高迁移率族蛋白B1作为电离辐射生物剂量计的初探

?６４７?

?辐射效应生物学机制?

高迁移率族蛋白Ｂ１作为电离辐射生物

剂量计的初探

焦呖

朱巍王利利张玉松徐加英樊赛军

【摘要】

目的初步研究高迁移率族蛋白Ｂｌ（ｈｉｇｈ

ｍｏｂｉｌｉｔｙｇｒｏｕｐ

ｂｏｘ?ｌ，ＨＭＧＢＩ）作为电离辐

射生物剂量计的可能性。方法体外培养的正常人成纤维母细胞系ＧＭ接受不同剂量”ＣｏＹ线照射后，于照后２４ｈ收集培养液上清，经ＥＬＩＳＡ法检测其中ＨＭＧＢＩ蛋白含量的变化，并建立剂量－效应曲线。同时采用４

Ｇｙ

１线照射后于２４、４８和７２ｈ检测培养液中ＨＭＧＢＩ的含量变化。结果细胞培

养液上清中ＨＭＧＢＩ蛋白的含量随辐射剂量的增加而增加，照后２４ｈ的剂量－效应曲线符合线性模式，，＝０．５６５５＋０．０３５８ｘ（，＝０．９３３９）。且培养液上清中ＨＭＧＢＩ蛋白含量随照后培养时间的延长而增加。结论ＨＭＧＢＩ是电离辐射反应性蛋白，对其进行深入研究将有助于ＨＭＧＢＩ作为辐射生物剂量计早日应用于辐射损伤的防护与救治。

【关键词】ＨＭＧＢＩ；电离辐射；生物剂量计

Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｓｔｕｄｙ

０１１

ｈｉｇｈｍｏｂｉｌｉｔｙｇｒｏｕｐｂｏｘ１＿ｓ囊ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｄｏｓｉｍｅｔｅｒｏｆＩｏｎｉｚｉｎｇｒａｄｉａｔｉｏｎ

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【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ＨＭＧＢＩ；

Ｉｏｎｉｚｉｎｇｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ；

Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ

ｄｏｓｉｍｅｔｅｒ

目前已建立的多种电离辐射生物剂量计，包括外周血淋巴细胞染色体畸变，早熟凝聚染色体（ＰＣＣ），荧光原位杂交（ＦＩＳＨ），ＣＢ法微核等，在应用过程中各有其局限性¨Ｊ。近年来国内外开展了多种新型生物剂量计，如ＤＮＡ损伤的免疫荧光测定、ＧＡＤＩＭ５（ｇｒｏｗｔｈ

ａｒｒｅｓｔ

究旧…。高迁移率族蛋白ｌ（ｈｉｇｈｍｏｂｉｌｉｔｙｇｒｏｕｐｂｏｘ－

ｌ。ＨＭＧＢＩ）是真核细胞核内的非组蛋白染色体结合蛋白，因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）中迁移速度快而得名＂１。ＨＭＧＢｌ普遍存在于哺乳动物组织细胞中，在胸腺、淋巴组织等组织中呈高表达”１。已知内毒素等炎症因子、化学药物及电离辐射等导致细胞坏死或受损的因素均能引起ＨＭＧＢｌ的主动释放¨…。本实验尝试采用ＥＬＩＳＡ法建立电离辐射引起人成纤维母细胞ＧＭ培养液中ＨＭＧＢＩ蛋白释

ａｎｄＤＮＡｄａｍａｇｅｇｅｎｅ４５）

基因表达测定、线粒体ＤＮＡ基因突变分析等的研

ＤＯＩ：１０．３７６０／ｅｒｏｓ．ｊ．ｉｓｓｎ．０２５４?５０９８．２０１０．０６．００５

基金项目：江苏省高校自然基金（ＳＺｌ２６８２１）

作者单位：２１５１２３苏州大学医学部放射医学与公共卫生学院

肿瘤放射生物学ｔ点实验室

通信作者：樊赛军。Ｅｍａｉｌ：ｓｊｆｓｎ＠ｓｕｄｓ．ｅｄｕ．ｏｎ

放与照射剂量的剂量．效应曲线，初步探讨此法作为

生物剂量计估算受照剂量的可能性。

±堡墼盟壁堂皇堕萱盘查！Ｑ！壁至！！旦蔓！壁鲞整！塑璺！垫！曼！ｉｉ！！丛型！！坚：旦竺！璺！竺！Ｑ！！！！尘：！Ｑ！堕！：！

材料与方法

１．细胞培养：人类成纤维母细胞系ＧＮ购于美国标准生物品收藏中心（ＡＴＣＣ），本实验室保存并常规培养。细胞采用含１０％ＦＢＳ，１００Ｕ／ｍｌ青霉素和１００斗ｇ／ｍｌ链霉素的ＲＰＭＩ１６４０培养液（美国Ｇｉｂｃｏ公司），置于３７℃、５％ＣＯ：恒温恒湿条件下常规培养，每２天换液１次，３～４ｄ传代１次。

