高迁移率族蛋白B1与活化T细胞核因子2之间存在直接相互作用

?

３６４

?

ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＥｍｅｒｇｅｎｃｙＣａｌｌ．Ｄｅｃ２０１１，Ｖ０１１２．Ｎｏ６

高迁移率族蛋白Ｂ１与活化Ｔ细胞核因子２之间存在直接相互作用＊

刘辉１

姚咏明２

宋青１

丁丽华３王晓辉３

袁斌３

叶棋浓３

盛志勇２

［摘要］目的：探讨高迁移率蛋白１（ｈｉｇｈｍｏｂｉｌｉｔｙ

ｐｒｏｔｅｉｎ

ｂｏｘ１。ＨＭＧＢｌ）与活化Ｔ细胞核因子２（ｎｕｃｌｅａｒ

ｆａｃｔｏｒｏｆａｃｔｉｖａｔｉｎｇＴｃｅｌｌｓ２，ＮＦＡＴ２）之间的直接相互作用。方法：首先观察ＨＭＧＢｌ与ＮＦＡＴ２在细胞外的相

互作用，构建ｐＥＴ２８ａ（＋）一ＨＭＧＢｌ、ｐＧＥＸ—ＫｐＮＦＡＴ２质粒，应用网织红细胞系统进行体外翻译得到带有放射

性硫同位素“ｓ的Ｈｉｓ—ＨＭＧＢｌ融合蛋白。应用蛋白纯化技术得到的ＧＳＴ—ＮＦＡＴ２融合蛋白．利用ＧＳＴ—ｐｕｌｌｄｏｗｎ实验检验二者在体外是否可直接结合；然后观察ＨＭＧＢｌ与ＮＦＡＴ２在细胞内能否直接结合，构建ＨＭＧＢｌ和ＮＦＡＴ２的真核表达质粒，共同转染人胚胎肾２９３Ｔ细胞系，刺激之后裂解细胞，应用相应的抗体进行免疫共沉淀检测，观察二者在细胞内直接结合的情况。结果：利用ＧＳＴ－ｐｕｌｌｄｏｗｎ实验及免疫共沉淀实验证实，ＨＭＧＢｌ全长蛋白与ＮＦＡＴ２全长蛋白在细胞内、外有直接结合的条带，而对照组没有结合条带，说明ＨＭＧＢｌ可与ＮＦＡＴ２特异性结合。结论：ＨＭＧＢｌ与ＮＦＡＴ２之间存在直接相互作用。

［关键词］高迁移率蛋白Ｂ１；活化Ｔ细胞核因子；蛋白纯化；免疫共沉淀［中图分类号］Ｒ３９２

［文献标志码］Ａ［文章编号］

１００９—５９１８（２０１１）０６０３６４—０５

Ｈｉｇｈｍｏｂｉｌｉｔｙｇｒｏｕｐｂｏｘ一１ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｕｌｄｄｉｒｅｃｔｌｙｂｉｎｄｔｏｎｕｃｌｅａｒ

ｆａｃｔｏｒｏｆａｃｔｉｖａｔｅｄＴｃｅｌｌｓ一２

ＬｊＵＨｕｉ

１

ＹＡＯＹｏｎｇｍｉｎｇ

ＹＵＡＮＢｉｎｇ

２

ＳＯＮＧＱｉｎ９１

ＹＥＱｉｎｏｎｇ

３

ＤＩＮＧＬｉｈｕａ

３

Ｗ－ＡＮＧＸｉａｏｈｕｉ

２

３

３

ＳＨＥＮＧＺｈｉｙｏｎｇ

（１ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＳｕｒｇｉｃａｌ

ｎａ；２

ＩＣＵ，ｔｈｅ

ＣｈｉｎｅｓｅＰＬＡＧｅｎｅｒａｌ

Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００８５３，Ｃｈｉ—

ＢｕｒｎｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＦｉｒｓｔＨｏｓｐｉｔａｌＡｆｆｉｌｉａｔｅｄｔｏｔｈｅＣｈｉｎｅｓｅＰＬＡＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ：３ＢｅｉｊｉｎｇＩｎ—

ｓｔｉｔｕｔｅｏｆ

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＭｉｌｉｔａｒｙＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ）

Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ

ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ

Ａｂｓｔｒａｃｔ

ｔｈｅｄｉｒｅｃｔｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＨＭＧＢｌａｎｄＮＦＡＴ２．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｆｉｒｓｔｌｙ，ｔｈｅ

ＮＦＡＴ２ｉｎ

ｖｉｔｒｏｗａｓ

ｄｉｒｅｃｔｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＮＦＡＴ２

ＨＭＧＢｌａｎｄ

ｅｘａｍｉｎｅｄ．ｐＥＴ２８ａ（＋）一ＨＭＧＢｌ

ｆｏｒｉｎ

ｖｉｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ

ａｎｄ

ｐＧＥＸ

Ｋｐ

ｐｌａｓｍｉｄｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．ｐＥＴ２８ａ（＋）一ＨＭＧＢｌ

ｔＯ

ｗａｓｕｓｅｄａｎｄｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｉｎ

ＴＮＴＲｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅＬｙｓａｔｅＳｙｓｔｅｍ

ｉｓｏｌａｔｅｄ

ｇｅｔ“Ｓ—ｌａｂｅｌｅｄＨｉｓ—ＨＭＧＢｌｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ．ＧＳＴ—ＮＦＡＴ２ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｗａｓ

ａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｆｏｒＧＳＴ—ｐｕｌｌｄｏｗｎｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｗｉｔｈＨｉｓ—ＨＭＧＢｌｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｅｃｏｎｄｌｙ，ｔｈｅｉｒｄｉｒｅｃｔｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ

ｉｎｖｉｖｏｗａｓ

ｅｘａｍｉｎｅｄ．ＨＭＧＢｌａｎｄ

ＮＦＡＴ２

ｅｕｋａｆｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏ２９３Ｔｃｅｌｌｓｓｉｍｕｌ—

ｔａｎｅｏｕｓｌｙ．Ａｆｔｅｒ２４ｈ，ｃｅｌｌ１ｙｓａｔｅｗａｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｏｒＣＯ—ｉｍｍｕｎｅｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ（ＣＯ—ＩＰ）ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄｗｉｔｈａｎｔｉ—Ｆｌａｇａｎｔｉｂｏｄｙａｎｄｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙｄｅｔｅｃｔｅｄｔｈａｔ

ｗｉｔｈａｎｔｉ—ＨＭＧＢｌａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄ

ｓｈｏｗｅｄ

ｔｈａｔ

ｔＯ

ＨＭＧＢｌｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｂｏｕｎｄ

ｔＯ

ＧＳＴ—ＮＦＡＴ２

ｉｎ

ｖｉｔｒｏ．Ｃｏ—ＩＰｐｒｏｔｅｉｎ

ＨＭＧＢｌ

ｐｒｏｔｅｉｎ

ｃｏｕｌｄｂｉｎｄ

ｔＯ

ＮＦＡＴ２ｐｒｏｔｅｉｎｄｉｒｅｃｔｌｙｉｎｖｉｔｒｏ

ｖｉｖｏ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＨＭＧＢｌｃｏｕｌｄｄｉｒｅｃｔｌｙｂｉｎｄＮＦＡＴ２ｐｒｏｔｅｉｎｉｎ

ｖｉｖｏａｎｄｉｎ

＋基金项目：国家重点基础研究发展规划项目（Ｎｏ：２０１２ＣＢ５１８１０２）、国家自然科学基金（Ｎｏ：３０８０１１８７，８１０７１５４５）

１解放军总医院外科重症医学科（北京，１００８５３）２解放军总医院第一附属医院烧伤研究所３解放军军事医学科学院生物工程研究所通信作者：姚咏明（Ｅｍａｉｌ：Ｃｆｆ＠ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ）

［１６２

ＴＡＮＧＪ，ＧＵＯＷＣ，ＹｕＩ。，ｅｔａ１．Ｃｌｉｎｉｃａｌｅｆｆｉｃａｃｙｏｆａｒｔｉｆｉｃｉａｌｓｋｉｎｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｖａｃｕｕｍｓｅａｌｉｎｇｄｒａｉｎａｇｅ

