地黄microRNAs和靶基因的生物信息学预测及验证_赵春丽

中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第45卷 第8期 2014年4月 ·1129·

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地黄microRNAs和靶基因的生物信息学预测及验证

赵春丽1, 2，李先恩2，都晓伟1，孙 鹏2 **

1. 黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040

2. 中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193

摘 要：目的 拟利用地黄Rehmannia glutinosa EST数据通过生物信息学手段预测新的地黄microRNAs（miRNA），为今后地黄miRNA的生物学研究奠定基础。方法 根据miRNA 家族在不同物种中的保守性，将miRBase数据库中的已知植物miRNA与通过高通量测序获得的93 172条地黄EST序列进行同源比对，按照miRNA前体应具备的标准进行筛选。结果 预测到分属于8个家族的8条潜在地黄miRNA序列，并通过实时荧光定量PCR对8条预测的miRNA进行了检测，证实8条miRNA在地黄中真实存在。随后利用软件对8条地黄miRNA的靶基因进行预测，发现其靶基因主要编码与地黄生长发育、代谢以及胁迫响应等过程相关的蛋白。结论 新预测的地黄miRNA及其靶基因为今后研究它们在地黄中的生物学功能奠定了基础。

关键词：地黄；microRNA；靶基因；生物信息学；PCR检测

中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)08 - 1129 - 07

DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.08.017

Bioinformatic prediction and validation of conserved microRNAs and their target genes in Rehmannia glutinosa

ZHAO Chun-li1, 2, LI Xian-en2, DU Xiao-wei1, SUN Peng2

1. Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China

2. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Beijing 100193, China Abstract: Objective In order to establish the material basis for future studies on the biological function of miRNAs, we aimed to predict novel miRNAs from EST sequences of Rehmannia glutinosa by using bioinformatic strategies. Methods Since most of the plant miRNAs were conserved in plant species, all plant miRNAs deposited in miRNase were aligned to the 93 172 EST sequences generated by next generation high-throughput RNA sequencing technology and the putative miRNA precursors were screened according to serious criteria. Results Eight novel rehmannia miRNAs were identified which belonged to eight different families that were further validated by real-time PCR analysis. Then the eight rehmannia miRNAs were subjected to target prediction analysis, and the results showed that the target genes encoded the proteins related to root growth, metabolism, stress responses and other processes. Conclusion The miRNAs and their target genes identified in this study will provide clues to their biological functions in R. glutinosa.

Key words: Rehmannia glutinosa Libosch; microRNA; target gene; bioinformatics; PCR detection

地黄Rehmannia glutinosa Libosch为玄参科

（Scrophulariaceae）地黄属Rehmannia Libosch. ex

Fisch. et Mey多年生草本植物，是著名的“四大怀药”

之一，具有滋阴清热、补血止血等功效。地黄应用广泛，为多种方剂配伍要药及中成药的主要原料。 miRNA是一类在真核生物中发现的长度为21 nt

收稿日期：2013-11-20

基金项目：国家自然科学基金资助项目（30901969）

作者简介：赵春丽（1986—），女，硕士研究生，研究方向为药用植物分子生物学。Tel: 13121897466 E-mail: chunli_x2@http://wendang.chazidian.com

*通信作者 都晓伟 Tel: (0451)87267031 E-mail: duxiaowei@http://wendang.chazidian.com

孙 鹏 Tel: (010)62810019 E-mail: psun@http://wendang.chazidian.com

网络出版时间: 2014-03-17 网络出版地址: http://wendang.chazidian.com/kcms/doi/10.7501/j.issn.0253-2670.2014.08..html

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左右的单链小分子RNA。miRNA通过与靶基因的特异性碱基互补配对，从而降解靶基因或抑制其翻译，在转录后水平对动植物的基因表达进行调控[1]。miRNA参与一系列真核细胞的基因表达调控，在植物中，对植物器官的形态建成、生长发育、逆境胁

