砷剂对小鼠皮肤朗格汉斯细胞数量与功能的影响_柳敏

1000CHINJDEＲMVENEＲEOL2013年10月第27卷第10期

Oct．2013，Vol．27，No．10

砷剂对小鼠皮肤朗格汉斯细胞数量与功能的影响柳敏，田晶，王阳，杨蕾芳，张佩

［摘要］目的As2O3）对小鼠皮肤朗格汉斯细胞（Langerhanscell，LC）数量及功能的影响，观察砷剂（As，以期

制备C57BL/6小鼠表皮单细胞悬液，经不同浓度As处理，探讨As外用治疗皮肤病的机理。方法

MTT法观察As对全表皮细胞数的影响，寻找适宜浓度。使用该浓度进一步处理细胞，观察As对表皮中LC的相对数量的影响。通过流式细胞仪观察As对表皮LC抗原摄取能力及成熟能力的影响。结果highAs处理48h后，全表皮细胞数量从2uM开始显著减低。2uMAs处理后LC被分成MHCⅡ，

highlowhighMHCⅡlow两个亚群，并且MHCⅡ/MHCⅡ亚群的比例呈降低趋势。进一步观察MHCⅡ细胞亚

+high显示MHCⅡ表达增强，而Langerin显著降低，差异均有统计学意义。CD80及CD86LC细胞群群，

比例显著降低，而CD86lowLC亚群显著升高。CD80+LC比率降低的同时伴随CD80的表达强度减弱，

As影响LC在皮肤中的比例。2uMAs通过影响LC表面MHCⅡ分子、CD86low的LC中CD86的平均荧光强度显著增加。MHCⅡlowLC丧失抗原摄取能力，MHCⅡhighLC的抗原摄取能力也显著降低。结论

核内Langrin分子的表达，影响LC的成熟能力及抗原摄取能力，进而影响LC相关皮肤免疫。［关键词］砷剂；朗格汉斯细胞；角质形成细胞；成熟；抗原摄取

［中图分类号］Ｒ739．5［文献标识码］A［文章编号］1001－7089（2013）10－1000－05EffectsofArsenicontheNumberandFunctionofLangerhansCellinMouseSkin

LIUMin，TIANJing，WANGYang，YANGLei-fang，ZHANGPei

（DepartmentofImmunology，LiaoningMedicalCollege，Jinzhou121001，China）

［Correspondingauthor］ZHANGPei，E-mail：jyzhangpei@http://wendang.chazidian.com

［Abstract］ObjectiveToobservetheeffectsofAs2O3（As）onthenumberandfunctionofskinLangerhanscell（LC）in

SingleepidermalcellsuspensionsordertorevealthemechanismwherebyAstreatsskindiseases.Methods

fromC57BL/6miceweretreatedwithdifferentconcentrationsofAstodetermineanappropriateconcentrationusingMTTmethod．EffectofAsonLCphagocytosisandmaturationwereassessedwithFACS．ＲesultsThenumberofcellsbecamelessafterincubationwith2uMAsfor48h．FollowingAstreatment，theratiosofMHCⅡhightoMHCⅡlowbegantodecrease．MHCⅡhighexpressedsignificantlyhigherlevelsofMHCⅡandlowerlevelsofLangerin．ThepercentageofCD80+andCD86highLCwasdecreased，butthepercentageofCD86lowLCwassignificantlyincreased．Moreover，theintensityofCD80stainingwasreduced，whereastheintensityofCD86staininginCD86lowLCwasincreased．MHCⅡlowLCpopulationlostfunctionofantigenphagocytosis，andthephagocyticfunctionofMHCⅡhighLCwasalsodecreased．Conclusion

Langrin，andLCmaturationandantigenphagocytosis.

［Keywords］Arsenic；Langerhanscell；Keratinocyte；Mature；AntigenphagocytosisAsaffectsthepercentageofLCinskin．2uMAsaffectsskinimmunitythroughaffectingtheexpressionofMHCⅡand

LC）是髓源性免朗格汉斯细胞（Langerhanscells，

［1］疫细胞之一，迁移定居至皮肤后通过自我更新来维

，LC稳态可随条件改变如皮肤炎症等，

［3］发生相应的变化。研究显示LC与多种皮肤疾病有持恒定数量

密切联系：在早期与晚期发生的银屑病之间LC动员

［4］有明显差异，与正常人相比，早期发生的银屑病中

［作者单位］辽宁医学院，辽宁锦州121001

［E-mail：jyzhangpei@163．com通讯作者］张佩，［2］单核细胞起源的LC表型和功能似乎并未有明显改［5］变。LC在异位性皮炎患者皮肤中的数量、密度有所减低，同时其形态特征和在皮肤中的分布也有改［6］LC还参与白癜风、Bowen病等疾变，接触性皮炎、［7-9］。这些数病，尽管在部分报道中的变化趋势有差异据均说明LC在众多疾病的发生发展过程中有重要作用。As）既是毒性物质又是人体中正常砷剂（Arsnic，既可以诱发肿瘤，又可以对多种疾病存在的微量元素，