ｉｎｔｒｅａｔｉｎｇ

（４）：２‘７５—２８０．

［１９２ＨＡＴＴＯＲＩＹ，ＴＡＫＡＮＯＫ，ＴＥＲＡＭＡＥ

ｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｓｅｐｓｉｓｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｄｅｓｉｇｎｂａｓｅｄ

ｏｐｔｏｔｉｃ

Ｈ，ｅｔａ１．Ｉｎ

ｏｎ

ｌａｒｇｅ－ａｒｅａｓｋｉｎｄｅｆｅｃｔｓ［Ｊ］．ＣｈｉｎＪＴｒａｕｍａ—ｔｈｅａｐ—

ｔｏｌ，２０１０，１３：２８９—２９２．

ｄｅａｔｈｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．ＪＰｈａｒｍａｃｏｌＳｃｉ，２０１０。１１４：

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合皮瓣修复下肢皮肤软组织缺损［Ｊ］．中国修复重建外科杂志，２０１０，２４（６）：７２２～７２５．

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症大鼠炎性反应的影响ＥＪ］．中华烧伤杂志，２００９，２５

３５４—３６５．

Ｅ２０］姚咏明．创伤感染并发症免疫功能障碍及其诊治的若

干问题［Ｊ２．中华外科杂志，２００９，４７（１）：３７—３９．

（收稿日期：２０１１—０８

１５）

临床急诊杂志２０１１年１２月第１２卷第６期

?

３６５

?

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ

ｈｉｇｈｍｏｂｉｌｉｔｙｇｒｏｕｐ

ｂｏｘ—ｌ；ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｏｆａｃｔｉｖａｔｅｄＴｃｅｌｌ；ｐｒｏｔｅｉｎｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＣＯ—ｉｍｍｕｎｅ

ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ

业已明确，高迁移率族蛋白Ｂ１（ｈｉｇｈ

ｍｏｂｉｌｉｔｙ

ｇｒｏｕｐｂｏｘ一１

ｐｒｏｔｅｉｎ，ＨＭＧＢｌ）不仅是一种新的“晚

期”炎症介质由单核／巨噬细胞分泌到细胞外参与炎症反应¨＿２ｊ，还可作为一种免疫调节因子引起淋巴细胞激活并释放白细胞介素（ＩＬ）一２，诱导树突状细胞活化并分泌ＩＬ１２：３＿４ｊ。我们前期实验证实，重组ＨＭＧＢｌ可诱导淋巴细胞凋亡，并影响活化Ｔ

细胞核因子（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ

ｏｆ

ａｃｔｉｖａｔｅｄＴｃｅｌｌｓ，

ＮＦＡＴ）的人核启动基因转录和ＩＩ。一２表达４。既往研究显示，ＮＦＡＴ２是淋巴细胞内调控ＩＬ一２表达的关键转录因子、。，我们进一步实验证实，ＨＭＧＢｌ可通过ＮＦＡＴ２协同促进ＩＬ一２转录表达旷，但是二者之间的直接相互作用尚缺乏研究。本实验中笔者构建ＨＭＧＢｌ和ＮＦＡＴ２的真核表达质粒，观察ＨＭＧＢｌ与ＮＦＡＴ２蛋白在细胞内、外能否直接结合，初步论证ＨＭＧＢｌ与ＮＦＡＴ２之问的相互作

用。

１材料与方法１．１材料

１．１．１质粒与试剂

真核表达载体ｐｃＤＮＡ３、人乳

腺文库、大肠杆菌ＤＨ５ａ菌株及含Ｆｌａｇ标签的ｐｃＤＮＡ３质粒由军事医学科学院八所七室保存；含人全长ＮＦＡＴ２的质粒由华盛顿大学ＦｅｎｇＣｈｅｎ

博士惠赠；荧光素酶检测试剂盒、Ｔ４噬菌体ＤＮＡ

连接酶及微量质粒提取试剂盒（Ｗｉｚａｒｄ

ＰｌｕｓＳＶ

Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ

ＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ）、ＴＮＴ

Ｑｕｉｃｋ

体外翻译试剂盒购自美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司；小鼠抗人ＨＭＧＢｌ抗体购自美国Ｓｉｇｍａ公司；免疫发光检测试剂盒购自美国Ｐｉｅｒｃｅ公司；转染试剂Ｌｉｐｅｆｅｃｔ—ｍｉｎｅ２０００购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；Ｆｌａｇ蛋白结合琼脂糖珠购自美国Ａｍｅｒｓｈａｍ公司；兔抗ＨＭＧＢｌ多克隆抗体美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司；ｐＥＴ２８ａ（＋）载体与ｐＧＥＸ—ＫＧ载体由军科院八所七室保存。

