西洋参冠瘿组织与西洋参药材人参皂苷含量比较研究_朱建华

#670#JournalofChineseMedicinalMaterials 第32卷第5期2009年5月

#资源#

西洋参冠瘿组织与西洋参药材人参

皂苷含量比较研究

朱建华,王文琼,唐 乐,孙一蕊,于荣敏(暨南大学药学院,广东广州510632)

摘要 目的:比较西洋参冠瘿组织与西洋参药材人参总皂苷含量及各人参皂苷含量的差异,为采用生物技术方法生产人参皂苷提供理论依据。方法:采用香草醛-冰醋酸-高氯酸紫外显色法测定西洋参冠瘿组织与西洋参药材中总皂苷含量;用HPLC法测定西洋参冠瘿组织与西洋参药材中人参皂苷Rb1、Rb3、Rc、Re的含量。结果:(1)培养27d西洋参冠瘿组织总皂苷积累量达到最高,与西洋参药材总皂苷含量相当;(2)西洋参冠瘿组织中人参皂苷Rb1、Re的含量约为西洋参药材的50%,人参皂苷Rc的含量约为西洋参药材的80%,人参皂苷Rb3的含量远远高于西洋参药材,约为西洋参药材的16倍。结论:西洋参冠瘿组织可作为大规模生产人参皂苷的新途径。

关键词 西洋参;冠瘿组织;人参皂苷;定量分析;高效液相色谱法

中图分类号:R282171 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2009)05-0670-04

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ComparativeStudiesontheAmountofGinsenosidesBetweentheCrownGalls

andChineseMedicinalMaterialsofPanaxquinquefolium

ZHUJian-hua,WANGWen-qiong,TANGLe,SUNY-ire,iYURong-min(CollegeofPharmacy,JinanUniversity,Guangzhou510632,China)

Abstract Objective:Toprovidetheoreticalbasisfortheproductionofginsenosidesbyusingmodernbiotechnologies,thecom-parativestudiesoftheamountofginsenosidesbetweenthecrowngallsandChinesemedicinalmaterialsofPanaxquinquefoliumwerecarriedout1Methods:Totalginsenosidesweredeterminedbyspectrophotometry,andthecontentsofginsenosideRb1,Rb3,Rc,ReweredeterminedbyHPLC1Results:(1)ThetotalginsenosidesinthecrowngallsofPanaxquinquefolium(aftert27daysccultivation)wasa-lmostasmuchasthatofChinesemedicinalmaterialofPanaxquinquefolium1(2)ThecontentsofginsenosideRb1,ReinthecrowngallswereabouthalfofthatinChinesemedicinalmaterialsofPanaxquinquefolium,andginsenosideRcwasabout80%1ButtheamountofginsenosideRb3inthecrowngallsofPanaxquinquefoliumwasmuchmorethanthatinChinesemedicinalmaterialsofPanaxquinquefo-liumasalmost15timeshigher1Conclusion:ThecrowngallsofPanaxquinquefoliummaybeanewpotentialresourceforlarge-scalepro-ductionofginsenosides1

Keywords PanaxquinquefoliumL1;Crowngalls;Ginsenosides;Quantitativedetermination;HPLC

西洋参为五加科人参属植物西洋参PanaxquinquefoliumL1的干燥根,为名贵药材,具有滋补强壮、益肺阴、清虚火、养血生津、安神益智等功112

效。但由于其生长期较长,且易受病虫害、气候、环境及培养技术等多种不利因素的影响,故产品远不能满足市场要求,价格昂贵。

人参皂苷类是控制西洋参品质的重要指标之一,是西洋参中的主要活性成分,但由于其结构复杂,至今未实现人工全合成。

西洋参冠瘿组织是利用植物转基因技术将根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefeciens)中Ti质粒上的一段DNA(TransferredDNA,T-DNA)插入到西洋参植物细胞核基因组而得到的表现型

122

具有生长迅速、不需加入外源激素、次生代谢物含量高、遗传性状稳定等特点。笔者的前期工作表明,转基因西洋参冠瘿组织中含有多种人参皂苷类成分,并且含有西洋参药材中没有的新成分。为进一步研究西洋参冠瘿组织作为大量生产人参皂苷的可行性,本文采用香草醛-冰醋酸-高氯酸紫外显色法和HPLC法对西洋参冠瘿组织与西洋参药材总皂苷含量及两者中的人参皂苷Rb1、Rb3、Rc、Re的含量进行了较系统的比较研究。1 材料与仪器