2.2 地黄miRNA的生物信息学预测流程 将无重复的植物miRNA序列与93 172条地黄

EST进行序列同源比对，筛选出少于等于3个碱基错配的同源EST序列，比对上的EST再经自身比

对去除冗余序列后，用Mfold 3.2软件

迫的应答、次生代谢等都具有重要的调控作用[2]。（http://www.bioinfo.rpi.edu/ applications/mfold/rna/ miRNA在植物体内的表达具有组织和时期特异性，form1.cgi）预测候选miRNA前体序列的二级结构，

并分析其结构稳定性[10]。 并且在进化上有很高的保守性[3-5]。

近年来，随着miRNA研究范围的扩大和深

入，miRBase数据库（http://wendang.chazidian.com/）中的miRNA数量不断增多，一些药用植物如红豆杉、白木香、人参、地黄等也开展了miRNA研究，Yang等[6]利用高通量测序技术分析、鉴定与地黄连作障碍相关的miRNA，发现一些与转录、信号转导、块根发育相关的miRNA可能与地黄连作障碍的形成相关。与模式植物拟南芥、水稻等已鉴定的miRNA数量相比，目前已鉴定的地黄miRNA数量有限，在miRBase数据库中仅登录了13条地黄miRNA序列。虽然高通量测序仍是目前鉴定miRNA的最直接手段，但利用本物种EST序列预测新的miRNA序列则更加经济、快捷，可以有效地扩充本物种的miRNA数量，被广泛用于植物miRNA的鉴定[7-9]。课题组前期转录组测序工作的完成，为地黄miRNA及其靶基因的生物信息学预测奠定了良好的基础。本研究根据植物miRNA进化上的高度保守性，以已知的植物miRNA为探针，与高通量测序获得的地黄EST进行序列比对，预测新的地黄miRNA，为扩展地黄miRNA的研究范围奠定研究基础。 1 材料

地黄Rehmannia glutinosa Libosch种植于中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所试验田，经中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所李先恩研究员鉴定为地黄栽培种85-5。 2 方法

2.1 参考miRNA序列的选择

本研究首先从miRNA数据库miRBase中下载了拟南芥、大豆、水稻、玉米等71种植物（不含地黄）的7 385条miRNA。随后，为避免miRNA数据的冗余，本研究剔除了不同物种miRNA之间的重复序列，剩余的miRNA序列进入下一步分析，作为预测地黄保守miRNA的参照序列。

2.3 二级结构筛选标准

地黄miRNA的生物信息学预测参照Zhang等[11]

的方法，具体筛选标准如下：（1）新预测的地黄miRNA序列与已知的miRNA序列碱基错配数小于4；（2）新预测的地黄miRNA 前体能够折叠成发夹状的二级结构，并且其成熟的miRNA与相同家族已知的miRNA位于前体发夹结构的相同臂上；（3）成熟的miRNA 与另一条臂上的互补序列有不超过 5 个的错配碱基；（4）成熟的miRNA与另一条臂上的互补序列不允许有缺口或者较大的环；（5）miRNA前体要有绝对值较高的最小折叠自由能（Minimal folding free energy, MFE）和较高的最小折叠自由能系数（minimal folding free energy index, MFEI）；（6）miRNA中A＋U量在30%～70%。 2.4 miRNA的荧光定量PCR检测

用Trizol试剂（Invitrogen, USA）提取各组织的总RNA，具体方法参照说明书。分别提取地黄的根、茎、叶、花4个不同组织的总RNA，Nano DropTM 2000分光光度计（Thermo Fisher, USA）检测总RNA的浓度和纯度，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，总RNA于?80 ℃贮存备用。

miRNA在地黄组织的表达检测采用实时荧光定量PCR方法：首先在miRNA的3’末端做多聚腺苷酸化处理，然后用含接头的引物进行第一链反转录，最后用荧光定量PCR检测miRNA的表达情况。其中miRNA3’末端polyA处理和第一链cDNA合成均采用miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒（TIANGEN）。荧光定量PCR反应在CFX—1000型荧光定量PCR仪上（Bio-Rad）运行，按照miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒（TIANGEN）说明步骤冰上配制反应体系：miRcute miRNA Premix（2×）10 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.4 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.4 μL，DNA模板2.5 μL，ddH2O（灭菌蒸馏水）补足至20 μL，设置温度梯度摸索PCR最佳退火温度，最终确定反应条件为95 ℃