１．１．２基因序列

在Ｍｅｄｌｉｎｅ的ＧｅｎＢａｎｋ数据库

中获取人ＨＭＧＢｌ的基因全长，基因库登录号为ＢＣ０６６８８９，其开放读码框从８０到７２７位。ＮＦＡＴ２的基因全长序列在ＧｅｎＢａｎｋ中基因登录号为Ｕ０８０１５，其开放读码框从２４０到２３９０位≯。１．２方法１．２．１细胞转染

培养人肾胚胎细胞系２９３Ｔ细

胞，细胞用含有１０％的新生牛血清和双抗ＤＭＥＭ培养基培养。在转染前２４ｈ用不含双抗、含１０％新生牛血清的相应培养基将细胞接种在１２孔板中，接种量以转染时细胞密度达到９０％为准。将ＤＮＡ用８０“ｌ不含双抗和血清的培养基稀释，再用

８０肚ｌ相同的培养基稀释２．５肚ｌ

Ｉ．ｉｐｏ—

ｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００，立即将二者混合，搴温放置２０ｍｉｎ

后，加入到含有０．８ｍｌ培养基和１０％新生牛血清

的１２孑Ｌ板中，４ｈ后更换培养基。

１．２．２荧光素酶和口一半乳糖苷酶（１３一ｇａｌ）活性测定基本按Ｐｒｏｍｅｇａ公司提供的试剂盒说明进行。细胞转染２４ｈ后，裂解细胞离心（１２

０００ｒ／ｍｉｎ，１０

ｍｉｎ，４℃），取上清液测定荧光素酶活性。采用邻硝基苯一１３一Ｄ一半乳糖苷测定ｔ？－ｇａｌ活性。取上述上清

液１０牡ｌ加入到４５０ｔ＊ｌ含有Ｂ一巯基乙醇（２．７ｍｌ／Ｉ。）

的缓冲液中，加入１００

Ｆ１

０．４％的邻硝基苯一ｆ３Ｄ半

乳糖苷溶液，３７Ｃ保温，直到出现浅黄色为止，加入

２５０ｔＡ

１

ｍｏｌ／Ｉ。Ｎａ２Ｃ（）３终止反应，在４２０ｎＩｉｌ波长

下测定样品Ａ值。

１．２．３

实验分组及过程检测ＨＭＧＢｌ与

ＮＥＡＴ２蛋白在细胞外的相互作用：构建ｐＥ７Ｆ２８ａ（＋）一ＨＭＧＢｌ、ｐＧＥＸ—ＫＧ—ＮＦＡＴ２质粒，应用网织红细胞系统进行体外翻译，得到带有放射性同位素“ｓ的ＨｉｓＨＭＧＢｌ融合蛋白。应用蛋白纯化技

