荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞分离培养及冷冻保存方法研究

黑龙江畜牧兽医#2006年第5期

实 验 研 究

9

荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞分离

培养及冷冻保存方法研究

王 亮

1,3,4

,刘婷婷,彭 涛,朱 海,汪汉卿,曹 旭

2221*3*

(1.中国科学院兰州化学物理研究所甘肃省天然药物重点实验室,甘肃兰州730000;2.新疆金牛生物股份有限公司,新疆乌鲁木齐830026;3.中国科学院新疆理化技术研究所,

新疆乌鲁木齐830011;4.中国科学院北京研究生院,北京100039)中图分类号:S832.91

+

文献标识码:A文章编号:10047034(2006)05000904

关键词:荷斯坦奶牛;成纤维细胞;体外培养;冷冻保存;活细胞率;细胞贴壁率

摘 要:试验对荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞的分离、体外培养及5种冷冻保存方法进行了研究。结果表明:用DMEM/F12+20%胎牛血清+100IU/mL双抗的完全培养液进行组织块培养,能获得良好的荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞原代培养物;成纤维细胞混合培养物经TrypsinEDTA(0.25%Trypsin,1mmol/LEDTA.4Na)消化所收集到的细胞主要为成纤维细胞,经2~3代传代,可得到纯化的荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞。纯化培养的成纤维细胞在冷冻保护剂和血清成分相同的条件下,选用5种不同的冷冻保存方法进行冷冻保存,其中使用70%细胞悬液+20%胎牛血清+10%DMSO的冷冻保存悬液,先在4!预冷平衡0.5h,接着在液氮罐口的气态氮中悬挂4h,然后沉入液氮的方法冻存的细胞,解冻后,经台盼蓝染色后进行细胞活力分析,活细胞率为86.68%;培养48h后细胞贴壁率为86.40%,明显高于其他几种方法。 体细胞的体外培养是动物克隆中的重要一环。但由于哺乳动物体细胞在体外的生存期一般不超过1年,而且还可能因频繁传代而增加染色体的变异机率,因此在常规培养条件下,细胞很难无限期保持原细胞的质量。但若采取适当的方法,将细胞在超低温条件下保存,即可使其生命力固定在某一阶段而不衰

[1]

老死亡,对动物克隆研究具有非常重要的价值。成纤维细胞具有较强的分裂增殖能力,适应性强且性状稳定,是研究动物克隆最常用的细胞类型。目前,国内对成纤维细胞超低温冷冻保存有较多的研究,对使用不同的冷冻保护剂和血清浓度的效果进行了大量的比较分析,一般认为10%DMSO和20%的血清

[13]

浓度效果较好并被普遍使用,但是在10%DMSO和20%的血清浓度条件下,不同的预冷温度和不同的预冷平衡时间对复苏后细胞活力的影响还未见报道。试验通过对荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞的纯化培养,建立了荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞系;并

收稿日期:20050805

基金项目:国家自然科学基金项目(30471242);中科院 百人计划 2002年第1期

作者简介:王 亮(1966-),男,副研究员,博士研究生.

通讯作者:汪汉卿(1935-),男,研究员,本科,博士研究生导师;(,,.

以纯化后的牛耳组织成纤维细胞为材料,使用5种不同冷冻保存方法冻存细胞,确定了一种比较理想的荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞冷冻保存方法。1 材料与方法1.1 材料

荷斯坦奶牛耳组织块,取自新疆金牛生物股份有

#

限公司第一牛场年产牛奶20t的99荷斯坦奶牛。

DMEM/F12(Gibco),胎牛血清(Gibco),台盼蓝(上海申工),Trypsin-EDTA(0.25%Trypsin,1mmol/LEDTA.4Na)(Gibco),生理盐水(上海申工),DMSO(Gibco),双抗(P/S,Gibco),1.8mL离心管(Eppendorf),25mL细胞培养瓶(Fisher),24孔培养板(Fisher),1.8mL冻存管(Corning),血球细胞计数器(上海申工)。1.2 方法1.2.1 荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞组织块培养

