14_3_3蛋白在心肌细胞缺氧预处理中的表达及意义_陈璿瑛

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?144?142323蛋白在心肌细胞缺氧预处理中

的表达及意义3

陈璿瑛1　彭小平2　廖章萍3　刘丹3　何明3

　　[摘要]　目的:研究142323蛋白在心肌细胞缺氧预处理中的表达及意义。方法:实验用SD新生大鼠(1～3d龄),雌雄不拘,无菌取出乳鼠心脏,经分离附着组织,胰蛋白酶消化,纯化制成心肌细胞。在培养的第4天随机分为3组:正常对照组、缺氧/复氧(A/R)组、缺氧预处理(APC)组。各组分别进行以下指标观察:①心肌细胞搏动频率;②细胞存活率(MTT法);③培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性;④透射电镜观察细胞超微结构;⑤Western

σmRNA的表达变化。:A/R组和Blotting法检测142323蛋白的表达变化。RT2PCR法检测142323蛋白η、

APC组的142323蛋白表达均上调,分别是正常对照组的(3161±0137)(5152±0149)APC组与

η分别为正正常对照组比较、A/R组与APC组比较,均P<0101。A/R组PC(2193±常对照组的(1182±0130)倍、0152)倍,P<01);,差异亦

σ(1113±有统计学意义(P<0101)。A/R组、A143

(11210118)倍、)R组与APC组比较,差异均无统计学意义(P

APC后的早期保护作用。>0105)23

　　[/;142323蛋白;142323mRNA;缺氧预适应;乳鼠

　　[]　R364.4　　[文献标志码]　A　　[文章编号]　100121439(2010)0220144204

Expressionandroleof142323proteinintheexperimental

acutemyocardialinjury

CHENXuanying　PENGXiaoping　LIAOZhangping　LIUDan　HEMing12333(1DepartmentofPharmacy,2DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospitalofNan2changUniversity,NanchangUniversity,330006,China;3DepartmentofPharmacologyofMedi2calCollegeofNanchangUniversity)

Correspondingauther:HEMing,Email:jxhm56@http://wendang.chazidian.com

　　Abstract　Objective:Toinvestigatetheexpressionof142323proteinintheacutemyocardialcellsA/Rinjury.Method:CulturedmyocardialcellsofneonatalSDratswererandomlydividedintothreegroups:controlgroup;an2oxiareoxygenation(A/R)group;anoxiapreconditioninggroup(APC).Ineachgroup,themyocardialcellsweresubjectedtoanoxia(3h)followedbyreoxygenation(1h)24hafteranoxicpreconditioningonthemodeloftheculturedmyocardialcells.Attheendofexperiment,myocardialcellsbeatingrate,cellviabilityandtheactivityofLDHincultureweremeasured.Furthermore,themorphologyorultrastructureassessmentofmyocardialcellswasobservedbyinvertedmicroscopeortransmissionelectronmicroscope,theexpressionof142323proteinwasmeas2

ησuredbywesternblottingtechniques,andtheexpressionof142323,mRNAwasmeasuredbyRT2PCR.Result:①

ItisverifiedthatcardiomyocytesafterAPCareofferedmorecapacitytotolerateA/Rdamagefromthelevelof

ησcells.②142323proteinand142323,mRNAshowedabasicexpressioninmyocardialcellsundernormalcondition,

ηmRNAwasenlargedafteranoxia2reoxygenationinjury.Conclusion:Itissuggestedthat142323proteinand142323

ηmRNAmaybeinvolvedintheprocessofprotectioninducedbyanoxiapreconditioning.142323

　　Keywords　anoxia2reoxygenation;142323protein;142323mRNA;anoxiapreconditioning;neonatalrat　　心肌缺血预适应(ischemicprecoditioning,

IPC)这一概念最早由Murry等〔1〕于1986年提出,

是指一次或几次短暂重复的心肌缺血再灌注可对

基金项目:国家重点基础研究发展计划资助课题(No:

2009CB526405)和国家自然科学基金资助课题(No:

30460048)

1南昌大学第一附属医院药剂科(南昌,330006)

2南昌大学第一附属医院心血管科

3南昌大学医学院药学系药理教研室

通信作者:何明,Email:jxhm56@http://wendang.chazidian.com3抗随后较长时间缺血再灌注所致的心肌损伤。IPC的保护作用表现为:缩小心肌梗死面积、抗缺血再灌注心律失常、改善心脏的收缩功能、改善亚细胞结构损害、改善心肌生化物质及离子异常、抗自由〔2〕基作用。142323蛋白是1967年由Moore等〔3〕发现的一种广泛存在于几乎所有生物体细胞中的酸性蛋白,在缺血、缺氧等应激状态时呈现高表达。例如,球囊扩张术后,大鼠颈动脉平滑肌细胞与心γ亚型蛋白表达上调〔4-5〕;在14232肌细胞内142323