术得到的ＧＳＴＮＦＡＴ２融合蛋白。以１１肚ｌ

Ｈｉｓ—

ＨＭＧＢｌ体外翻译产物与１３肚１结合有ＧＳＴ—ＮＦＡＴ２融合蛋白的琼脂糖珠进行结合反应，为第１组。并同时设阴性对照组，为第２组，加样情况为

１１

Ｍｌ

Ｈｉｓ—ＨＭＧＢｌ体外翻译产物＋１３肚ｌ结合有

ＧＳＴ蛋白的琼脂糖珠。结合反应完成后跑ＰＡＧＥ胶作放射自显影鉴定。

检测ＨＭＧＢｌ与ＮＦＡＴ２蛋白在细胞内的相互作用：接种４盘６ｃｍ小皿的２９３Ｔ细胞，待细胞密度达到９０％时，转染前１ｈ更换新的培养基，体

积为１．５ｍｌ。具体的分组及质粒用量见表１。

表１具体分组及质粒用量组别

质粒用量

ｐｃＤＮＡ３

Ｆｌａｇ（０．２

①ｐｃＤＮＡ３一Ｆｌａｇ对照未Ｆｇ／ＩＥ）

刺激组

＋ｐｃＤＮＡ３ＨＭＧＢｌ（０．８Ｆｇ／ＩＫ）

②ｐｃＤＮＡ３一Ｆｌａｇ对照刺ｐｃＤＮＡ３一Ｆｌａｇ（０．２ｔｔｇ／ｌＩＩ［）＋

激组

ｐｃＤＮＡ３一ＨＭＧＢｌ（０．８ｆｚｇ／

ｌｉｅ）

ｐｃＤＮＡ３

Ｆｌａｇ—ＮＦＡＴ２（０．２

③共转ｐｃＤＮＡ３ＦｌａｇＮＦＡＴ２未刺激组

，ｕｇ／ｍｌ＿）＋ｐｃＤＮＡ３一ＨＭＧＢｌ（０．８肚ｇ／皿）

ｐｃＤＮＡ３一Ｆｌａｇ—ＮＦＡＴ２（０．２

④共转ｐｃＤＮＡ３一ＦｌａｇＮＦＡＴ２刺激组

“ｇ／皿）＋ｐｃＤＮＡ３一ＨＭＧＢｌ（０．８肛ｇ／皿）

注：转染试剂为Ｉ。ｉｐ。ｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（４Ｆ１／ＩＫ），反应总体

积为１００ＦＩ（不足用无菌生理盐水补足）

?３６６?

转染完毕后４ｈ更换新培养基，２４ｈ后收集细胞进行免疫沉降实验。

１．２．４

ＧＳＴ－ｐｕｌｌ

２３

ｄｏｗｎ实验

以１１“ｌ

Ｈｉｓ－

９７４

Ｉ－ＩＭＧＢｌ体外翻译产物与１３”ｌ结合有ＧＳＴ?ＮＦＡＴ２融合蛋白的琼脂糖珠进行结合反应。并同时设阴性对照组．将Ｈｉｓ－ＨＭＧＢＩ体外翻译产物与结合有ＧＳＴ蛋白的琼脂糖珠进行结合反应，于４℃旋转摇育过夜。反应完成后跑ＰＡＧＥ胶．电泳上样的顺序为Ｈｉｓ－ＨＭＧＢｌ蛋白对照、结合反应阴性对照组和结合反应组。电泳完毕后。将胶抽干水分，

压片。３ｄ后洗片作放射自显影鉴定。

６６２

４３

３

１．２．５免疫共沉淀（ｃｃ—ｌＰ）实验细胞转染后２４ｈ，取出培养皿并收集细胞，行超声破碎留取上清。其中从上清中吸取３０“Ｉ留作电泳加样（ｉｎｐｕｔ），其余约４２０＂ｌ上清用于进行ＩＰ实验。每个样本中加

入１５ｐｌＦｌａｇ珠子进行沉降。沉降完毕后将样品加

ｌ：考染Ｍａｒｋｅｒ｝２：ＧＳＴ—ＮＦＡＴ２融合蛋白；３：ＧＳＴ蛋白箭头ａ：ＧＳＴ＿ＮＦＡＴ２融合蛋白．箭头ｂ：ＧＳＴ蛋白

瞳２

ＧＳＴ－ＮＦＡ＇ｒ２

ｔ台叠白纯化之后的考马斯亮蓝染

色鉴定结果

入上样缓冲液，充分混匀。煮沸后离心ｔ取１０“Ｉ进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ印迹分析。电泳上样的顺序为ｉｎ—ｐｕｔｌ、ｉｎｐｕｔ２、ｉｎｐｕｔ３、ｉｎｐｕｔ４、组１、组２、组３、组４。１．３统计学处理

所有试验数据以ｚ士５表示，采用ｓｔａｔａ４．０统计软件．进行单因素方差分析。Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１表示差异有统计学意义。

