高通量人乳头瘤病毒分型基因诊断方法的研究

中华检验医学杂志%##$年$月第%0卷第$期)J@BST>PU:9，U>HFJ%##$，(8<%0，38O$ "62

论著

高通量人乳头瘤病毒分型基因诊断方法

的研究

张菊

高艳娥

闫小君

尹国武

白玉杰

李丁

【摘要】目的建立一种可靠、简便经济、快速、高通量的人乳头瘤病毒（&’(）分型检测新方法，

以各型&’(通用引物行聚合酶链反应（’)*）扩增"%!例患者的尖锐湿疣组

并推向临床应用。方法

织和宫颈刮片，将荧光偏振检测技术与模板指导的末端延伸反应（+,-./’）结合，应用探针杂交延伸反应对临床样本扩增产物进行&’(分型：并以,34序列测定结果&’(0，""，"0，"1，$"，$$，$2，21检测，为参照。结果

在!1例患者的尖锐湿疣组织块中&’(检出率"##5，其中两型混合感染"6例，占

三型混合感染2例，占!5，三型以上混合感染"例。67例患者的宫颈刮片&’(检出率为!!5，"15，

其中两型混合感染0例，占感染者的"!5，三型混合感染$例，占感染者的15，三型以上混合感染"例。但,34序列测定方法仅能检出单独一型感染，未检出多重混合感染，两法对单一型检出符合率"##5。结论

本研究初步建立了通用、特异、便捷，无需标记探针，可自动化高通量用于临床的人乳

头瘤病毒分型基因诊断方法。

【关键词】乳头状瘤病毒，人；基因组；模板；荧光偏振

!"#"$%&’"()%*+,-.,),/%0.,%0)."("1-+.(%2-2+22+3*%/."(%)3&-(.,0’+(&+&-$$%’+#-/02!"#$%

&’!，%#()*+,-，)#$./*0,1’+，)2$%’0,3’，4#2)’,1/-，526/+78!2+9:/:’:-0;7-+-</*7+09/9，=0’>:?@/A/:*>B@-</C*AD+/E->9/:B，./F*+GHIIJK，L?/+*

【452)/+6)】758"6)-#"+89:;:<8=:9>?@A=<:，@B:C=:B?@;:，DE@FG，>FFEH>I:>B9=H>FI@F><A:IJ89K8H

（&’(）,34IJ>I><<8N@BLIJ:A>??9:I:FI@8B8K&’(.,34O9"),%12)8AA8BL:B8IM=@BL8KJEA>B=>=@<<8A>;@HE?

（)4）>B9F:H;@F><?FH>=:?F8B?:H;>I@;:=H@A:H?N:H:E?:9I8>A=<@K@:9"%!?>A=<:?8KF8B9M<8A>I>>FEA@B>IEA

（&’(0，IM=:.?=:F@K@F=H8P:?&’(,34PM’)*，IJ:BIJ:’)*=H89EFIN:H:@9:BI@K@:9>B9L:B8IM=:9PM+,-./’：

""，"0，"1，$"，$$，$2，21）JMPH@9@Q>I@8B>B9?=:F@><K<E8H8L:B@F<>P:<993+’@BF8H=8H>I@8BO4K<E8H8L:B@F993+’N>?9@H:FI<M>99:9I8IJ:=H8P:EB9:H9@H:FI@8B8KI:A=<>I:：IJ:?=:F@K@F’)*=H89EFI?O+J:H:?E<I?N:H:A:>?EH:9PM>K<E8H8A:IH@F.=8<>H@Q>I@8BA@FH8=<>I:H:>9:H>B9F8A=>H:9N@IJIJ:H:?E<I?8K,34?:DE:BF:O:"20$)2)8A=>H@BLN@IJIJ:H:?E<I?8K,34?:DE:BF:，IJ:H:?E<I?A:>?EH:9PMK<E8H8A:IH@F.=8<>H@Q>I@8BA@FH8=<>I:H:>9:HN:H:><<F8HH:FIO+J:=8?@I@;:H>I:8K&’(N>?"##5@B)4>B9!!5@BF:H;@F><?FH>=:?H:?=:FI@;:<MO+J:=H8=8?:9A:IJ89F>B9:I:FIA8H:IJ>B8B:IM=:@BK:FI@8B，PEI,34?:DE:BF@BLA:IJ89F>BB8IO+J:H:N:H:"6&’(98EP<:@BK:FI@8B，2&’(IH@=<:@BK:FI@8B>B9"A8H:IJ>B&’(IH@=<:@BK:FI@8B@B)4，0&’(98EP<:@BK:FI@8B，$&’(IH@=<:@BK:FI@8B>B9"A8H:IJ>B&’(IH@=<:@BK:FI@8B@BF:H;@F><F>BF:H?FH>=:?H:?=:FI@;:<MO;%(6$02-%(2+J:=H8=8?:9A:IJ89><<8N:9>J@LJIJH8ELJ8EI，?=:F@><，?@A=<:，H>=@9，>EI8A>I@?A>B9:F8B8A@F><9:I:FI@8B8K&’(.,34L:B8IM=@BLN@IJ8EI>BME?:8K<>P:<@BL=H@A:H?8H=H8P:?O-I@?:C=:FI:9I8P:>B:CIH:A:<ME?:KE<I88<@BF<@B@F><JEA>B=>=@<<8A>;@HE?L:B:9@>LB8?@?O

