白对照孔。转染后6h换正常DMEM培养基，孵育48h。细胞送交分子室QPCR验证。

另取P3至P4代对数生长期大鼠脂肪间充质干细胞，接种于T25培养瓶中，重复上述转染操作。细胞送交分子室WB验证及相关蛋白检测。

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2实验结果

2.1细胞图片

2.1.1P1代细胞图片

2.1.2P3代细胞图片

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