２结果

２．Ｉ重组Ｈｉｓ－ＨＭＧＢｌ与ＧＳＴ—ＮＦＡＴ２蛋白的表达鉴定

ＧＳＴ?ＮＦＡＴ２与Ｈｉｓ—ＨＭＧＢｌ融合蛋白的

ＧＳＴ－ｐｕｌｌｄｏｗｎ结果

２．２

已、｛寻到ＧＳＴ—ＮＦＡＴ２纯化蛋白及Ｈｉｓ—ＨＭＧＢｌ的体外翻译产物后，笔者进一步进行了二者的ＧＳＴ－ｐｕｌｌｄｏｗｎ实验。如材料与方法中所示，分为２组．其中一组为阴性对照，用ＧＳＴ纯化蛋白与Ｈｉｓ－ＨＭＧＢｌ作结合反应。结果显示，结合反应

产物中存在放射性蛋白，电泳条带的位置与加入的

Ｈｉｓ－ＨＭＧＢｌ一致。说明Ｈｉｓ－ＨＭＧＢｌ全长与ＧＳＴ－ＮＦＡＴ２全长可在体外直接结合，而与ＧＳＴ蛋白无结合条带．进一步论证了结合反应的特异性

（见图３）。

２

３

ｐＥＴ２８ａ（＋）一ＨＭＧＢｌ重组质粒构建好并鉴定完毕后（资料未显示）。行重组质粒的体外翻译，翻译完毕后将产物０．５“ｌ上样，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，电泳后抽胶压片，放射自显影检测（见图１）；ｐＧＥＸ－ＫＧ?ＮＦＡＴ２重组质粒构建好并鉴定完毕后（资料未显示），进行大量表达。将ｐＧＥＸ－ＫＧ－ＮＦＡＴ２重组质粒转化ＤＨ５ａ大肠杆菌，３７℃振摇培育后裂解细菌进行蛋白纯化，并行Ｗｅｓｔｅｒｎ及考染检测（见图２）。

ｂｌｏｔ

１ｔＨｉｓ－ＨＭＧＢｌ对照；２：阴性对照；３：结合产物中的Ｈｉｓ－

２

ＨＭＧＢｌ蛋白条带

田３

ＧＳＴ－ＮＦＡＴ２与ＨＩｓ－ＨＭＧＢＩ融台蛋白在体外直接结合

＿＿－

２．３

ＨＭＧＢｌ与ＮＦＡＴ２蛋白可在细胞内相互结

合

电泳结果显示（图４），ｉｎｐｕｔｌ一４都有条带，说明各组细胞中都表达ＨＭＧＢｌ蛋白，而且各组细胞中表达水平是一致的。这为共沉淀实验结果提供了较强的可比性。组１、组２没有条带，组３有较弱条带，组４有条带。说明ＨＭＧＢｌ与Ｆｌａｇ标签蛋白

１，２：Ｈｉｓ－ＨＭＧＢｌ融合蛋白

圈１

ｐＥＴ２￥ａ（＋）?ＩＦＩＭＧＢｌｔ组质牲的体外翻译鉴定结果

之间不能结合，不能形成复合物．应用Ｆｌａｇ珠子只

能将Ｆｌａｇ标签蛋白沉淀下来，而不能将ＨＭＧＢｌ

?３６７?

蛋白从细胞裂解液中沉淀下来，所以应用抗ＨＭＧＢｌ抗体进行免疫印迹分析时，是检测不到阳性条带的。而在组３、组４中，细胞表达的是Ｆｌａｇ－ＮＦＡＴ２融合蛋白．ＮＦＡＴ２与ＨＭＧＢｌ可相互结合形成复合物，因此在沉淀下来的蛋白中可以检测到ＨＭＧＢｌ条带。组４的条带更强．说明应用

ＰＭＡ＋ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ刺激可增强ＨＭＣＢｌ与ＮＦＡＴ２

ＨＭＧＢｌ能与ＮＦＡＴ２结合，则会被一同沉淀下来。接着将此蛋白复合体煮沸后进行电泳分析．利用ＨＭＧＢＩ蛋白的放射性进行显影．并设ＧＳＴ蛋白的阴性对照．防止ＨＭＧＢｌ仅与ＧＳＴ结合而不与ＮＦＡＴ２结合，造成假象。如果显影．证实ＨＭＧＢｌ与ＮＦＡＴ２在体外可相互结合。结果显示．ＨＭＧＢＩ全长与ＧＳＴ－ＮＦＡＴ２全长在体外有特异性直接结合的条带。接着进行细胞内结合实验。细胞内的ｃｏｑＰ实验条件为生理状态．结果更加可信。细胞内环境是一个网络调节，受到酸碱、其他蛋白等影响，蛋白的结构与细胞外也会不太一样。