２．照射：采用本单位６０Ｃｏ治疗机单次照射，源活度为６．０

Ｘ

１０“Ｂｑ，源皮距８０ｃｍ，照射野１０

１３１１１×

１０

ｃｎｌ，吸收剂量率１００ｅＧｙ／ｒａｉｎ，剂量误差为

±１％。剂量分别为０、０．５、ｌ、２、４和８Ｇｙ，照后相应时间收集培养液上清进行ＥＬＩＳＡ法检测。

３．ＥＬＩＳＡ：实验采用上海西悦生物科技有限公司人ＨＭＧＢｌＥＬＩＳＡ试剂盒进行。各取样品１００斗ｌ加入各孔，充分混匀后于３７℃作用２ｈ。用１×洗涤液充分洗涤４～６次后，每孔加入１００斗ｌ一抗工作液，于３７℃作用１ｈ。洗涤４—６次后，加入酶标二抗１００斗Ｌ／孔，３７℃作用３０ｒａｉｎ后洗涤，方法同前。加入底物工作液１００斗Ｌ／孔，于３７℃避光作用

１０

ｒａｉｎ，立即加入终止液１００些Ｌ／孔，在酶标仪上读

取４５０ｎｎｌ处吸光度（Ａ）值。各样品均做复孔，最后吸光值读数以平均值扣除空白对照组本底值表示。

４．统计学处理：数据以ｉ－ｉ－ｓ表示，采用

ＳＰＳＳ

１０．０统计软件进行ｔ检验，Ｐ＜０．０５为差异有

统计学意义。曲线拟合采用ＳｉｇｍａＰｌｏｔ１０．０软件进行。

结

果

１．不同剂量水平的∞Ｃｏ１线照射后细胞培养液中ＨＩＶＩＧＢＩ蛋白含量的变化：照后２４ｈ直接收集细胞培养液上清，采用ＥＬＩＳＡ法对其中ＨＭＧＢｌ含量进行检测，ＧＩｒｌ细胞培养液中ＨＭＧＢＩ含量随照射剂量的增加而逐渐增加，与未受照射对照组相比，各照射剂量组ＨｌＶｌＧＢｌ含量均显著增加（０．５和ｌ

Ｇｙ

照射组，Ｉ＝６．０９６、９．６８２，Ｐ＜０．０５；２和４Ｇｙ照射组，

Ｉ＝１４．４１９、２９．４７８，Ｐ＜０．０１；８

Ｇｙ照射组，Ｉ＝

３４．２１６，Ｐ＜０．００１，表１，图１）。

照射剂量与ＨＩ－ＩＧＢｌ蛋白ＥＬＩＳＡ测定值拟合剂量一效应曲线方程为ｙ＝０．５６５５＋０．０３５８ｘ（ｒ＝０．９３３９）。其中，ｙ为ＨＩＶＩＧＢｌＥＬＩＳＡ测定Ａ值的绝对值（＾瑚。平均值一本底Ａ值），茹为照射剂量（Ｇｙ）。

表１

不同剂量照射后ＧＭ细胞ＨＩＶＩＧＢｌ蛋白释放量（ｉ±ｓ）

注：与０Ｇｙ组比较。‘‘＝６．０９６、９．６８２。Ｐ＜０．０５；６Ｉ＝１４．４１９、

２９．４７８，Ｐ＜０．０１；。ｔ＝３４．２１６，Ｐ＜０．００ｉ

ｌ

Ｏ

０

０Ｏ

吸收刺ｌ（Ｏｙ）

圈１不同剂量”Ｃｏ．ｒ射线引起ＧＭ细胞中

ＩｔＭＧＢ！释放的剂量．效应曲线

２．ＧＮ经４Ｇｙ印Ｃｏ＾ｙ线照射后不同时间细胞培

养液中ＨＭＧＢｌ蛋白的变化：照射后２４、４８和７２

ｈ，

分别收集培养液上清，经ＥＬＩＳＡ法检测ＨＭＧＢｌ的含量。０Ｇｙ组细胞３个不同时点测得的ＨＭＧＢｌ

Ａ

值无明显差别，而照射组ＨＮＧＢｌ含量在照后２４、４８和７２ｈ与０Ｇｙ组相比，差异有统计学意义（ｔ＝５．７９８、５．７８１、８．３４０，Ｐ＜０．０５），而３个时间点间ＨＮＧＢＩ含量差别则不明显（表２）。