西洋参药材购自广州市东风灵实业有限公司;人参皂苷Rb1、Rb3、Rc、Re购自成都曼思特生物科技有限公司;西洋参冠瘿组织系本教研室培养;乙腈

13-52

,该转基因组织

收稿日期:2008-12-10

作者简介:朱建华(1982-),女,博士研究生,主要从事中药及天然药物活性成分研究;Te:l020-85222069,E-mai:lzjh4164@sina1com。

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,Te:l,E-mai:ljnu11。

JournalofChineseMedicinalMaterials 第32卷第5期2009年5月#671#

为色谱纯,水为双蒸水,其他试剂均为分析纯。

总皂苷含量采用TU-1810S型紫外可见分光光度计测定。各种皂苷含量采用安捷伦1200液相色谱仪测定:配四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、DAD检测器。2 方法与结果

211 西洋参冠瘿组织与西洋参药材总皂苷含量的测定

21111 对照品溶液的制备:精密称取经干燥至恒重的人参皂苷Rb1010048g,加50%乙腈溶解定容至5mL容量瓶,制成每1mL含0196mg的溶液,作为对照品溶液。

21112 供试品溶液的制备:分别采集在液体培养基上培养了25、27、28、30d的西洋参冠瘿组织,57e烘箱烘干,研磨成粉。精密称取西洋参冠瘿组织及西洋参药材粉末11000g,加入甲醇25mL,加热回流1h后,放冷,滤过,蒸干滤液。残渣加水20mL使溶解,用正己烷萃取2次,每次10mL。水层用水饱和的正丁醇萃取3次,每次15mL,合并正丁醇萃取液,用正丁醇饱和的水洗2次,每次10mL,分取正丁醇液,蒸干。残渣加入少量50%乙腈使之溶解,并定容至20mL容量瓶中,摇匀,得供试品溶液,备用。制得供试品XGY25,XGY27,XGY28,XGY30(分别为培养了25、27、28、30d的西洋参冠瘿组织),与XYS(西洋参药材)。

21113 测定方法:分别取0110mL/211120项所得各供试样品液于干燥具塞试管,85e水浴挥干溶剂后,精密加入012mL新配制5%香草醛-冰醋酸溶液和018mL高氯酸,充分摇匀,置60e恒温水浴加热15min,取出后立即置于冰水浴中冷却至室温,再加入5mL冰醋酸,摇匀,于544nm波长处测定其吸光度值。

21114 标准曲线的绘制与线性关系:精密量取对照品溶液0110、0120、0130、0140、0150、0160、0170、0180、0190mL,分别加入干燥具塞试管中,按/211130项下方法测定。以吸光度为纵坐标,对照品含量为横坐标,绘制标准曲线。得线性回归方程y=21826+010452x,r=019956,对照品在01096~01768mg范围内线性关系良好。

21115 精密度及重现性试验:精密量取对照品溶液013mL,按/211130项下方法测定,重复6次。其RSD为01001%,表明方法精密度良好。取同一批西洋参冠瘿组织6份,按/211120项下方法制备供试品溶液,按/211130项下方法测定。精密度试验

1验RSD为01062%,表明此方法重现性良好。

21116 显色溶液稳定性试验:精密量取对照品溶液013mL,分别按/211130项下方法显色后放置,于0、10、20、30、40、50、60min测定吸光度值,其RSD为31107%,结果表明对照品60min内显色稳定。21117 加样回收率试验:精密称取已知总皂苷含量的西洋参冠瘿组织粉末110000g,共6组,加入对照品3414mg,按照/211130项下方法制备及显色测定,平均回收率为10215%,RSD为1185%。

21118 样品含量测定:精密量取各供试品溶液0110mL,按/211130项下测定方法操作,计算各供试品中总皂苷含量,结果见表1。

表1编号XYSXGY25XGY27XGY28XGY30

样品含量测定实验结果

吸光度0190201866018800175201686

总皂苷百分含量/%

61065181519151004161

212 HPLC法测定西洋参冠瘿组织与西洋参药材中人参皂苷Rb1、Rb3、Rc、Re的含量

21211 色谱条件:色谱柱:安捷伦HypersilODS柱(250mm@416mm,5Lm);流动相:乙腈(A)-水(B)梯度洗脱:0min20%A,6min22%A,7min23%A,20min23%A,45min45%A,60min60%A;流速:110mL/min;柱温:30e;检测波长:203nm。在此色谱条件下,人参皂苷Rb1、Rb3、Rc、Re保留时间分别为1414、3615、3715、3819min。色谱图见图1。