#

将99荷斯坦奶牛耳组织取样处剃毛,消毒,无菌取耳部组织块2~3cm,将组织块置于含300IU/mL双抗的DMEM/F12基本培养液中,4h内带回实验室。

在无菌操作台上,把组织块用2%的碘酊消毒2~3min,然后用75%的酒精消毒2~3min,再用含200IU/mL双抗的生理盐水洗涤3~4次后,除去皮,3

10

3

究实 验 研

HeilongjiangAnimalScience

andVeterinaryMedicine

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基本培养液中,用眼科剪剪成1~3mm的组织块并置于25mL培养瓶中,然后在38!条件下,用1mL0.25%Trypsin消化40min。40min后,加入3mL完全培养液(DMEM/F12+20%胎牛血清+100IU/mL双抗)终止消化,并将培养瓶直接放入38!,5%CO2,饱和湿度的培养箱中培养。细胞培养3~5d后,观察组织块周围是否游离出成纤维细胞,并更换1/3的完全培养液,然后继续培养,此后每3~4d更换1次完全培养液。当细胞贴壁生长铺满瓶底时,用

[4]

Trypsin-EDTA消化传代培养。1.2.2 成纤维细胞的分离和纯化培养 将原代培养的荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞混合物用Trypsin-EDTA消化传代。在25mL组织培养瓶中,每瓶加入300~400 LTrypsinEDTA,以刚好覆盖瓶底为佳,消化3~4min。用移液枪吹打和收集对EDTA白酶的敏感性强而且最先收缩浮起的成纤维细胞,1000r/min离心5min。洗涤和收集细胞后,置入完全培养液中,于38!,5%CO2,饱和湿度的培养箱中传代培养。经过2~3代纯化培养,既可得到纯化的荷斯坦奶牛耳部成纤维细胞。1.2.3 纯化培养后的成纤维细胞冷冻保存 当纯化后传代培养的成纤维细胞贴壁生长达80%~90%,倒去培养液,用生理盐水清洗1~2次,每个25mL组织培养瓶加入400 LTrypsinEDTA,消化3~5min,在显微镜下观察细胞的收缩情况。用完全培养液终止消化,再用移液枪将细胞轻轻吹打下来,1000r/min离心5min,弃上清液后并收集细胞,重悬于完全培养液。经过2次离心和收集细胞,将得到的细胞用细胞悬液、胎牛血清、DMSO以7︰2︰1的比例配制成细胞冷冻保存悬液,加入到1.8mL冻存管中,标记上动物的名称、性别、年龄、冻存编号、冻存日期等,然后将冻存管分类冻存。几种不同的冻存方法:方法一,样品先于4!预冷平衡6h,接着在液氮罐口的气态氮中悬挂16h,然后沉入液氮;方法二,样品依次在4!4h,4!2h和20!16h进行预冷平衡,后沉入液氮;方法三,样品先在4!预冷平衡0.5h,接着在液氮罐口的气态氮中悬挂4h,然后沉入液氮;方法四,样品依次在4!0.5h,20!1h,70!到80!预冷平衡48h,然后沉入液氮;方法五,将样品不经过预冷平衡直接沉入液氮。1.2.4 冷冻保存的荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞的解冻和复苏培养 样品在液氮中冷冻保存3个月后,从5种方法保存的荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞中,每种方法各取3管,快速置入38!水浴锅中解冻,不停的晃动小管(2~4min),待冻存管内冻存物融化后,按1︰2的比例迅速加入完全培养液,1000r/min离心5min,弃上清液。将细胞重悬于完全培养液中。从每种方法融化好的3管细胞中,各取出9 L的细胞悬液,用1 L0.4%台盼蓝染色,用血细胞计数器计数死亡细胞和总细胞数,统计细胞存活率,计算3管总的增均值。将统计细胞存活率后的每

5

管其余细胞调整细胞接种浓度为1 10个/mL,接种到25mL培养瓶,每瓶接种3mL细胞悬液,于38!、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养,48h后,吸除培养液,用生理盐水清洗1~2次,消化已贴壁细胞并计数,计算3瓶总的平均贴壁率。1.2.5 荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞生长曲线的绘制 选取1管最佳冷冻保存方法保存的细胞,将细胞

4

解冻和复苏后,以4 10个/mL的密度接种于1个24孔培养板,每孔加入0.4mL完全培养液,置于38!,5%CO2,饱和湿度的培养箱中培养。每天同一时间用TrypsinEDTA随机消化3孔细胞,用血球计数板进行计数,连续进行8d,取其平均数绘制荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞生长曲线。2 结果与讨论2.1 荷斯坦奶牛耳组织块培养与成纤维细胞的分离和纯化

以完全培养液进行组织块培养,能获得良好的荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞原代培养物。组织块贴壁后5~10d便可见大量成纤维细胞在组织块周围生长。由组织块培养而来的成纤维细胞通常混有一些上皮细胞,由于成纤维细胞和上皮细胞对EDTA胰蛋白酶的消化作用具有不同的敏感性,在用EDTA胰蛋白酶消化进行传代培养的过程中,成纤维细胞较上皮细胞先收缩、变圆和浮起,因此经过1~2代的传代培养,既可得到纯化的荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞。2.2 冷冻保存的荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞的解冻和复苏培养