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发挥治疗性生物学作用。砷剂对免疫系统有着广泛复

杂的影响，有证据表明As对皮肤中最重要的免疫细胞LC也有确切影响。As可以改变皮肤中LC相关的生

［7］

长刺激因子和炎症细胞因子的分泌。在As诱导的Bowen病中，LC数目和树突数量减少［10-11］。目前对于As临床局部外用于皮肤引起的生物学效应了解甚少。因此本课题拟研究As对皮肤LC数量及功能的影响，以期探讨As外用治疗皮肤病的机理，并借以认识多种LC异常相关皮肤病发生的机理。1

材料与方法

1.1材料4～6周龄，SPF级C57BL/6小鼠。雌性，每次实验使用3只小鼠，实验重复3次。主要试剂如CD45.2，CD207，CD80，CD86抗体购抗MHCⅡ（IAe），

Dex-自BDBioscience公司。As2O3购自Sigma公司，tranFluorescein，Dispase购自Invetrogen公司。完全培10%灭活FBS，5×105M2-养基包括ＲPMI1640，巯基

0.15%碳酸氢钠，1mMMEM丙酮酸钠，1×非必乙醇，

需氨基酸及双抗。主要仪器器材有细胞培养箱（For-mascientific），Perkin流式细胞仪BD（BDBiosciences），

Elmer2030（PerkinElmer）。主要分析软件有SPSS15.0（IBM），FlowJo7.6.5（FlowJo）。1.2

小鼠皮肤单细胞悬液制备CO2处死小鼠，电推

4～5mLNair溶解残留鼠毛，剪剪掉小鼠毛发，组织剪

450g离心5min，养48h。收集培养处理后的细胞，弃

上清。清洗后重悬细胞于200μL染色缓冲液待用。1.5

抗原摄取实验上述细胞转移至5mL流式管，加入100μL0.5mg/mLDextranFluoresceinsolution37℃

5%CO2培养箱孵育45min，设一额外同条件4℃标本

450g离心为阴性对照。3～4mL预冷1×PBS清洗，

3min弃上清，CD16/32FcＲblock液4℃重复2次。Anti-MHCⅡ，antiCD45.2避光阻断非特异染色15min。Anti-4℃避光30min。清洗2次后用流式细胞仪抗体标记，

分析。1.6

LC体外成熟实验重悬1～2×106细胞于2mLCM37℃5%CO2中培养72h。收集培养处理后的培养基，

IAe，anti-CD80，anti-细胞阻断非特异染色后经Anti-CD86抗体4℃，避光孵育30min。预冷staining缓冲液清洗2次。100μLFixation/Permeabilizationsolution重4℃避光20min，200μL1×BDPerm/Wash洗悬细胞，

0.5μLanti-Langerin抗体4℃，液清洗2次，避光孵育30min，200μL1×BDPerm/Wash洗液清洗2次，

400μL2%福尔马林固定液固定，流式细胞仪分析。1.7

统计学处理MTT结果输入统计学分析软件SPSS15.0，采用单因素方差分析，并进行Dunnettttest

比较各浓度组与对照组之间的差异；流式结果由Flow-Jo7.6分析，分析数据进一步输入GraphPadPrism5.0，采用t检验进行统计分析并绘图。以P＜0.05为差异有统计学意义。2

结果

2.1As对皮肤细胞生长的影响As处理48h后，MTT结果显示，相对于正常对照组，细胞数量从2uMDunnettt检验显示P=0.039；大于开始有显著减低，2uM浓度As处理后，P＜0.01，细胞数量进一步减低，见图1。由此，笔者在后续实验中选择有轻微生物学影响的2uM浓度继续处理细胞，观察As对LC的影响

。

获取小鼠皮肤，解剖刀刮除皮下组织，皮肤剪成约1cm

×1cm小片。将皮片放置于10mL0.25%dispase中37℃（5%CO2）孵育1h。分离表皮加入6mLCM和700μL1mg/mLDNase溶液，37℃震荡水浴锅中孵育，震荡70次/min。使用100μm孔径尼龙筛网过滤细

