PCR法直接筛选重组阳性克隆

塞筮匡堂２凶墨生筮堑鲞箜２期

ＰＣＲ法直接筛选重组阳性克隆

姜宏李麓芸卢光跨

［摘要］

目的建立一个简便、可靠的重组阳性克隆的筛选方法。方法应用扩增小鼠生精细胞凋亡相关基因

时使用的引物，以基因重组扩增后得到的菌落为模板，直接进行ＰＣＲ扩增。结果在筛选的阳性菌落中可扩增到与小鼠凋亡相关基因片段大小一致的阳性条带；以阳性克隆提取质粒进一步进行ＰＣＲ和酶切鉴定及序列分析，证明结果正

确。结论菌落ＰＣＲ是一种简便、快速、可靠、有效的筛选重组阳性克隆的方法。

［关键词］聚合酶链反应；菌落；重组

Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｆｏｒｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｃｌｏｎｅｓｂｙｃｏｌｏｎｙｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ

Ｊｈ２ｎｇＨｏｎｇ，ＬｉＬｕｙｕｎ，ＬＭＧｕａｎｇｘｉｕＣｅｎｔｅｒｏｆｔｈｅＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ

Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０５旃ＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＰＬＡ，Ｈｅｆｅｉ

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［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ；Ｃｏｌｏｎｙ；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ

在基因重组试验中，筛选含有插入目的基因片段阳性克隆的常用方法有快提质粒酶切法，互补，插入失活及杂交筛选法，这些方法各有其优缺点。近年来由于聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法具有简便、快速、灵敏等特点，已被应用于阳性－克隆的鉴定【１，２｜。我们在进行小鼠生精细胞凋亡相关基因的克隆过程中，对重组阳性克隆的鉴定采用直接以菌落为模板的ＰＣＲ反应（菌落ＰＣＲ），获得理想的效果。报道如下。

过互联网使用Ａｄｖａｎｃｅｄ

ＢＬＡＳＴ

２．０软件与ＧｅｎＢａｎｋ

中收录的序列进行同源性比较。

３．引物由于小鼠生精细胞凋亡相关基因片段是采用抑制消减杂交法经巢式ＰＣＲ扩增而得，故进行菌落ＰＣＲ筛选重组阳性克隆时使用的引物为巢式ＰＣＲ的内倾９引物：Ｎｅｓｔｅｄ

１：５’一ＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣ—

ＣＧＧＧＣＡＧＧＴ一３’和Ｎｅｓｔｅｄ２Ｒ：５’一ＡＧＣＧＴＧ—

ＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧＡＧＧＴ一３’。

资料与方法

１．试剂ＴａｑＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ、琼脂糖、ＰＣＲ产物纯化试剂盒、ＰｓｔＩ内切酶、ｐＵＣｍ—Ｔ载体购自上海生工生物工程公司，ｐＯｌｙＡＳｐｉ矗蹦ｍＲＮＡＫｉｔ购自ＢｉｏＬａｂｓ公司，ＰＣＲ—ＳｅｌｅｃｔＴＭ