液氮罐冷冻保存3个月后,从5种方法保存的荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞中,每种方法各取3管,解冻和复苏后取平均数统计细胞存活率,结果见表1。统计细胞存活率后的其余细胞调整细胞接种浓度

5

为1 10个/mL,接种于25mL的培养瓶中进行培

表1 不同冷冻保存方法解冻复苏后细胞存活率的比较

检测项目

冻存后细胞总数/( 105个%mL-1)1&台盼蓝染液着色细胞/( 105个%mL-1)

存活率/%

方法一6.141.9268.70

方法二7.222.7661.80

方法三7.040.9486.60

方法四6.051.1880.50

方法五6.825.5918.00

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养,并详细观察和分析记录培养48h后的细胞贴壁情况,结果见表2。

表2 不同冷冻保存方法细胞复苏培养48h细胞贴壁率 %

解冻第1管第2管第3管平均贴壁率

方法一63.252.458.858.1

方法二48.653.251.251.0

方法三86.385.487.486.4

方法四80.383.882.182.1

方法五25.730.116.524.1

从表1结果可以看出,方法三和方法四细胞存活率最高,和其他方法相比差异非常显著。表2结果表明,方法三和方法四的细胞贴壁率最好,分别为86.4%和82.1%,与某些学者用其他冷冻保存方法所得到的最佳结果基本一致。T检验分析结果显示,方法三和方法一、方法二、方法五的效果差异极其显著(P<0.01);方法三和方法四效果差异不明显(P>0.05),但方法三在冷冻保存操作上较方法四简便。2.3 荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞的生长曲线

从用方法三冷冻保存的荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞中取1管,进行解冻和复苏,调整细胞接种浓

4

度为4 10个/mL,接种24孔培养板,每孔0.4mL。每天定时用Trypsin-EDTA随机消化、收集3孔成纤维细胞,用血球计数板计数,取其平均数,连续计数8d,结果见表3。以培养天数为横坐标,细胞总数为纵坐标,绘制荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞生长曲线,见1图。图1显示,培养的细胞具有正常的分裂增殖特性,说明细胞冷冻保存方法正确,生长条件适合。由图1可以看出,1~2天为荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞培养的滞留期,之后为对数生长期,第7~8天为平台期。

表3 荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞总数

时间细胞数

1天1.41

2天1.67

3天2.54

4天3.45

5天5.24

6天5.87

104个

7天6.01

8天5.7

7

是除去残留的原培养液中的血清,增强Trypsin-ED

TA的作用。Trypsin-EDTA的用量以刚好使瓶底部细胞浸润为佳。当细胞收缩变圆时,迅速加入含血清的完全培养液终止消化,轻轻吹打,使细胞脱离瓶[4]壁。

试验中发现,用TrypsinEDTA消化细胞时,细胞收缩、脱离瓶壁只需要2~4min即可完成,而仅用Trypsin消化则需5~10min左右。试验中选用Tryp sinEDTA消化细胞,节约了试验时间,同时又能使成纤维细胞和上皮细胞得到极好分离,使试验达到了完全分离和纯化培养成纤维细胞的目的。

哺乳动物细胞冷冻保存方法中,普遍采用DMSO作为冷冻保护剂。选择冷冻剂及冷冻方法一般着重考虑是否有利于细胞在最短时间里脱水,减少细胞内大

[45]

冰晶的形成。因此,试验中选择DMSO作为冷冻保

.5h的预护剂,在冷冻保存程序上,先在4!进行0

冷平衡,接着在液氮罐口的气态氮中悬挂4h,让细胞内的水分有足够的时间外渗,但又不完全脱干,减少形成大冰晶机率,降低了在冻存时大冰晶对细胞的损伤,使细胞能在液氮中长期储存。试验结果中,使用方法四与方法三冻存的细胞解冻后,细胞的存活率基本一致,但方法三在冷冻保存操作上较方法四简便。

目前,人们普遍认为液氮保存是细胞长期冻存的最为安全的方法,解冻时要遵循快融的原则。所以,选择38!的恒温水浴锅来解冻,时间一般控制在3~5min,让冻存管内细胞快速度过5!的冰晶形成期,

[5]