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化自动分析仪测定LDH活性。③电镜观察〔10〕:实验结束后,各组细胞先用细胞刮刮下后,用4℃预冷的PBS清洗,215%戊二醛、1%锇酸常规固定、脱水、包埋、超薄切片、醋酸铀2枸橼酸铅双染色。用日本H2600型透射电镜观察、摄片。

1.4　Westernblotting(免疫印迹)法检测心肌细胞中142323蛋白的表达

①用预冷的lysingbuffer裂解心肌细胞,并采用Folin酚法测定蛋白浓度;②聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS2polyacrylamidegeleletrophoresis,SDS2PAGE)取含同等蛋白量的样本稀释至等体积和5×samplebuffer按4∶1,100℃水浴5,乘热样后,至硝酸纤维膜(1∶500溶TTBS中清洗膜3遍,min,移入羊抗大鼠IgG2HRP二抗反应液(二抗按1∶200溶于封闭液)中,室温平摇2h后,浸入TTBS中清洗膜3遍;④PDVF膜在ECL中反应1min后,置于X线暗盒中曝光30s～5min,显影、定影;⑤将X光胶片扫描后,在医学图形分析系统上进行分析。计算方法为:所得142323蛋白带的综合密度除以正常对照组相对应样本的综合密度。

1.5　RT2PCR(逆转录聚合酶链反应)法检测142323蛋白各亚型mRNA表达

①心肌细胞总RNA的提取〔11〕:取一平皿细胞用Trizol法提取总RNA,经BeckmanDH7400分光光度计分析RNA纯度(A260nm/A280nm)>118。②cDNA合成与基因扩增:取5总RNA逆转录(试剂盒由美国Promega公司提供,cDNA产物

η、σ模版的浓度,确定各自反应体系。总作142323

反应体系50μl,包括10×Buffer(15mMMgCl2)5.0μl,dNTP(2.0mmol)4.0μl,Tag酶2.5U,目标mRNA上、下游引物各25pmolβ,2actin上、下游

η引物各25pmol,模板(cDNA)5.0μl。反应条件:

亚型:94℃,5min、50℃,45sec、72℃,1min,30

σ亚型:94℃,5min、个循环;50℃,45s、72℃,1

min,30个循环;③PCR引物设计见表1;④取扩增产物10μl上样,1.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶染色显示后,在透射紫外光分析仪下摄影,并用激光光密度图像扫描仪扫描;⑤定量分析计算方法为:所得142323产物带与β2actin产物带的综合灰度之比,再除以正常对照组相对应样本的此2条带综合灰度之比。1.6　统计学处理

定量资料以??x±s表示,采用系统统计软件SPSS1115进行方差齐性检验、单因素方差分析(One2wayANOVA),组间比较用LSD法;定性资料用卡方检验。

η亚型蛋白反义基序的转基因小鼠,其血压虽然基3

本正常,但是对夹闭大动脉所致升高血压的代偿能力显著降低,甚至基本丧失,大部分动物死于不可抗拒的心功能衰竭〔6〕;在牛磺酸长期缺乏的大鼠心

σ亚型蛋白显著上调〔7〕。142323蛋白肌细胞,142323

在缺血、缺氧等应激状态时合成增多,说明142323蛋白可能在提高组织对损伤的反应性以及作为修复信号等方面发挥重要作用。本研究拟在乳鼠原代培养心肌细胞APC保护模型早期相(EP相)上,在确认APC模型已对急性心肌细胞缺氧/复氧(A/R)损伤产生保护作用的基础上,采用Western

σBlotting和RT2PCR技术,研究142323蛋白及η、

亚型mRNA表达的改变,以初步探讨142323蛋白及各亚型mRNA在APC保护模型EP相的作用及其意义。1　材料与方法1.1　参照〔8〕。取20只出生1～3d的SD大鼠,消毒后开胸取出心脏,用D2Hank’s液冲洗3次,剪成1mm×1mm×1mm大小组织块,加入无Ca2+、Mg2+011%胰蛋白酶溶液10ml,37℃磁力搅拌8min后,吸取消化后的上清液,加含15%胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)的MEM培养基(GIBCOBRL公司产品)4ml,在4℃下离心8min,1000r/min。再向组织中加入011%胰蛋白酶溶液10ml消化,反复多次,直到组织碎块消化和细胞分离完毕。置CO2培