6

450g离心5min，胞，弃上清，计数细胞并调至2×10cells/mL备用。1.3

用CM完全培养基将上

6

述细胞悬液进一步稀释至0.5×10个/mL。As处理1，2，4，8，20uM6个浓度（0uM为不加药终浓度为0，

对照孔），各设6个复孔。培养板放至湿盒，于37℃5%CO2孵育48h，在药物作用期结束时，去除所有含有细胞的孔中的培养基。每孔中各加入200μL新鲜37℃湿润的培养基和50μLMTT。铝箔包裹培养板，

环境中温育4h。终止培养，小心弃去孔中的培养基和MTT，在所有孔中各加入200μLDMSO，振荡10min后加入甘氨酸缓冲液（每孔25μL）。立即在570nm处记录吸光值。

1.4细胞培养及As处理

将待用细胞加入12孔板，

6

每孔2×10cells用CM完全培养基将As稀释至合适

AS对皮肤细胞的影响

图1Fig．1

As对皮肤细胞生长的影响EffectofAsonLCproliferation

浓度，使终浓度为2uM，每孔终体积为2mL，并设不加药对照。将12孔板放于37℃5%CO2湿润环境中培

2.2

As对LC数量的影响2uMAs处理后LC在皮肤细胞中的相对比例。设门于FSCSSC中较为集中的主

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++

细胞团后，流式数据显示LangerinCD45.2双阳性细胞（LC）数量有轻微减低，从1.11±0.12到0.99±0.13，P=0.0071），显著降低（t=11.79，差异均具有统计学

意义。2.4

As对LC成熟能力的影响

表皮细胞在12孔

37℃，5%CO2湿润环境中培养48h后，MHC经anti-板，

anti-Langerin以及与LC成熟相关的标志抗体anti-Ⅱ，

anti-CD86抗体标记。首先选择Langerin+MHCCD80，

+

CD86Ⅱ双阳性细胞群（LC），然后进一步观察CD80，

P=0.0429），差异有统计学意义（t=4.67，见图2。

2.3As对LC中MHCⅡ及Langerin表达的影响筛

++

选LangerinCD45.2双阳性细胞，进一步观察MHC

high

MHCⅡlow两Ⅱ细胞亚群。可见LC被分成MHCⅡ，

highlow

并且MHCⅡ/MHCⅡ亚群的比例呈降低个亚群，

P=0.0040），趋势（t=15.70，见图3。进一步观察MHC

high

Ⅱ细胞亚群Langerin及MHCⅡ的表达强度，显示

LC被分为CD80－，的表达。如图4，可见按CD80表达，CD80+两个亚群；而按CD86表达，LC被分为CD86－，

CD86low和CD86high三个亚群。CD80+及

low

CD86highLC细胞群比例显著降低，而CD86

MHCⅡ表达增强（t=68.23，P=0.0002），而Langerin

LC亚群显著升高，差异均有统计学意义（t=7.69，P=0.0165）。不同的是，CD80+LC比率降低的同时伴随CD80的表达强度减弱，差异P=0.0179），有统计学意义（t=7.38，而CD86highLC的平均荧光强度没有变化，差异无P=0.1146），CD86low的统计学意义（t=2.694，

图2Fig．2

As对LC数量的影响EffectofAsonLCratio

LC中CD86的平均荧光强度显著增加，差异有P=0.0090）

。统计学意义（t=10.48，

图3Fig．3

As对LC中MHCⅡ及Langerin表达的影响EffectofAsonexpressionofMHCⅡand

Langerin

图4Fig．4

As对LC成熟能力的影响EffectofAsonLCmaturation

中国皮肤性病学杂志2013年10月第27卷第10期ChinJDermVenereol，Oct.2013，Vol.27，No.10·1003·

2.5

As培养处理后

dextran共孵育45min后，的LC，与0.25mg/mLFITC-MHCⅡ和anti-CD45.2抗体标记，经anti-选择MHC

++++

ⅡCD45.2双阳性LC，进一步分析MHCⅡ/FITC

As对LC抗原捕获能力的影响

MHCⅡlowLC几携带抗原的LC的比例。如图5可见，

high

乎丧失抗原捕获能力，而MHCⅡLC的抗原捕获能P=0.0029），力也显著降低（t=18.60，差异有统计学意义

。

图5Fig．5

As对LC抗原捕获能力的影响EffectofAsonLCphagocytosis

3讨论

CD4+T向Th2发展，起到炎症抑制作用。用抗CD86CD4+T细胞和CD8+T细抗体处理过的动物小鼠中，

并且这种对T细胞的共同刺胞产生的细胞因子减少，激不能由LC表达的CD80来补偿

［15-16］

砷剂对角质形成细胞的作用已经有非常广泛深入

的研究，低浓度As（＜1uM）对角质形成细胞有刺激增殖作用，高浓度主要表现为抑制作用。

朗格汉斯细胞来源于骨髓，为皮肤内的主要抗原呈递细胞

。LC在处理半抗原的过程中，由“静止”

