微波水解衍生高效液相色谱法测定西洋参中的氨基酸_渠琛玲

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微波水解衍生高效液相色谱法测定西洋参中的氨基酸_渠琛玲

第37卷

2009年5月????????????????????????分析化学(FENXIHUAXUE)??研究报告ChineseJournalofAnalyticalChemistry????????????????????????第5期685~690

微波水解衍生高效液相色谱法测定西洋参中的氨基酸

渠琛玲??玉崧成??白雨萍??游景艳??张寒琦

(吉林大学化学学院,长春130012)

摘??要??用微波辅助提取酸水解西洋参中的蛋白质,对生成的氨基酸进行微波衍生后用高效液相色谱法进行测定。对微波衍生条件和微波水解的条件进行了优化。研究结果表明,190??,15min微波水解得到氨基酸的产率与传统加热水解(110??,24h)的结果基本相同。用2,4??二硝基氟苯(DNFB)对氨基酸进行微波衍生,

氨基酸在微波衍生时间大于20s时,衍生反应基本完全;而传统DNFB衍生需在60??水浴加热1h,所以微波衍生法明显缩短了氨基酸分析时间。用高效液相色谱法对西洋参根中的氨基酸进行了测定,结果令人满意。关键词??微波水解,微波衍生,氨基酸,高效液相色谱,西洋参,2,4??二硝基氟苯*

1??引??言

氨基酸是蛋白质的组成部分。由于氨基酸分析在蛋白质化学、生物化学、食品科学、临床医学等领域的研究中起到重要的作用,因此,对氨基酸分析方法的研究得到人们高度重视。

[5]水解蛋白质测定氨基酸的传统方法是在6mol/LHCl中,110??下加热24h。冯娅等在160??、

不同微波功率和时间的条件下对蛋白质进行水解,并与传统的水解方法进行比较;穆军等[6][1~4]采用正交实验方法以H2SO4为水解介质,选用微波功率、H2SO4浓度、水解时间作为3个考察因素研究蛋白质的水解。文献[7]综述了不同介质的蛋白质微波水解以及氨基酸的损失情况。

柱前衍生高效液相色谱法测定氨基酸由于具有分析时间较短、灵敏度高等优点,近年来被越来越多地用于氨基酸分析,而衍生剂的选择是这种方法的关键。常用的衍生剂有邻苯二甲醛(OPA)、萘??2,3??二甲醛(NDA)、9??芴甲基氯甲酸酯(FMOC)、异硫氰酸苯酯(PITC)、丹酰氯(Dansyl??Cl)、4,4??二甲胺基

[8~12]偶氮苯??4????磺酰氯(DABS??Cl)和6??氨基奎啉??N??羟基琥珀酰亚胺碳酸盐(AQC)等。不同的衍生剂都

有各自的不足,如OPA不能与仲氨酸反应,FMOC需用戊烷萃取衍生完成后过剩的FMOC,使操作繁琐。而2,4??二硝基氟苯(DNFB)作为衍生剂具有成本低、衍生产物稳定、操作简便等优点,常规的DNFB衍生是在60??水浴加热的条件下进行1h。

[13]微波衍生气相色谱分析近年来逐渐增多。朱丹等用动态液相微萃取??微波衍生化??气相色谱??选

择离子检测??质谱法测定了毛发中的苯丙胺类毒品。而侯俊红等

波衍生)进行了分析。刘冬娴等

分析却少见报道。[15][14]对苯丙胺类的衍生化条件(包括微用微波衍生气相色谱法检测了丁丙诺啡。而微波衍生用于液相色谱

本研究将微波水解和衍生相结合研究了西洋参中蛋白质的微波水解以及氨基酸的微波辅助衍生,考察了实验条件对微波水解和衍生的影响,建立了快速测定氨基酸的方法,显著缩短了氨基酸分析时间,并为氨基酸的在线衍生奠定了基础。

2??实验部分

2.1??仪器与试剂

1100高效液相色谱仪(美国Ailgent公司),WR??C微波样品处理系统(北京美诚科技有限公司);Heidolph旋转蒸发仪。18种氨基酸(纯度均为99%),天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、苏氨酸(Thr)、甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、胱氨酸(Cys)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)和酪氨酸??2008??08??15收稿;2008??12??04接收

*E??mai:lanalchem@http://wendang.chazidian.com

????686分析化学第37卷(Tyr)购于Sigma公司;DNFB购自武汉福鑫化工有限公司。实验中所用的乙腈为HPLC级,水经过Milli??Q系统纯化。其它试剂均为分析纯。向0.03mol/L乙酸钠溶液(含0.15%三乙胺)中加入乙酸,调至pH为5.1,配制成乙酸??乙酸钠缓冲溶液。称取9.535gNa3BO3??10H2O,并用水定容至250mL,得到pH为9.0的H3BO3??Na3BO3缓冲溶液。用乙腈配制0.1mol/LDNFB溶液。西洋参采自吉林省靖宇县。

2.2??实验方法

2.2.1??标准溶液的配制??分别称取适量的18种氨基酸的标准品,用0.05mol/LHCl定容于10mL容量瓶中。得到浓度分别为4.261g/LAsp、3.881g/LGlu、1.954g/LSer、5.157g/LHis、1.420g/LGly、

3.875g/LPro、2.592g/LAla、1.758g/LVa、l3.356g/LMet、1.950g/LCys、1.936g/LIle、2.669g/LLeu、1.988g/LTrp、2.290g/LPhe、2.899g/LLys、1.902g/LTyr的混合标准溶液。