Ｋｉｔ和ＡｄｖａｎｔａｇｅｃＤＮＡ

Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ

ｃＤＮＡＳｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ

４．小鼠生精细胞凋亡相关基因片段的连接、转化由于ＰＣＲ产物的３’末端均带有一个多聚腺苷

酸Ａ，ｐＵＣｍ—ＴＶｅｃｔｏｒ设计了胸腺嘧啶Ｔ尾，可与

ＰＣＲ产物直接连接，并转化感受态细胞。将转化后的ＪＭｌ０９细菌接种于含氨苄青霉素和ＩＰＴＧ—Ｘｇａｌ的ＬＢ琼脂培养基中，３７℃培养过夜。

５．菌落ＰＣＲ模板的制备用无菌接种环沾取阳性克隆后人２０弘ｌ无菌双蒸水中混匀待用。

６．菌落ＰＣＲ法鉴定阳性克隆反应体系包括模

板１～３弘１，引物Ｎｅｓｔｅｄ１（１０肛ｍ０１?Ｌ＿１）和Ｎｅｓｔｅｄ２Ｒ（１０

ＰｄｙＨ蚴ｓｅＭｉｘ购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公

司，Ｅ．ｏｏｌｉＪＭｌ０９细菌为本实验室传代保存。

２．目的基因小鼠生精细胞凋亡相关基因片段

由湘雅医学院生殖工程研究室应用抑制消减杂交法获

得旧Ｊ，片段大小为２００～７００ｂｐ。将扩增产物纯化后

ｔｍａｏｌ?Ｌ一１）各０．４弘ｌ，删ＴＰ（２．５

ｍｍｏｌ?Ｌ一１）０．５

连接到ｐＵＣｍ—Ｔ载体中，转化ＪＭｌ０９细菌，进行克隆化和阳性克隆的筛选，提取重组质粒ＤＮＡ后，在ＰＥ公司Ｍｏｄｅｌ３７７自动测序仪上进行测序，测序结果通

肛ｌ，Ｔａｑ酶２Ｕ，１０×ＰＣＲ反应ｂｕｆｆｅｒ１肛ｌ，补足水至反应体积１０弘ｌ。在ＰＥ９６００型ＰＣＲ扩增仪上扩增，反应条件：９４℃ｌｍｉｎ；９４℃１０

Ｓ，６８℃３０ｓ，７２℃１．５ｒａｉｎ，３０

作者单位：．２３００３１合肥解放军１０５医院生殖中心

中南大学湘骓医学院生殖工程研究室（李麓芸，卢光琢）万方数据　

个循环，１％琼脂糖凝胶电泳检测。

７．质粒ＰＣＲ鉴定阳性克隆从无菌接种环取样后的阳性克隆中挑取单个菌落，按常规碱裂解法提取小量质粒ＤＮＡ［４］，取１ｔＬｌ质粒ＤＮＡ作模板，用菌落ＰＣＲ相同的引物，进行ＰＣＲ扩增。

８．Ｐｓｔ工酶切鉴定阳性克隆取质粒ＤＮＡ

１０扯ｌ，

ＰｓｔＩ内切酶１０

ｕ，补足水至反应体积２０“ｌ，３７℃恒温

水浴过夜，进行ＰｓｔＩ内切酶酶切鉴定。

９．核苷酸序列分析所获阳性克隆菌种送上海亚生物技术公司，在ＰＥ公司Ｍｏｄｅｌ３７７自动测序仪上进行测序，测序引物为Ｔ７和Ｍ１３Ｒ。

结

果

１．ＰＣＲ法筛选阳性克隆

以菌落上的少许菌体

直接作为模板进行ＰＣＲ扩增（图１），经电泳分析发现，与从阳性菌落中提取质粒后进行ＰＣＲ所获扩增片段，大小一致，扩增片段均在小鼠生精细胞凋亡相关基因的范围内，表明这些菌落即为插入小鼠生精细胞凋亡相关基因片段的阳性克隆。

图１部分阳性克隆的菌落ＰＣＲ鉴定

注：Ｍ．ｐＵＣＭｉｘｍａｒｋｅｒ；１～１０．部分阳性克隆的菌落ＰＣＲ扩增

２．质粒ＤＮＡ酶切及测序鉴定重组阳性克隆为了进一步验证菌落ＰＣＲ结果的正确性，我们对所获阳性克隆提取质粒ＤＮＡ，并进行酶切鉴定，结果证实菌落ＰＣＲ扩增出阳性片段的阳性克隆均酶切出相同大小的基因片段（图２），对其进行测序分析，证实它们均含有小鼠生精细胞凋亡相关基因片段，而菌落ＰＣＲ未扩增出阳性片段的阳性克隆均未酶切出重组基因片段。

图２部分阳性克隆的ＰｓｔＩ酶切鉴定

注：Ｍ．ｐＵＣＭｉｘｍａｒｋｅｒ；１～９．部分阳性克隆的ＰｓｔＩ酶切图谱

万　

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讨论

鉴定重组质粒时，通常先选取阳性菌落进行培养，提取质粒ＤＮＡ后限制酶切割，再进行电泳鉴定质粒和目的基因片段，该法耗时较长，操作环节较多，每一环节要求均较高，尤其当目的基因较小时，更需要大量的质粒ＤＮＡ以保证电泳时目的基因的可测性，而且鉴定结果的特异性较差。菌落杂交筛选法可以通过在硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上原位裂解细菌菌落，再与相应的核酸探针进行杂交的方法进行筛选，该法虽可提高筛选的特异性，但操作较限制酶切法更复杂，而且需要使用同位素。