)中培养2h,用差速贴壁法去除成纤维养箱(37℃

细胞。用上述培养液将细胞悬液调成细胞浓度为5×105/ml之后,接种于平皿中。培养第4天随机分组进行缺氧和再复氧实验。1.2　实验分组

分3组:①正常对照组,换复氧液置于CO2培

)3h后,再换上复氧液孵育1h;②A/R养箱(37℃

组,换缺氧液,将平皿置于95%N225%CO2持续通

)3h,再换上复氧液,以气的缺氧密闭容器中(37℃

);③95%N225%CO2进行复氧孵育1h(37℃缺氧

预适应(APC)组,换缺氧液,将平皿置于95%N22

)305%CO2持续通气的缺氧密闭容器中(37℃

min,再换上复氧液,以95%N225%CO2进行复氧

),重复3次,然后进行A/R操孵育30min(37℃

作。1.3　观察指标及方法

实验结束后进行如下指标检测:①心肌细胞存活率:采取MTT比色法〔9〕检测(设不加细胞只加孵育液的空白对照)。在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值。细胞存活率=[实验组光吸收值(A)/正常对照组A)×100%。②LDH检测:实验结束后各组分别取孵育液200μl,美国Beckman生

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η、σPCR引物序列,β表1　1423232action作为对照

正向引物(5’～3’)

β2actinη142323σ142323

AAGGATTCCTATGTGGGCAAGCCTTCGCACAGCAAGC2ATACAAGAA

反向引物

(5’～3’)

CATCTCTTGCTCGAAGTCGTGCTGCCAGAATGAGGCAGACAAAGGT

bp540277874

mRNA表达量分别为正常对照组的(1113±0118)

(1121±倍、0114倍),A/R组、APC组与正常对照

组比较,A/R组与APC组比较,差异均无统计学

η、σ亚型意义(P>0105)。各组心肌细胞142323mRNA的表达见图2

。

CTTAGCCAAAC2ATCTGAATAGCT

2　结果

2.1　A/R损伤后对各组心肌细胞的影响

2.1.1　细胞存活率　A/R组、APC组的存活率分(8319±911)%,A/R组与正别为(4118±616)%、

常对照组比较,差异有统计学意义(P<001)组与A/R组比较,义(<0101)。2.1.2　LDHA/PC组的LDH活性

(8136±分别为(22143316)IU/L、1169)IU/L,

A/R组与正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0101);APC组与A/R组比较,差异亦有统计学

意义(P<0101)。2.1.3　透射电镜观察　正常对照组心肌细胞结构保存完好,线粒体嵴排列清晰,核染色质均匀分布,细胞膜结构完整;A/R组线粒体明显肿胀,个别线粒体呈空泡状,嵴消失或变形,肌丝消失,细胞膜结构破坏,细胞核内染色质不均匀,有核边聚现象;APC组心肌细胞超微结构改变轻微,线粒体排列规则、大小均匀,嵴及内外膜清晰完整,核膜完整,较A/R组损伤明显减轻。2.2　各组心肌细胞142323蛋白的表达

142323蛋白在正常心肌细胞中有较低表达,与正常对照组比,A/R组142323蛋白条带明显增宽,颜色明显加深,表明蛋白表达明显增强;APC组较A/R组的142323蛋白条带增宽,颜色加深,表明蛋白表达上调(见图1)。经分析后发现,A/R组、APC组的A值分别为正常对照组的(3161±0137)

(5152±0149)倍,与正常对照组比较,均P<倍、

0101;APC组与A/R组比较差异亦有统计学意义(P<0101)。

3　讨论

缺血心肌保护一直是心血管领域的研究热点。自从1986年Murry等发现并提出心肌IPC保护作用现象以来,有关IPC的研究成为国际心脏学界的关心热点和研究前沿之一。142323蛋白参与许多正常生命活动的调节过程:如细胞信号转导、紧张反应、细胞凋亡和细胞周期的调控。在细胞水平进行心肌损伤与保护研究是近年国内外发展的新方向,其最大优点在于排除整体心脏、体外心脏及体外心肌片段模型中全身神经体液因素和局部不同类型细胞间的相互影响,能够较为准确地反映某些因子或因素对心肌的损伤与保护作用。原代培养心肌细胞可作为一种研究心肌损伤与保护的有用模型。