图1 混合对照品(A)、西洋参(B)、

XGY27(C)的HPLC图谱

注:1、2、3、4分别为人参皂苷Re、Rb1、Rc、Rb3的色谱峰

21212 对照品溶液的制备:精密称取人参皂苷Rb1、Rb3、Rc、Re适量,用50%乙腈配制成浓度为

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21213 供试品溶液的制备:制备方法同/211120项,最后定容在10mL容量瓶中,制得供试品XGY25、XGY27、XGY28、XGY30、XGY33,XGY36d(分别为培养了25、27、28、30、33、36d的西洋参冠瘿组织)及XYS(西洋参药材)。

21214 线性关系考察:取人参皂苷Rb1、Rb3、Rc、Re对照品溶液以1B1B1B1混合,制得混合对照品溶液,分别设定进样量为70、60、50、45、40、35LL,按/212110项下色谱条件测定,以峰面积积分值对进样量进行回归处理。得Rb1、Rb3、Rc、Re4条校正曲线,其回归方程和相关系数如表2所示。

表2对照品Rb1Rb3RcRe

4种人参皂苷标准品和标准曲线

回归方程

y=5451050714x+125115362y=20114735555x+281038463y=2081316578x+121373665y=3781994849x+391819418

相关系数0199884019993001999280199858

LL,分别测定Rb1、Rb3、Rc、Re的峰面积,计算各自

含量的相对标准偏差(RSD)。4种人参皂苷对照品含量的RSD均低于1100%,表明仪器精密度良好。21216 稳定性试验:取同一份供试品溶液(XGY27)依次在0、4、8、12、24h按/212110项下色谱条件进样分析,测定各组分的含量,计算RSD值。各组分的含量RSD值均低于1100%,供试品溶液在室温下24h内下基本稳定。

21217 重现性试验:取同一批西洋参药材按/212130项下方法平行提取5份,分别进样10LL,按/212110项下色谱条件进样分析,测定各组分的含量,计算RSD值。各组分含量的RSD值均低于2150%,表明此方法重现性良好。21218 加样回收率实验:分别精密称取已知含量的西洋参药材(XYS)和培养了27d的西洋参冠瘿组织各110000g,分别精密加入人参皂苷Rb1、Rb3、Rc、Re对照品各1mg,按供试品溶液的制备方法制备、测定。各平行测定5份。按/212110下色谱条件进样分析,计算回收率和RSD。平均回收率在97%~106%范围内,RSD值在1121%~2184%之间。21219 样品的测定:取/212130项配好的供试液各一份,按/212110项下色谱条件进样分析,测定各供试液中人参皂苷的含量。结果如表3所示。

XGY30216724618320014452117862

XGY33215475812439014833213766

XGY36212749814209014964214813

16-82

结果表明:人参皂苷Rb1、Rb3、Rc、Re在60min内均得到较好分离;各标准曲线在35~70Lg范围

内线性关系良好。

21215 精密度试验:按/212110项下色谱条件对同一对照品溶液重复进样5次,每次进样量为40

表3人参皂苷Rb1Rb3RcRe

XGY25215831417529013071218404

XGY27310402610950014702217970

XGY28211868513608013349117880

不同培养天数西洋参冠瘿组织与西洋参中人参皂苷的含量对比/j

XYS511504014986016081416806

3 讨论

由表1可以看出,不同培养天数的西洋参冠瘿组织所含总皂苷差别较大(4%~6%),其中培养了27d的西洋参冠瘿组织总皂苷积累量达到最高(5191%),与西洋参药材总皂苷含量(6106%)相当。由于西洋参冠瘿组织具有生长条件可控、细胞增殖速度快、有效组分含量高、无需外源激素的加入、转基因组织可长期生长和保存等优点,因此利用西洋参冠瘿组织来生产总皂苷可大大缩短生长周期,降低生产成本。