2.2.2??微波提取和水解??准确称取0.5g西洋参根粉末(过0.45mm孔径)于微波罐中,并加入20mL含1%苯酚(作为一种抗氧化剂可防止蛋氨酸等氨基酸氧化)的6mol/LHCl溶液。通氮气除氧后,旋紧盖子,放入微波炉中。控制时间和温度进行提取和水解。水解完毕后,冷却至室温,打开罐,抽滤,旋转蒸发浓缩样品,并用0.05mol/LHCl定容至5mL。用0.45??m滤膜过滤。

2.2.3??加热提取和水解??准确称取0.5g西洋参根粉末于微波罐中,加入20mL含1%苯酚的6mol/LHCl溶液。通氮气除氧后,旋紧盖子,放入110??烘箱水解24h。水解完毕后,冷却至室温,打开罐,抽滤,旋转蒸发浓缩样品,并用0.05mol/LHCl定容至5mL。用0.45??m滤膜过滤。

2.2.4??微波衍生??取经过滤膜的样品50??L,加入650??LH3BO3??Na3BO3缓冲溶液。最后加入150??L0.1mol/LDNFB衍生溶液,在固定微波功率260W,衍生时间50s的条件下放入微波中衍生。衍生后直接进样。

2.2.5??色谱条件??PrevailC18色谱柱(250mm??4.6mmI.D.,5??m),柱温:40??;流速:1.0mL/min;进样体积20??L。检测波长:360nm。流动相为乙腈(A)和乙酸??乙酸钠缓冲溶液(B),按以下梯度洗脱,0~5min,19%~12%A;5~15min,12%~18%A;15~20min,18%~28%A;20~39min,28%A;39~46min,28%~60%A;46~50min,60%A。[16]

3??结果与讨论

3.1??微波衍生条件的选择

3.1.1??衍生试剂用量??取一定浓度的氨基酸混标溶液,加入H3BO3??Na3BO3缓冲溶液,再加入不同量的DNFB溶液衍生。固定总体积,总氨基酸量和衍生剂的摩尔比为1??1、1??3、1??5、1??10和1??20变化。除了酪氨酸Tyr和赖氨酸Lys以外,其它氨基酸均在衍生比例1??5时衍生完全(见图1a)。图1b是加热衍生(60??,1h)时DNFB用量的影响。从图1b可以看出,衍生产物的信号在衍生比例为1??5、1??10和1??20时也基本不变。由于精氨酸(Arg)和苏氨酸(Thr)的色谱峰未分开,故对它们的峰面积加和进行

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了计算。

图1??氨基酸与衍生剂比例对衍生反应的影响

Fig.1??Effectsofratioofaminoacidsto2,4??dinitrofluorobenzene(DNFB)onderivationreaction

a.微波衍生(microwavederivation);b.加热衍生(heatingderivation)。

第5期渠琛玲等:微波水解衍生高效液相色谱法测定西洋参中的氨基酸

??687??

3.1.2??微波衍生时间??固定氨基酸与衍生剂的摩尔比为1??5,微波功率为260W

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。改变衍生时间。由图2可见,20s即衍生完全。

3.1.3??微波衍生功率??固定氨基酸与衍生剂的摩尔比为1??5,衍生时间30s。考察了微波功率的影响。结果表明,130W即可保证衍生完全。综上可知,固定氨基酸与衍生剂的摩尔比为1??5,衍生功率为130W时,30s即可以完成反应;固定氨基酸与衍生剂的摩尔比为1??5,衍生功率为

260W时,20s完成衍生反应。在后续定量实验中,

为了保证氨基酸衍生完全,衍生功率选取260W,衍??图2??衍生时间对衍生反应的影响生时间50s。

3.2??标准曲线的绘制??取不同浓度的氨基酸混标

Fig.2??Effectsofderivationtimeonderivationreaction

编号同图1(curvenumbersarethesameasinFig.1)。

溶液,加入适量缓冲溶液,按照1??5的比例加入衍生剂,控制微波衍生条件为功率260W、衍生时间为50s进行衍生,并以标准品浓度(c)为横坐标,峰面积(A)为纵坐标绘制标准曲线,线性回归方程如表1所示。表1还列出了方法的检出限(LOD)。由于精氨酸(Arg)和苏氨酸(Thr)未分开,没有对它们进行定量分析。

表1??16种氨基酸的标准曲线,浓度范围和检出限Table1??Calibrationcurve,concentrationrangeandLODfor16aminoacids

氨基酸

AminoacidsAsparticacid(Asp)Glutamicacid(Glu)Serine(Ser)Histidine(His)Glycine(Gly)Proline(Pro)Alanine(Ala)Valine(Val)Methionine(Met)Cysteine(Cys)Isoleucine(Ile)Leucine(Leu)Tryptophan(Trp)Phenylalanine(Phe)Lysine(Lys)Tyrosine(Tyr)

标准曲线StandardcurveA=10168.36c-837.08A=10534.89c-1190.86A=14337.87c-703.10A=5272.65c-138.62A=20233.51c-610.11A=12279.66c-543.07A=16664.08c-1032.16A=11945.95c-379.46A=10670.88c-899.52A=12463.77c-979.17A=10870.46c-387.83A=11972.26c-731.6729A=8342.03c-126.33A=9295.139c-402.16A=11670.98c-127.86A=12242.64c-149.40