【<"3=%/12】’>=@<<8A>;@HE?，JEA>B；R:B8A:；+:A=<>I:?；/<E8H8:?F:BF:=8<>H@Q>I@8B

人乳头瘤病毒（&’(）是一种在人群中极易传播扩散的病毒，该病毒感染可通过性接触传播或其他直接、间接接触交叉传染，其感染部位隐蔽，不易早期发现与多种皮肤粘膜的增生、息肉、癌前性及癌性

病变发生发展相关，其传播途径、致病部位、病理表现，均不限于性传播疾病病毒。

目前已确定"##&’(是小分子双链,34病毒，

余型。不同型别&’(致病危害性不同，分属高、低危群，&’(0，""，"0，"1，$"，$$，$2，21型与多种泌尿生殖、消化呼吸系统良性及恶性增生极为相关，775以上的女性生殖系统最常见的恶性肿瘤宫颈癌患者存

［"］在&’(感染。本研究中我们报道了一种新的基

作者单位：（张!"##$%第四军医大学全军基因诊断技术研究所菊、闫小君、白玉杰、李丁）；西安交通大学第二医院妇产科（高艳娥）；第四军医大学唐都医院妇产科（尹国武）

于!"#$%&技术的高通量、便捷、经济的’&(分型检测诊断方法对)*+份临床标本的检测结果。

材料与方法

一、材料

),研究对象及标本采集：)*+例研究对象均为全军基因诊断技术研究所性传播疾病门诊、唐都医院妇科、皮肤科和西安交通大学附属第二医院妇科患者。包括+-例患者经病理细胞学检查确诊的尖’&(K)IP79!!!9!997N!!9N777N7N!97!9N!7N$889!&$:&))1KP

’&(KKIPN!!7!9N777N!77N!79!9!N79!79!7!$889!&$:&))1KP

’&(KIIP7!N!9!9!!!7N!9!9!N!7N!79!97!9!$889!&$:&))1KP

’&(I-IP9!!7!9N7!!9!77N!779N7799!7N77N$889!&$:&))1KP

取上述&N:产物I!虾碱性3与核酸外切酶#、锐湿疣组织块和./例患者的细胞学异常宫颈刮片。采集标本时同时采取*份组织块或刮片，)份做病理细胞学检查，)份重悬于)0123无菌生理盐水中，置于4*15备检。

*,试剂及仪器："67引物及探针由美国赛百盛公司合成，889!&$:&))1;88!!&$!7<:7、虾碱性磷酸酶、荧光偏振检测仪由美国&=>?@AB32=>公司提供。

二、方法

),’&(的提取及扩增：组织块少许或刮片细胞悬液加入)11!3蛋白酶C裂解组织提取液：B"!710)22D3;E，F"F)G，蛋白酶C*11!H;23，IJ5温育K12@A，K+5温育*1L，酚;氯仿法抽提模板"67。取"67模板)!3，

加入各型’&("67通用引物，扩增靶片段"67。扩增条件：86!&)I1!2D3 E4)，引物各*IM2D3 E4)，<HN3**0122D3 E4)，组织"67*0I3。/.5I2@A变性，/.5)2@A，.15*2@A，+*5I2@A，K1个循环，+*5延伸I2@A。不含待检测靶基因的非同源质粒"67为阴性对照。