由表3可知,西洋参冠瘿组织中人参皂苷Rb1、Re的含量约为西洋参药材的50%,人参皂苷Rc的含量约为西洋参药材的80%,但转基因西洋参冠瘿

3,

约为后者的16倍。据文献报道,Rb3对神经元

缺血性损害具有保护作用,能使海马神经元免受致死性缺血损害,而在短暂性前脑缺血发生时能延缓神经元的死亡,并具有抗血小板和抗血栓作用。故由本实验结果推测,转基因西洋参冠瘿组织在缺血

神经元保护作用及抗高血脂方面更优于西洋参药材。从图1可以看出,西洋参冠瘿组织中存在西洋参药材没有的成分,因此,西洋参冠瘿组织可能具有西洋参药材没有的新药理作用。

通过西洋参冠瘿组织与西洋参药材总皂苷含量对比及两者中人参皂苷Rb1、Rb3、Rc、Re含量的比较,笔者认为西洋参冠瘿组织可作为生产人参皂苷的一个重要来源,也可用来生产某种特定的皂苷,如Rb

JournalofChineseMedicinalMaterials 第32卷第5期2009年5月#673#

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不同产地木瓜药材中齐墩果酸和熊果酸的比较研究

张 玲,谢晓梅,彭华胜,左艳红

(安徽中医学院药学院/安徽省高校现代中药重点实验室,安徽合肥230031)

摘要 目的:为中药木瓜的品质评价提供依据。方法:运用TLC法、HPLC法,对安徽宣城、湖北长阳、重庆綦江三大木瓜产区所产的贴梗海棠、毛叶木瓜等8个样品以及榠楂的齐墩果酸与熊果酸进行定性定量比较。结果:木瓜属3种植物果实中齐墩果酸与熊果酸总含量以贴梗海棠最高,平均值为0162%,其次为毛叶木瓜,而榠楂最低;3类药材中,宣木瓜齐墩果酸与熊果酸总含量最高,资丘木瓜次之,而川木瓜最低。结论:本实验数据为宣木瓜、资丘木瓜与川木瓜间的质量评价提供了一定的参考依据。

关键词 贴梗海棠;毛叶木瓜;榠楂;齐墩果酸;熊果酸

中图分类号:R28216 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2009)05-0673-04

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木瓜为常用中药,具有舒筋活络、化湿和胃之功效。2005年版中国药典规定木瓜为蔷薇科植物贴梗海棠Chaenomelesspeciosa(Sweet)Nakai的干燥近

112

成熟果实。全国药用木瓜有安徽宣城、重庆綦江及湖北资丘3大产区,所产木瓜分别习称为宣木瓜、川木瓜与资丘木瓜,其中以宣木瓜为地道药材。宣木瓜在长期栽培中分化出罗汉脐、苹果型、药木瓜3个农家品种。果实按干燥后性状分为光皮木瓜和皱皮木瓜,光皮木瓜来源于榠楂,皱皮木瓜来源于贴梗海棠与毛叶木瓜。木瓜主要含有有机酸、皂苷、挥发油等化学成分,其中有机酸多具有抗肿瘤、抑菌、

12,32

抗血栓、抗艾滋病毒等生物活性,齐墩果酸和熊

142

果酸是木瓜有机酸中的主要化学成分。本文采用TLC法、HPLC法对不同产地木瓜类药材中的齐墩果酸和熊果酸进行了定性定量分析,以期为木瓜的品质评价提供依据。

收稿日期:2008-11-19

基金项目:安徽省自然科学基金(070413126)作者简介:张玲(1975-),女,硕士,讲师,主要从事中药分析。

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,Te:l,Fax:122

1 材料

不同木瓜样品的来源见表1,样品均经安徽中医学院药学院彭华胜副教授鉴定。新鲜木瓜置沸水

中烫至外皮灰白色,对半纵剖,晒干,用粉碎机粉碎。齐墩果酸和熊果酸对照品购自中国药品生物制品检定所(供含量测定用),批号分别为110709-200304和110742-200516。所用试剂均为分析纯或色谱纯。2 方法

211 TLC鉴别 取木瓜样品粉末约6g,精密称定,置100mL圆底烧瓶中,用三氯甲烷加热回流提取3次,每次1h,过滤,合并滤液,得澄清的提取液。将过滤后的提取液置于100mL烧瓶中,在沸腾的水浴上常压蒸馏,回收三氯甲烷,将提取液浓缩至膏状。用甲醇将膏状浓缩物溶解,并移至10mL量瓶中,用甲醇定容至刻度,摇匀,得供试品溶液备用

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