菌落ＰＣＲ是以转化菌单个克隆为模板，采用特异性引物或通用引物对目的基因进行扩增，用来鉴定和筛选阳性转化菌的技术。Ｓａｔｈｅ等倒５将含有重组质粒

的细菌经过９４℃变性１ｍｉｎ以后，用倒置显微镜观察，

发现大部分细胞破裂，释放出其ＤＮＡ，因此可将其细菌直接作为ＰＣＲ反应的模板，而不需要抽提、纯化质粒ＤＮＡ。本研究在鉴定重组阳性克隆时先行ａ互补和插入失活筛选，再行菌落ＰＣＲ，不仅提高了鉴定的效率，而且提高了鉴定的准确性。

本研究中，我们在鉴定小鼠生精细胞凋亡相关基因片段基因重组克隆时，将菌落先放人双蒸水中稀释后再作为模板进行ＰＣＲ反应，可以避免由于模板浓度过高而导致的非特异性扩增和高背景，并且不需要延

长预变性时间，可获得理想的结果。经提取质粒ＤＮＡ进行酶切和质粒ＰＣＲ双重鉴定以及测序分析，证实菌落ＰＣＲ的结果完全正确。由于这种方法直接以菌落为模板，不需要进行任何特殊处理，并可以快速、特异、有效地对大批重组克隆筛选进行筛选，适合于各种载体，值得进一步推广应用。

参考文献

１胡维，向华，周艳，等．用ＰＣＲ法直接快速筛查重组

阳性克隆．生物技术通报，１９９９；１５：３９－－４３

２生秀杰，周伟强，姜莉，等．应用以菌落为模板的聚合酶链

反应技术筛选重组阳性克隆．中华检验医学杂志，２００２；２５

（４）：２３９－－２４０

３姜宏，李麓芸，卢光臻．小鼠生精细胞凋亡相关基因的分

子克隆．生物化学与生物物理学报，２００１；３３（４）：４２１－－４２５４姜泊，张亚历，周殿元主编．分子生物学常用实验方法．北

京：人民军医出版社，１９９６：３－－４

５

ＳａｔｈｅＧＭ，Ｏ’ＢｆｉｅｎＳ，ＭｃｌａｕｇｈｌｉｎＭＭ，ｅｔａ１．Ｕｓｅｏｆｐｏｌｙ—ｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｆｏｒｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓｉｎｗｈｏｌｅｙｅａｓｔｃｅｌｌｓ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，１９９１；１９：４７７５

（２００４—０４—１９收稿）

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PCR法直接筛选重组阳性克隆

作者：

作者单位：

刊名：

英文刊名：

年，卷(期)：姜宏， 李麓芸， 卢光琇， Jiang Hong， Li Luyun， Lu Guangxiu姜宏,Jiang Hong(230031,合肥,解放军105医院生殖中心)， 李麓芸,卢光琇,Li Luyun,LuGuangxiu(中南大学湘雅医学院生殖工程研究室)安徽医学ANHUI MEDICAL JOURNAL2005,26(2)

参考文献(5条)

1.胡维;向华;周艳 用PCR法直接快速筛查重组阳性克隆[期刊论文]-生物技术通报 1999(6)

2.生秀杰;周伟强;姜莉 应用以菌落为模板的聚合酶链反应技术筛选重组阳性克隆[期刊论文]-中华检验医学杂志2002(04)

3.姜宏;李麓芸;卢光琇 小鼠生精细胞凋亡相关基因的分子克隆[期刊论文]-生物化学与生物物理学报 2001(04)

4.姜泊;张亚历;周殿元 分子生物学常用实验方法 1996

5.Sathe GM;O' Bfien S;Mclaughlin MM Use of polymerase chain reaction for rapid detection of geneinsertions in whole yeast cells[外文期刊] 1991

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