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预变性2 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸1 min，40个循环，延伸阶段收集信号，从60 ℃ 到95 ℃，每个循环增加0.5 ℃，持续0.05 s获得解链温度，采集融解曲线荧光信号。反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和溶解曲线，记录Ct值。

2.5 地黄miRNA 靶基因的生物信息学预测

由于植物miRNA与其靶基因具有高度的序列互补性，科研人员根据这一特点开发了多款植物miRNA靶基因预测软件，本实验以地黄EST序列为参照序列，采用当前运用较多的psRNATarget软件（http://www. http://wendang.chazidian.com/psRNATarget/）进行在线靶基因预测，运行参数设置为默认。psRNATarget通过罚分机制筛选潜在靶基因，每个G∶U摆动配对、碱基插入或缺失分别罚0.5、1、2分，在miRNA

5’端第2～7 bp发生除G∶U外的碱基错配罚分为

1，总得分≤3的基因为miRNA的潜在靶基因[12]。根据靶基因的功能注释，分析miRNA在地黄中的功能作用。 3 结果与分析

3.1 预测到的地黄miRNA序列及其二级结构

从miRBase（V 20.0）数据库下载的71种植物共计7 385条miRNA经去冗余后得到3 956条唯一的miRNA序列，以此为探针与地黄EST序列进行BLASTN比对分析，筛选出237条候选miRNA前体序列，其中能够用Mfold折叠形成茎环结构，并符合相应筛选标准的共有8条。最终成功预测到的8条地黄miRNA，分别属于8个不同的miRNA家族（表1）。

表1 地黄中新发现的miRNA及其序列特征

Table 1 Novel miRNAs predicted from R. glutinosa and their sequence signatures

miRNA miR168 miR172 miR396 miR397

miR472 miR2218 miR5290 miR6111

miRNA序列 (5’-3’)

UAGCUUGGUGCAGCUCGGGA UGAGAAUCUUGAUGAUGCUGCAU UUCAAGAAAGCUGUAGGAAAA UUGAGUGCAGCGUUGAUGAU UGGUCGAAGUAGGCUA AAUC UUGCCUGCUUGCCGAUUCCU AUUUGGAGAGAGAAAGACACAU CUUUAUGUCACG AUGGAUGAC

Gene ID 4 495 40 783 92 675 35 712 8 171 92 228 73 579 46 017

定位 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’

LM 20 23 21 20 20 20 22 21

LP 109 69 110 65 51 83 62 60

(A＋U) / % 45.87 63.77 66.36 52.31 47.06 51.81 62.90 45.00

MFE / (kJ·mol?1)

196.36 75.78 172.50 56.94 65.73 149.89 149.05 98.81

MFEI 0.79 0.72 1.11 0.44 0.58 0.90 1.55 0.72

定位-成熟miRNA在前体中的定位 LM-成熟miRNA的长度 LP-前体序列的长度 MFE-最小折叠自由能 MFEI-最小折叠自由能系数 Location-location of mature miRNA in precursor LM-length of mature miRNA LP-length of precursor MFE-minimal folding free energies, unit is MFEI-minimal folding free energy index

在地黄中预测到的8条成熟miRNA的长度为20～23 bp，其中有一半为20 bp。通常情况下，大多数动物miRNA前体长度为70～100 bp，其二级结构也相对保守[13]；而植物miRNA前体在长度和二级结构上则存在多样性[14]。由表1可以看出，新预测的地黄miRNA前体的长度变化相对较大，在51～110 bp；虽然地黄miRNA前体的长度和二级结构变化很大，但都能折叠成茎环结构（图1）。8条成熟miRNA有4条位于前体的3’端，4条位于前体的5’端，该比例与在其他植物中的报道类似[15-16]。