*,特异序列杂交与模板指导的末端碱基掺入延伸反应分析判读：采用!"#$%&方法对临床标本进行’&(分型检测。’&(型特异性寡核苷酸探针及末端掺入的特异碱基889!&$:&))1;88!!&$!7<:7是基于通用引物扩增片段内的型特异性差异设计的，各型引物及掺入碱基标记如下。

低危群：

’&(JOIPN!NN9777N77N!!NN7N!!7N7N77NN7$88!!&$!7<:7KP

’&())IP!!N!979!N!7!7!N!7N7!NN7N9!N!7$88!!&$!7<:7KP

高危群：

’&()JIP7!N7!!7!N!97!9NN7!7!9!!NN7!797$88!!&$!7<:7KP

’&()-IPN9N!!N!799!9!NN!9!7N7!99!NN9NN$88!!&$!7<:7KP

磷酸酶（F7&）K+5孵育，消化剩余的引物和886!&，-15)I2@A热灭活酶活性。然后以此为模板，以特异探针及荧光标记的889!&$:&))1;88!!&$!7<:7为底物，在"67聚合酶及其缓冲液中于/I5*2@A，/I5)IQ，.I5K1Q*I个循环杂交延伸后，荧光偏振检测仪分别于波长IKIA2、I/IA2检测889!&$:&))1、88!!&$!7<:7掺入。

K,"67序列分析应用M9B<$!$BRQS(=TUD>

FSQU=2!7N3DA@AH试剂盒

（&>D2=HRTD>MD>RU@DA）将临床标本"67&N:扩增片段连接至M9B<$!$BRQS质粒

载体中，用O@H"S=!=>2@ARUD>NST3=F=VW=AT=@AH试剂盒、7O#K++（美国7O公司）测定插入片段的"67序列，在6NO#OE7F!*01中确定所测序列的’&(类型，并与!"#$%&方法检测结果比较。

结

果

),通用引物扩增结果：标本"67经通用引物扩增后，所得产物用*G琼脂糖凝胶电泳检测，显示’&("67扩增片段长度为)I1XM

（图)），与预期相符。+-份尖锐湿疣组织块标本中’&(全部为阳性，阳性率)11G，与病理诊断的符合度)11G，./例宫颈刮片标本中’&(阳性者K-例，阳性率++G

。

)："67分子大小标志，*Y.：尖锐湿疣组织，IY+：宫颈刮片，-：阴性对照

图!

临床标本通用引物扩增结果

*,!"#$%&方法检测结果：通用引物扩增得到的

!

分别与$!%&’，!"#产物消化后，((，(&，()，*(，**，

*+，+)型特异探针及荧光标记碱基混合反应，,-.-#-值增高表明发生了特异的探针杂交反应并发生了预期的特异碱基：//,,!0,-.-#-掺入延伸反应，分别对应$!%&’，((，(&，()型，#!((1值增高，表明发生了特异的探针杂交反应并继之发生了预期的特异碱基：分别对应//2,!0#!((1掺入延伸反应，$!%+)，*(，**，*+型，,-.-#-及#!((1值均未增高，则表明未发生特异的杂交反应及继之的特异碱大、需对临床标本多次扩增及多次分离分析、技术复杂，对操作人员要求高及试剂昂贵，常规应用于临床困难较大。

荧光偏振（<!）检测技术已用于基因组单核苷酸多态性的检测，它检测偏振光强度而非荧光强度，大大地增加了检测的灵敏度。且不需分离游离和结合的示踪物，所有测定在溶液中进行，可达到真正的平衡，因而具有简便、快捷和准确等特点。,8;反应是一种在89-模板引导下的引物末端延伸反应，通基掺入延伸反应，即无感染。3)例尖锐湿疣组织块中，$!%&或((型感染阳性34例，占546，$!%(&或

()感染阳性**例，

占746，两型混合感染(7例，占()6，

三型混合感染+例，占36，三型以上混合感染(例。75例宫颈刮片标本中，$!%89-阴性((例，$!%89-阳性*)例，占336，其中$!%&或((型感染阳性*1例，占感染者的)16，$!%(&、()或+)感染阳性4*例，占感染者的&16，两型混合感染&例，占感染者的(&6，三型混合感染*例，占感染者的)6，三型以上混合感染(例。

*:89-测序结果：与,8;0<!方法检测结果比较，两者对((&份标本)型$!%的单独型检测符合率为(116，但由于考虑到试验成本，每份临床标本!"#产物仅挑取了4个克隆进行测序，故很难覆盖可能的所有基因型，因此测序不适于对多重混合感染的检测，本研究中未检出(例多重混合感染患者。