之间的结合。应用Ｆｌａｇ珠子可以沉淀下来更多的ＨＭＧＢｌ蛋白，检测到的条带就更浓。细胞内的环境更接近体内生理状态，结果更有说服力。

ｉｎｐｕｔｌｉｎｐｕｔ２ｉｎｐｕｔ３ｉｎｐｕｌ４

１

２

３

４

即使蛋白问存在较弱的或者问接的相互作用．应用免疫共沉淀也有可能检测到，出现阳性结果。细胞

内的ｃｏ—ＩＰ实验结果显示，ＮＦＡＴ２与ＨＭＧＢｌ在

、●??●

一，’

ｍｐｕｔ为细胞裂解浊ｓ｝乩．１图４

‘－

ｊ为免疫ｉＨ淀站玳

细胞内可相互结合，二者之间存在直接相互作用。笔者通过这２个经典的蛋白一蛋白相互作用检测方法初步证实，ＨＭＧＢｌ与ＮＦＡＴ２之闻存在直接相互作用。蛋白质相互作用是蛋白质发挥功能的生物学基础，只有２个或者多个蛋白能够相互接近并相对固定位置，蛋白内的活性部分才能相互影响而发挥功能，因此该实验在一定程度上揭示了二者协同促进ＩＬ－２报告基因转录表达的分子机制。

既往资料显示，ＨＭＧＢｌ与ＮＦＡＴ２存在一些共同的相互作用蛋白，二者有可能形成蛋白复合体。已证实．ＨＭＧＢＩ可作为雌激素受体?ａ（ｅａｔｒｏ－

ｇｅｎ

ＮＦＡ’１２与ＩＩＭＧＢＩ篮白在细胞内直接结台

３讨论

新近的资料证实，ＨＭＧＢｌ可作为机体内一种信号动员免疫系统活化。例如促进树突状细胞成熟、诱导Ｔ细胞分泌ＩＬ一２和干扰素－７从而发生Ｔｈｌ极化“。’，但ＨＭＧＢｌ是通过何种途径促进ＩＬ－２表达分泌的呢？业已明确，ＮＦＡＴｓ是淋巴细胞活化中关键的信号分子家族，被Ｔ细胞受体信号活化后．转位人核内调控重要基因转录表达。ＮＦＡＴ蛋白在静息状态下位于Ｔ淋巴细胞胞浆中．高度磷酸化．活化时被钙调蛋白依赖性磷酸酯酶（ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ）作用而发生去磷酸化，移位人细胞

核，调节诸如ＩＬ－４、ＩＬ＿２、ＩＬ－５、ＩＩ．－１３、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－

ｒｅｃｅｐｔｏｒ?口，ＥＲ）的共激活蛋白促进ＥＲ的转录

活性“”。ＥＲ转录的关键步骤在于ＥＲ与雌激素反应元件（ｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｓｐｏｎｓｅｅｌｅｍｅｎｔ，ＥＲＥ）结合，从而启动下游基因转录表达。ＨＭＧＢｌ蛋白可以显著促进ＥＲ与ＥＲＥ的结合“”。另一方面．军事医学科学院的叶棋浓教授研究表明（资料未显示）．ＮＦＡＴ家族成员可与ＥＲ直接结合并相互影响信号通路．因此．有理由推测ＨＭＧＢｌ可能与ＮＦＡＴ发生直接相互作用。另有资料表明，一种

３、ＴＮＦ－＝等重要免疫分子的表达“”。成熟的Ｔ淋巴细胞主要表达ＮＦＡＴｌ、ＮＦＡＴ２，如果抑制ＮＦＡＴＩ／２的水平，淋巴细胞则会基本失去合成释放免疫分子的能力“”。ＮＦＡＴＩ一４的ＤＮＡ结合