在新预测的8条地黄miRNA中，地黄miRNA前体的A＋U量在45.0%～67.0%，MFE在56.94～196.36 kJ/mol，平均值为120.62 kJ/mol；其MFEI为0.44～1.55，平均值为0.85（表1），均符合miRNA二级结构稳定性要求。

3.2 新预测地黄miRNA的荧光定量PCR验证

为了验证新预测的miRNA在地黄中的真实性，根据8条miRNA序列设计引物，用实时定量PCR对地黄miRNA进行检测，荧光定量融解曲线显示各miRNA扩增产物为单峰，PCR产物琼脂糖凝胶电泳显示片段大小约100 bp，表明8条miRNA在地黄中真实存在。Ct值与表达值的关系为Ct值越小，表达值越高。8个miRNA在地黄中均有表达，其中miR472和miR6111在4个组织中的表达差异不大；其余6条miRNA的表达呈现组织特异性，其中miR168和miR5290的Ct值在根、茎、叶、花中依次降低，说明其表达值呈逐渐升高的趋势；miR396和miR172在叶、花中高表达；miR397在花中表达值高；miR2218在茎、花中表达值高。结果见图2。

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miR168 miR172

A U UG UCU AG --- - G UU UG AC GCCAGCUCCUGA UUG UC GC GCC UC CCAUAU GA UGGU AG G UGGUCGAGGGCU GAC GG CG UGG AG GGUAUA UU ACCG UC A G C GU UU- A- GUA A G C- -- CA

A A - UG U C---- AAA UG GAAUC U A GAUGCUG AUUGGC U AC UUUAG A U UUGCGAC UAAUCG A G A U GU U AUAUA GCC

miR396 miR397

C - C U AUUA-- U UC AG C U -- C UU U- --- U CAUG UUUUCC ACAGC UUUCUUGAACUUU UUU AUUUU UCCUU A GUCGU GAG UG AGCG GA GAU UCU A GUAC AAAAGG UGUCG AAAGAACUUGAAG AAG UAAAA AGGGA A CGGUA CUC GC UCGU CU CUG GGA G A G A - AAGACG U CU GA A U CA - UC UU UAU U

miR472 miR2218

C GU UA A- CG UCGUG CGAAG GGCU AAU U AGCAC GCUUU UCGA UUG C A -- GC GG UG

GA A U- UA UACUCUUAGAUCU GGAA UGGGAGG UUGGCAAGC GC \ CCUU ACCCUCC AGCCGUUCG CG C

CA - UU UC UUUUUAAACACCA

miR5290 miR6111

G AU A CAUUUGGAGAGAGAAA ACACAUGU GU U GUAAACCUCUCUCUUU UGUGUACA UA A A CG G

G -- - C A AUG GCG GUCCAU GUGGCGU GAGU GU \ CGC UAGGUA CACUGUA UUCA CA U G AG G U G GGU

黑色加粗为成熟miRNA序列 Black mark for mature miRNA sequences

图1 新预测地黄miRNA前体的二级结构图

Fig. 1 New prediction on second structures of pre-miRNA from R. glutinosa

40 35 30 Ct值

25 20 15 10

miR172 miR168 miR396 miR397 miR472 miR2218 miR5290 miR6111

因子，在真核生物的基因表达调控中起到十分重要的作用，参与了调控植物器官的形态建成、生长发育、信号转导、激素合成和对逆境因子的应答[17-18]。除此之外，研究人员还发现miRNA影响植物次生代谢产物的生物合成。如拟南芥中的miR828参与调控黄酮类化合物等次生代谢产物的合成[19]；

miR156可靶向与次生代谢相关的SPL转录因子，当上调miR156的表达时可促进拟南芥中花青素的积累，下调miR156的表达时却会使植物体内黄酮醇的积累量升高[20]。随着miRNA研究的扩大和深入，植物miRNA的功能研究不再仅集中在模式植物中，药用植物的miRNA研究也越来越得到关注。如Hao等[21]发现红豆杉中的miR164和miR171可直接靶向紫杉醇合成途径中的紫杉烷13α-羟基化酶和紫杉二烯2α-O-苯甲酰转移酶基因，参与调控紫杉醇的生物合成。Wang等[22]通过实验推测出掌叶半夏中miR166作用的靶基因与叶的发育有关；miR397的靶基因与氧化、干旱、营养等胁迫响应有关；miR156作用的靶基因参与花的发育调控。陈新建等[23]利用Solexa测序技术并结合生物信息学和

