动物细胞融合--山东大学

细胞生物学实验

2015 年 3 月 2 日

姓名 系年级 13级生科 组别 同组者 科目 细胞生物学实验 题目 动物细胞融合 学号

动物细胞融合

【实验目的】

1. 了解动物细胞融合的常用方法。

2. 学习化学融合和电融合的基本操作过程。

3. 观察动物细胞融合过程中细胞的行为和变化。

【实验原理】

细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括病毒诱导融合、化学诱导融合和电激诱导融合。

1. 病毒诱导融合

仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融合。这类病毒的被膜中含有融合蛋白，可介导病毒同宿主细胞融合，同时也可介导细胞与细胞的融合。用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。

2. 化学诱导融合

很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。在恢复过程中相接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。PEG是被广泛使用的化学融合剂。

3. 电激诱导融合

包括电诱导、激光诱导等。其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。

【实验材料和用品】

1. 材料

鸡血红细胞

2. 试剂

50%PEG溶液、Alsever’s细胞保存液、GKN溶液、0.85%氯化钠溶液。

3. 器材

光学显微镜、离心机、载玻片、盖玻片、离心管、滴管等。

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细胞生物学实验

2015 年 3 月 2 日

姓名 系年级 13级生科 组别 同组者 科目 细胞生物学实验 题目 动物细胞融合 学号

【实验步骤】

本实验采用PEG促细胞融合法，实验步骤如下：

1. 取鸡血2ml+2ml Alsever液，再加入6ml Alsever液，混匀后制悬液。（可在4℃保存，老师已准备好）

2. 取步骤1中悬液1ml+4ml 0.85%的NaCl溶液，在1200r/min的离心机内离心5分钟（去上清液，再加入5ml的0.85%NaCl液）；1000~1200r/min离心5min（去上清液，再加入5ml的0.85%NaCl液）；1000~1200r/min离心7分钟。

3. 将上步最后一次的沉降血球（去上清液后，约0.1～0.2ml），加入GKN液至1～2ml，使之成10%的细胞悬液。

4. 取上述10%的血球悬液1ml，加入3ml GKN液，促每毫升含血球15000000个，即1.5107 个/ml。

5. 取步骤4悬液1ml+0.5ml 50%的PEG液，或取步骤4悬液0.5ml+0.5ml 50%的PEG液，或取步骤4悬液0.5ml+1.0ml 50%的PEG液，混匀，在常温下2～3min后，再摇匀滴片，在镜下观察。

【实验结果】

在显微镜下可以观察到PEG液相对于细胞悬液的比例越高，融合率越高。但如果

PEG液相对于细胞悬液的比例过高，多细胞融合的现象会更明显，能观察细胞融合分布过程的机会则会减小，并且细胞悬液与PEG液接触时间过长会导致细胞成团，对观察产生影响。

（1）悬液1ml+0.5ml PEG在显微镜下融合的细胞

（2）悬液0.5ml+0.5ml PEG在显微镜下融合的细胞

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（3）悬液0.5ml+1ml PEG在显微镜下融合的细胞

【讨论与结论】

1、 实验结果分析

（1）鸡血红细胞因其存在细胞核且体积较大，用于本实验操作，易于观察。

（2）在操作中加入GKN溶液是为了使鸡血红细胞获得一些营养，最后加入GKN溶液是为了使反应停止。

（3）试验中三次离心是为了清洗细胞表面，增大细胞接触面积，有利于细胞间的融合。因此，每一步离心前都要将样品小心混匀，反之，视野下有可能出现聚集成团的细胞。

（4）视野里所出现聚成团的细胞，同时也可能是由于制备的鸡血红细胞悬液的浓度过高，或未使细胞悬浊液到达应有的浓度。此外，悬液与PEG混匀时间不能太长否则也容易成团影响观察。

（5）在实验观察过程中，有时可以看到两个或个细胞很像融合在一起，这时许多并不是细胞融合而是从叠在一起，因为转动细准焦螺旋可以观察到细胞接触的部分有量的细胞膜。因此，通过调节细准焦螺旋观察两个重叠细胞之间的细胞膜可以确定两细胞是否融合。

（6）PEG介导细胞融合，其融合效果受以下几种因素的影响：PEG分子量及浓度、pH值、处理时间和温度等。试验中有些细胞质膜已经接触，但未发生融合，可能是由于加入PEG后反应时间较短。这时可以适当延长接触时间。同时，由于生物膜的流动性在一定范围内与温度呈正比，因此可以在不影响细胞生物活性的前提下，可以适当提高处理时的温度，有可能提高融合率。

（7）在加入PEG时，要缓慢沿着管壁加入，同时避免振动。

（8）试验中应该满足以下条件：PEG的分子量应为400-6000之间，PEG溶液浓度为40%-60%，融合时间为1-5分钟。若超过以上三个条件，可能超过了细胞膜的自我修复限度，导致细胞膜破损，无法修复；若低于以上三个条件，可能细胞的破损程度较低，不能进行融合。

（9）化学诱导融合，操作简便，诱导融合的概率比较高，效果比较稳定，适用于动、植物细胞，但对于细胞具有一定的毒性。

2、思考题：细胞融合的理论和实际意义。

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（1）在理论上：细胞融合能把亲缘关系较远，甚至毫无亲缘关系的生物体细胞融合在一起，为远缘杂交架起了桥梁，是改造细胞遗传物质的有力手段，从此打破了仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限，扩大了遗传物质的重组范围。

（2）实际意义：细胞融合不仅可用于基础研究，而且还有重要的应用价值。细胞融合另一个重要应用就是制备单克隆抗体，单克隆抗体可以用作诊断试剂，治疗疾病和运载药物，具有准确，高效，简易，快速等优点。

3、注意事项

（1）制备的鸡血红细胞悬液的浓度不宜过高，否则细胞容易聚集，融合效果受影响。浓度可根据集体细胞情况调节。融合时间为1-5分钟。

（2）用弹指法混合液体时，注意要用拇指的顶部弹，可以尽快使液体混合。

（3）切记:加入PEG时，应该先反应后摇匀，否则会导致细胞融合不充分。

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