讨

论

人群中$!%感染为)16以上，$!%感染类型及重叠感染对患者的预后有较大影响。近年，由于$!%感染的增加，

我国每年新增宫颈癌病人(+万人，患者年轻化趋势明显。$!%感染的早期发现对于细胞学检查正常或核异变期癌症的早期诊断、预防及治疗极为重要，早期、定期进行$!%感染的分型筛查，对预警癌变倾向，及时发现和预防、指导治

疗早期癌变有重要价值［4，*］。

$!%的分型检测研究一直受到国内外学者的

高度重视［7］

。目前对$!%感染的分型诊断，主要依赖分子生物学手段对病毒89-组检测：斑点或狭线杂交、!"#0=>;?-、89-测序，

第二代杂交捕获检测应用一套#9-探针与组织$!%杂交，以标记有碱磷酶的杂交复合物抗体检测杂交反应，检测临床常见、极相关的高危型$!%，是目前惟一获得美国<8-许可的商品化诊断试剂［+03］。但因所需临床标本量

过确定特异探针与靶89-的识别杂交及在特定位

置的特异碱基的掺入决定基因型。通过引物扩增、探针杂交及杂交后特异碱基掺入三重把关，确保反

应具较普通杂交更高的特异性、准确性［)］：以保证真

性89-聚合酶行延伸反应，如扩增产物中含有与探针互补序列，则两者之间互相识别而互补杂交，并在模板指导下，存在相应的//9,!时进一步延伸，游离的荧光标记//9,!掺入到探针末端，相应波长的<!值增加；反之，无探针与扩增产物中序列互补杂交，更无延伸反应及<!值增加。本研究利用,8;0<!这一新兴的高通量基因检测技术，仅需一次扩增，即可检测)个最常见的高低、危型$!%，并可监测多重感染，集快速、可靠、敏感、特异及操作简便为一身，从而更适用于大规模临床筛选及在临床广泛推广应用。

参

考

文

献

(@ABCDEFGHH-.，"IJEC,:#GKEGHCLELMJANOAOPKKGJAQPDMBPNCLE

/EQEKGOJENCGHREDQPRAKPNCDAEOPCLEKPAKNEGOKABPBAN/JAKPSNANRI:!GBCSDA/.E/@，4114，3)：44+044):

4TMKABPNSAJ?>，$MSLEB@!，TPQPAC9’，ECAK:=QAKMACPGNGHLMJAN

OAOPKKGJAQPDMBCEBCPNSPNODPJADIBRDEENPNSHGDREDQPRAKAFNGDJAKPCPEB：RGJOADPBGNGHBENBPCPQPCI，BOERPHPRPCI，AN/HDEUMENRIGHDEHEDDAK:@-.-，4114，4))：(3750(3+3:*

董学君，张国荣，王少波，等:性传播人乳头瘤病毒(&型调查及>(区片段的序列分析:中华检验医学杂志，4111，4*：4)4:

7VDPSLC@8，$EDWGS,@:$MJANOAOPKKGJAQPDMB：EJEDSPNSCDEN/BPN/ECERCPGNAN/JANASEJENC:"MDDENCVGJENB$EAKCL#EO，4114，4：4+504&+:

+"ABCKE!=，>GDPNRW-,，.PEKWINBXA0>GLNAB;，ECAK:#EBMKCBGHLMJANOAOPKKGJAQPDMB89-CEBCPNSYPCLCLELIFDP/RAOCMDE4ABBAIADEDEODG/MRPFKE:@"KPN.PRDGFPGK，4114，71：(1))0(151:

&魏军，

张正:人乳头瘤病毒!"#产物酶标0微孔板杂交分型:中华医学检验杂志，(55)，4(：(310(34:

3汪江华，

府伟灵，王颖莹，等:组合靶基因自动检测仪快速检测人乳头瘤病毒:中华检验医学杂志，4111，4*：4&704&&:

)$BM,.，"LENZ，8MAN?，ECAK:[NPQEDBAK?9!SENGCIOPNSABBAIYPCLHKMGDEBRENREOGKADPWACPGN/ECERCPGN:’PGCERLNPUMEB，411(，*(：+&10+&):

（收稿日期：41140((041）

（本文编辑：毛家都）