根 茎 叶 花

Fig. 2 Expression of new predicted miRNAs from

R. glutinosa in roots, stems, leaves, and

flowers of R. glutinosa

图2 新预测的地黄miRNA在根、茎、叶、花中的表达情况

3.3 地黄miRNA靶基因的预测及主要功能分析

根据新鉴定的8条地黄miRNA序列，通过在线软件psRNATarget对其靶基因进行了预测，8条地黄miRNA共预测到51个靶基因，其中有34个靶基因有功能注释，这些靶基因分别编码转录调控因子、信号转导、细胞骨架、代谢等相关蛋白见表2。 4 讨论

miRNA作为一种新发现的非编码基因表达调控

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表2 地黄中新预测miRNA的靶基因及其编码蛋白

Table 2 Target genes of new predicted miRNA and their encoding proteins in R. glutinosa

miRNA miR168

靶基因

Unigene4495_RNA Unigene10361_RNA Unigene192_RNA

miR172

Unigene67738_RNA Unigene14104_RNA Unigene867_RNA Unigene58139_RNA Unigene22164_RNA Unigene18719_RNA Unigene78641_RNA

miR396

Unigene24520_RNA Unigene12013_RNA Unigene32769_RNA

miR397

Unigene35712_RNA Unigene74397_RNA Unigene30375_RNA Unigene9352_RNA

miR472 miR2218 miR5290

Unigene8171_RNA Unigene24988_RNA Unigene56861_RNA Unigene6899_RNA Unigene25368_RNA Unigene6940_RNA Unigene23380_RNA Unigene79963_RNA

miR6111

Unigene46017_RNA Unigene80378_RNA Unigene39634_RNA Unigene23626_RNA Unigene19132_RNA Unigene17761_RNA Unigene66344_RNA Unigene39357_RNA Unigene5363_RNA

AGO1-2 光敏素B 生长素响应因子1 AP2结构域的转录因子 poly(A)-mRNA 结合蛋白 生长素响应家族蛋白 蛋白质结合蛋白 核基质成分蛋白1 F-box蛋白 假设蛋白

微管蛋白的γ复合物相关蛋白 钼喋呤硫酸化酶 Tic62蛋白质 LAC11 漆酶 邻二酚氧化酶 假设蛋白 Jp18 假设蛋白

GTP结合蛋白同系物LepA RNA识别含基序蛋白质 3-酮脂酰辅酶A硫解酶2 磷酸胆碱磷酸酶1 ATP/ ADP转运质体 MMP37样蛋白 细胞分裂素调节激酶1

S位点的凝集素蛋白激酶家族蛋白 激酶家族蛋白

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 受体激酶受体TRKb ATP结合酶 类受体蛋白激酶2 激酶家族蛋白 激酶相互作用因子1

靶蛋白

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抑制作用 分裂 分裂 分裂 分裂 翻译 分裂 分裂 分裂 分裂 分裂 分裂 分裂 分裂 分裂 分裂 分裂 分裂 分裂 分裂 分裂 分裂 分裂 分裂 分裂 翻译 分裂 分裂 分裂 分裂 分裂 分裂 分裂 分裂 分裂

荧光定量分析，在正茬和重茬地黄之间构建了miRNAs差异表达谱，发现表达差异的miRNA参与了转录调控、信号传导、逆境生理等生物学过程，这些miRNAs及其靶基因直接或间接地调控地黄根系的生长发育，在miRNAs介导的转录后基因表达

调控在连作障碍的形成过程中可能起到关键作用，为通过miRNAs调控基因表达而引起地黄连作障碍的分子机制提供了线索。因此，挖掘、鉴定药用植物miRNA不仅能够解析植物次生代谢产物的生物合成途径，对今后解决药用植物的生产栽培中的困