裹２。Ｃｏ＇射线照射后不同时间ＧＭ细胞ＩｔＭＧＢＩ

蛋白释放量（ｉ±１）

吸器量

ｍ

００．４５６８±０．００３２

０．４３７３土０．０１３８

０．４４７８±０．０２０１

２

０．５６６３±０．０２６５‘０．５７９０±０．０３１８‘０．５９１８±Ｏ．０１３８‘

注：‘与０Ｇｙ组比较，Ｉ＝５．７９８、５．７８１、８．３４０，Ｐ‘０．０５

讨论

多年来，辐射生物剂量估算领域开展了大量工作，然而现有的辐射生物剂量计均存在一定的缺陷：外周血淋巴细胞染色体畸变分析耗时久；ＰＣＣ因为细胞融合技术要求较高，不适合基层推广；Ｇ显带法因为分析技术要求高，误差大。工作费时费力，无法分析大量的细胞…。因此需要寻找新型技

术指标来作为现有辐射生物剂量计的必要的补充。

已知ＨＭＧＢＩ在除肝、脑以外的其他组织中均存在于胞核内，因缺乏引导肽，故不能经高尔基体／内质网途径进行分泌¨’。然而细胞在受到内毒紊脂多糖、白介素等的刺激后，可通过非经典途径分泌至胞外；当细胞受到化学药物等作用的影响发生损伤或坏死时，ＨＭＧＢＩ也可被动释放至细胞外¨引。作为初步研究，本实验采用电离辐射所致损伤相关研究中常用的细胞模型ＧＭ细胞作为对象，首次报道ＧＭ细胞中ＨＭＧＢｌ蛋白依赖于电离辐射剂量的释放，并拟合了剂量一效应曲线。然而，以线性方程拟合曲线时发现４Ｇｙ点偏离较大，因此，在今后的研究中需要增加剂量点或采用其他公式分别拟合，来寻找更加符合的剂量－效应曲线。此外，本研究发现细胞受照后２４ｈ即可检出上述改变，且辐射诱导的ＨＭＧＢＩ释放的增加至少持续７２ｈ仍可被检出。

本实验采用ＥＬＩＳＡ法进行ＨＭＧＢＩ蛋白的检测，此法采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，通过酶与底物产生颜色反应，从而经酶标仪进行定量测定，可检测到样品中≤２ｎｇ的ＨＭＧＢｌ蛋白，特异性较强，灵敏度较好。全部操作从收集样品到获得结果，耗时仅为４ｈ左右，方便、快捷。其操作过程按照试剂盒所附说明进行，方法简单易行，不需要额外的仪器与耗材。然而为使ＥＬＩＳＡ法的

变分析法进行比较与分析，并在原先受照人员（有当时生物剂量资料）、新发生的受照病例或肿瘤放射治疗患者中进行验证，从而进一步研究ＨＭＧＢＩ作为新型辐射生物剂量计的可能性与实际应用价值。

参

●

考文献

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Ｏ

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ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ

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ｒＬ

８

ＳｅｈｉｌｄｋｏｐｆＰ．Ｆｒｅｙ

ｉｎ

Ｂ．Ｍａｒｉｔａｌ

ｔＯ

Ｆ．ｎａ１．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ

ｆｏｅｔｅｍ

ｏｆ

检测结果获得较好的重复性和稳定性，必须对各操作环节采取严格的质量控制一１，并对相同实验进行多次重复。

综上，本研究在离体培养的ＧＭ细胞中初步发现ＨＭＧＢＩ具备作为辐射生物剂量计的可能性。此外，该法仍需与作为“金标准”广泛应用的染色体畸

ｒＬ

ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉｔ

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ｒｅｌｅｓｓｅｏｆ００１０ｒｅｃｕｄｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ

Ｂｉｏｐｂｙｓ

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】１周艳萍．酶联免疫吸附试验检测法的质量控捌．检验医学与临床．２００９。１４（６）：１２∞－１２０７．

（收穑日期：２０１０－０７－１３）

?读者?作者?编者?

‘中华放射医学与防护杂志＞对来稿中插图的要求

图位：以排于首次提及的相应正文所在自然段落后为宜。

插图宽度：以占通栏（１５ｃｍ）或双栏（７．５ｎｍ）宽度为宜。图旁一般不申文。病理（组织）切片图应注明染色方法、放大或缩小倍数，病变部位用箭头标出。若需作彩色图，应注明，并另付制作彩色图的制版费。插图位应具自明性。

座标图：纵横座标轴的标目均应平行排在标轴外，纵轴标目以“顶左底右”排。标目由物理ｔ名称、符合和相应单位组成。量与单位间用斜线隔开。座标轴上应标明标值线（刻度线）和标值，否则．应在座标轴尾端画出箭头。

图题：一律排在图下方。图序号使用阿拉伯数字，全文从“Ｉ”开始连续编码．只有Ｉ幅图也应编ｌ。插图必须具有自明性。图中注释或说明语均放于图与图题之间。

（本刊埔辑部）