η、σ亚型mRNA的表达2.3　各组心肌细胞142323

η、σ亚型mRNA在正常心肌细胞内有142323

η亚型基础表达,A/R组、APC组心肌细胞142323

mRNA分别为正常对照组的(1182±0130)倍、(2193±0152)倍,差异均有统计学意义(P<0101);APC组与A/R组比较差异亦有统计学意义(P<

σ亚型0101)。A/R组、APC组心肌细胞142323

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亡〔13〕。研究表明,心肌缺血2再灌注损伤的一个重要特征是细胞凋亡。IPC在一定程度上可通过减少心肌细胞凋亡实现其对心肌的保护作用。因此我们推测142323蛋白可能作为一种内源性保护物质通过抑制凋亡而介导APC的早期保护效应。②介导信号传导,在信号传导方面,142323蛋白是细胞内一种重要的功能信号分子,能结合大量的具有多种功能的信号蛋白,主要包括激酶、磷酸酶和跨膜受体。PKC家族是一种二酰甘油激活的丝/苏氨酸激酶,参与许多信号途径。研究显示,142323蛋白可与PKC结合,促进PKC与21的耦联,从而〔14-15〕。因此1423③调控亚细胞η亚型定位;有资料表明,锌指蛋白A20是142323

蛋白的配体蛋白,二者结合后虽然不能使其磷酸化,但可使得其活化,并完成在细胞内的亚定位,抑

κκ制IKK与NF2B的解聚,从而抑制NF2B活性。

η亚型蛋白另外,尚有研究表明:ASK1也是142323

的配体蛋白,二者结合后通过胞浆限位作用,使

κASK1无法激活AP21,进而抑制NF2B的活化。

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度降低〔11〕等有关。但保护作用的产生是多因素共同参与的一个复杂的过程,因此必然存在其他新的内源性保护蛋白。根据Tzivion等〔12〕研究报道,142323蛋白的功能主要是通过以下几个方面来实现

的:①改变靶蛋白与其他蛋白相互作用的能力;②通过增加核的胞吐或(和)胞纳改变靶蛋白的定位(细胞质/细胞核);③作为磷酸化作用依赖的衔接

子,桥连2个靶蛋白;④改变靶蛋白内部的酶触反应活性;⑤防止靶蛋白水解和去磷酸化。本实验在原代培养的心肌细胞模型上,采用Westernblot2ting技术检测142323蛋白含量发现,14233,A/R胞(3161±01A142323蛋白表达明显增高,是正常心肌细胞的(5152±0149)倍,并显著高于A/R组(P<0101)。结果提示142323蛋白参与了心肌细胞缺氧预处理保护效应。

为进一步研究是哪一种142323蛋白亚型参与了心肌细胞缺氧预处理的保护作用,本研究采用

σ亚型mRNA含RT2PCR技术检测142323蛋白η、

η、σ亚型mRNA在正常心肌细量变化,发现142323

胞存在一定的基础表达,心肌细胞经过A/R损伤后,mRNA表达上调。提示这2种亚型在维持心肌细胞正常功能有重要意义。A/R组、APC组心

η亚型mRNA与正常对照组相比,条肌细胞142323

η亚型mR2带明显增宽,颜色明显加深,示142323

η亚型NA表达明显上调。APC组心肌细胞142323mRNA表达量较A/R组显著上调,二者间差异有

统计学意义(P<0101),表明可能参与心肌细胞APC后的早期保护作用。

本研究还检测了上述心肌细胞经历A/R后的LDH活性、心肌细胞存活率和细胞超微结构,APC

η亚型mRNA表达心肌细胞经历A/R后,142323

增加,LDH活性较A/R组显著降低,细胞存活率明显升高,超微结构损伤改变减轻。

142323蛋白介导心肌细胞APC早期保护作用

的可能机制:①抑制细胞凋亡,细胞凋亡是受到高度调节的一种生理性细胞死亡过程,是细胞在基因调控下采取的自杀行为。142323蛋白是磷酸丝氨酸结合蛋白,是细胞内一个重要的抗凋亡因子,能与Bcl22蛋白家族中的一个促细胞凋亡成员Bad以磷酸丝氨酸依赖性的方式结合,阻止Bad与Bcl2xl或Bcl22的相互作用从而抑制Bad所诱导的细胞凋

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(收稿日期:2009207213)

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有关心血管病常见外文期刊刊名及其缩写(二)

AmJPhysiolHeartCircPhysiol　　AmericanJournalofPhysiology.HeartandCirculatoryPhysiology

(Bethesda)美国生理学杂志3心脏与循环生理学AnnCardiolAngeiol(Paris)　　AnnalesdeCardiologieetdAngeiologie(Paris)心脏病学与血管学纪事ApplCardiol　　AppiedCardiology(LosAngeles)应用心脏病学ArchChirToracCardiovasc　　ArchiviodiChirurgiaToracicaeCardiovascolare(Rome)胸外科与心血管

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