“活化”状态转化为的功能状态。活化过程中LC表现

［13］

［12］

。结合本研究中

发现，笔者认为As通过降低CD80表达的数量和密度

来达到免疫抑制效果，而CD86表达的数量和密度的变化趋势相反，提示As对CD86的抑制作用相对弱于CD80，As对CD86的综合效应甚至没有减低，这些结果反而提示As对该培养系统起到免疫抑制作用。长期As接触所诱导的Bowen病皮损中LC数量显著减少，也说明As通过抑制LC免疫监视能力，而诱发肿瘤

［17］

MHCⅡ类分子、为表面MHCⅠ类分子、黏附分子、协同

CD86（又称为b7-1，b7-2）的表达增刺激分子CD80，加

［13］

。因此MHC分子及协同刺激分子在抗原递呈过

程中发挥重要作用。

MHCⅡ分子在LC中表达增强，本研究中观察到，

似乎提示As作用下的LC抗原递呈能力增强。然而，除此之外，笔者收集到更多LC免疫抑制的证据。首

MTT结果提示2uMAs对皮肤细胞的生长有抑制先，

LC的相对比例更是显著作用，在此受抑制的系统中，降低，提示LC对As更为敏感。此外，虽然在MHC的LC亚群中MHCⅡ的平均表达强度有所增加，而在整体LC群体中，其细胞数量比例显著减低，此现Ⅱ

象与国外报道一致：砷剂暴露可以减低小鼠宫颈淋巴

［7］

结中MHCⅡ（Ia+）细胞数量，说明多数细胞的免疫能力受到抑制。

LC活化成熟的能力对其发挥免疫学作用有至关重要的影响。笔者在研究中观察到协同刺激分子CD80，CD86在表达比例及强度方面均受到明显影响，根据表达强度LC分成不同的亚群，并提示As对CD86和对CD80的影响机制相异。

CD86生物学作用存在差异，文献报道CD80，在半CD80，CD86可以促使CD4+T细抗原致敏感过程中，

胞向两个不同的亚型Th1和Th2型发展。CD80诱导

CD4+T细胞向Th1发展，促进炎症的发生；CD86诱导

［14］

high

。

本实验中不排除As可以通过KC来间接影响LC

的表型。正常人LC与来自银屑病患者角质形成细胞的上清培养液共孵育48h后，拥有不规则突起的细胞

其刺激T淋巴细胞增殖的明显较正常组增多。同时，

能力也增强，提示免疫刺激增强，而As治疗难治性银

屑病所取得的疗效机制可能就是As对整个皮肤系统的免疫抑制及其对相应KC的增殖抑制

［18-20］

。

综上所述，笔者认为本研究结果提示As对皮肤中

LC有确切的免疫抑制作用，这可能解释了As诱导某些疾病的发生以及As作为治疗药物起到良好疗效的潜在免疫学机理。受限于LC难于富集，本研究未观察As处理后LC与T细胞混合培养的刺激效应，条件成熟时可以进一步观察As对LC影响的综合效应。在皮肤免疫中，真皮内DC虽然数量少，但目前的研究发现其生物学作用也很重要，在某些方面甚至占据主导地位，因此真皮DC研究极有潜力。

［参

考

文

献］

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［收稿日期］2013-04-01［修回日期］2013-06-01

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医学论文写作中常见错别字正（误）

综合征（症、证）适应证（症）症状（征状）征象（像）横膈（隔）惟一（唯）啰音（罗）荧光屏（莹）难辩（难辨）萎靡（痿靡）即便（既便）转换酶（转化）注：括号中为错误用法

症状（征状）禁忌证（症）成像（象）成分（份）纵隔（膈）辐射（幅）发热（烧）预后（愈）辩论（辨）蔓延（漫延）瓣膜（办膜）粘（zhan）音

征象（像）循证医学（症）摄像（象）部分（份）膈肌（隔）覆盖（复）骨骼（胳）血流（液）动力学辨证论治（辩）阿司匹林（斯）解剖（介剖）粘连、粘贴、粘合

特征（证）合并症（证）图像（象）年份（分）急躁（燥）幅度（辐）水肿（浮肿）卒中（中风）艾滋病（爱）传导（道）符合（附）黏（nian音）

妊高征（证）并发症（证）分裂象（像）身份（分）烦躁（燥）多普勒（谱）脉搏（博）心肌梗死（梗塞）弥漫（迷）即使（既使）亲和力（亲合）黏膜、黏液