区，（ＤＮＡ

ｂｉｎｄｄｏｍａｉｎ．ＤＢＤ）都可以与ＩＬ－２的

ＨＭＧＢｌ／２家族中ＤＮＡ结合蛋白成员——ＤＳＰｌ

（ＤＳＰｌ中含有与ＨＭＧ序列相似的结构域）．可与Ｒｅｌ同源域家族成员发生相互作用””。而ＮＦＡＴｓ结构中含有Ｒｅｌ相似结构域（Ｒｅｌ

ｓｉｍｉｌａｒｄｏｍａｉｎ，

ＮＦＡＴ启动子区域结合。同时结合激活蛋白一１“”。而且，我们前期研究证实．ＨＭＧＢｌ可协同ＮＦＡＴ２促进ＩＬ－２基因转录表达…．为了进一步探讨ＨＭＧＢｌ与ＮＦＡＴ２之问的分子调控机制，本实验应用蛋白质相互作用技术，检测ＨＭＧＢｌ与ＮＦＡＴ２在细胞内外的直接相互作用。

笔者应用ＧＳＴ－ｐｕｌｌｄｏｗｎ实验验证了这２个蛋白在体外相互结合的情况。通过蛋白纯化技术得到提纯人的带ＧＳＴ标签的重组ＮＦＡＴ２全长蛋白，再将带Ｈｉ３标签的ＨＭＧＢＩ质粒进行体外翻译，得到带放射性同位素Ｓ的人重组Ｈｉｓ－ＨＭＧＢｌ蛋白。将２个蛋白放在结合缓冲液中进行结合，再

ＲＳＤ），结构上的特点提示二者可能直接相互作用。

ＨＭＧＢｌ可作为多种转录因子的共激活因子“”．ＨＭＧＢｌ可促进雌激素、雄激索及糖皮质激素受体的ＤＮＡ结合能力，只要加入少量提纯的ＨＭＧＢＩ，这些受体结合相应ＤＮＡ序列的能力就会明显增强。研究证实，ＨＭＧＢｌ更易于与已折曲的ＤＮＡ或者具有较大角度形状的ＤＮＡ结合．ＨＭＧＢｌ可以与某个激素受体、相应的ＤＮＡ序列形成３元复合体，帮助这些转录因子结构变形，更好的与相应的ＤＮＡ片段相结合，从而成倍的增强这些激素受体的转录活性。从这一点看，ＨＭＧＢｌ

用ＧＳＴ琼脂糖珠去沉淀ＮＦＡＴ２融合蛋白，如果

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所起的作用类似于支架蛋白（ｓｃａｆｆｏｌｄｐｒｏｔｅｉｎ），可以帮助ＤＮＡ片段与转录因子相互结合并处于功能位置。而且，体外试验证明，ＨＭＧＢｌ可与这些激素受体短暂的结合¨。，例如黄体酮激素受体、雌激素受体和雄激素受体等。因此，ＨＭＧＢｌ可作为这些转录因子的伴侣蛋白或者伴侣分子（ｃｈａｐｅｒ—ｏｎｅ），帮助其结合到相应的ＤＮＡ片段上去，一旦完成任务，ＨＭＧＢｌ即脱开解构。在这种方式中，ＨＭＧＢｌ有可能先与基因序列结合再帮助转录因子结合进来。或者存在另一种作用方式，转录因子先与ＤＮＡ片段形成复合物，ＨＭＧＢｌ接着再加入进来形成蛋白一ＤＮＡ复合物或者蛋白一蛋白复合体。现有的研究结果更趋向于后一种作用方式，因为在没有黄体酮激素受体时，无法检测到ＨＭＧＢｌＤＮＡ复合物；只有当激素受体存在时，才能检测到ＨＭＧＢｌ与ＤＮＡ相互结合。而且，即使没有ＤＮＡ片段，也能检测到ＨＭＧＢｌ与黄体酮激素受体的短暂、较弱的结合。

综上所述，笔者首次发现ＨＭＧＢｌ与ＮＦＡＴ２之间存在直接相互作用，这为阐明ＨＭＧＢｌ通过ＮＦＡＴ２发挥免疫学效应的分子机制提供了生物学基础．并进一步为脓毒症的防治策略提供了潜在的干预靶点。但是，目前对于ＨＭＧＢｌ如何促进ＮＦＡＴ２的转录活性的确切机制尚缺乏充分研究，还需继续深入探讨。

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