减少冰晶对细胞膜和细胞器的损害。但是在解冻时人为的因素对结果的影响很大,故有待于将这一操作过程程序化。

从试验的结果来看,在冷冻保护剂和血清浓度一样的条件下,不同的预冷温度和不同的预冷平衡时间对复苏后细胞活力的影响是非常大的,而使细胞快速度过冰晶形成期是冻存细胞成功的关键所在。另一个要注意的问题是以往的经典冻存方法遵循慢冻快融的原则,但是却忽略了二甲基亚砜在常温下对细胞的毒性影响。此试验采取了将DMSO提前4!预冷,降低二甲基亚砜对细胞的毒性损害,取得了较好的效果。

参考文献:

[1] 关伟军,马月辉,丁鸿,等.小尾寒羊耳组织成纤维细胞系的建立

与生物学特性研究[J].畜牧兽医学报,2005,36(5):511516.[2] 王新庄,张琦.蓝白花肉牛皮肤成纤维细胞分离培养及冷冻保存

的研究[J].AnimalBulletin,2004(9):1.

[3] WANGChao.Goatfetalfibroblastsfrozenandinvitroculture[J].西

北农林科技大学学报:自然科学版,2004,32:4.

[4] 任芳丽,李煜,张涌.牛成纤维细胞体外培养与冻存[J].黄牛杂

志,2002,28(1):810.

[5] 薛庆善.体外培养的原理与技术[M].北京:科学出版社,2001.

图1 荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞生长曲线

3 讨论

荷斯坦奶牛耳组织块培养与成纤维细胞的分离和纯化时,一般当培养的成纤维细胞80%~90%汇合后,弃去旧的培养液。用生理盐水清洗2次,其目的

12

究实 验 研

HeilongjiangAnimalScience

andVeterinaryMedicine

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家兔睾丸间质细胞的分离纯化及原代培养

杨智青,李青旺

1

1,2*

,丁海荣,于永生,韩增胜,杨 海

1311

(1.西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;2.燕山大学环境与化学工程学院生物工程系,河北

秦皇岛066004;3.江苏农业科学院畜牧所,江苏南京210014)

中图分类号:S829.1

文献标识码:A

文章编号:10047034(2006)05001203

关键词:兔;睾丸间质细胞;分离纯化;原代培养

摘 要:为了研究家兔睾丸间质细胞(Leydigcel,lLC)的分离纯化程序及体外生长特点,试验采用4种不同消化程序对家兔睾丸组织进行消化,percoll梯度分离出兔LC,并进行体外培养。结果表明:经4!保存和34!孵育,0.5mg/mL(型胶原酶消化40min获得的细胞数最多,经percoll梯度分离的细胞纯度达92%;34!、5%CO2条件下细胞生长良好,呈现梭形和不规则形2种形状。 睾丸间质细胞(interstitialcell)又称Leydig细胞,分布于生精小管之间的疏松结缔组织中,其主要功能是分

[1]

泌睾酮。目前,对大鼠睾丸间质细胞研究的比较成熟,多数是对睾丸组织进行胶原酶或胰蛋白酶处理,通

[4]

过尼龙网过滤或percoll梯度分离来分离细胞,而对家兔则鲜有报道。试验用4种消化程序对成年兔睾丸间质细胞进行分离培养研究,以期获得高纯度的兔睾丸间质细胞,探讨其体外培养条件和生长特点。1 材料与方法1.1 试验动物

健康新西兰成年公兔12只,生殖系统发育良好,

收稿日期:20050811

基金项目:转基因动物生产基因工程药物研究(D08)作者简介:杨智青(1980),男,硕士研究生.

通讯作者:李青旺(1956),男,教授,博士,博士研究生导师.

由燕山大学实验动物中心提供。1.2 主要试剂

胶原酶((Invitrogen),大豆胰蛋白酶抑制剂(Roche),DMEM/F12(Gibco),胎牛血清(武汉三利),percoll(北京耀北生物技术有限公司),辅酶(、牛血清白蛋白和四唑氮蓝(Genview),孕烯醇酮(Sigma)。1.3 方法1.3.1 组织预处理及试验设计 用速眠灵将兔子麻醉,无菌取出睾丸,彻底剪除附睾,置于盛有34!PBS(含双抗)的烧杯中浸泡,转入无菌平皿中用冲洗液(DMEM/F12+0.1%牛血清白蛋白+25mg/L大豆胰蛋白酶抑制剂+1.0mg/mL胶原酶()洗去睾丸表面的血渍和油渍,用尖钳剥去白膜,抽出毛细血管,暴露曲精细管,用尖镊轻拉细管使其松散。

将处理后的睾丸分成4组,每组4个重复,进行

IsolationandpurecultureofHolsteinmilkcowearfibroblasts

andresearchoncryopreservationmethods

WANGLiang

1,3,4

,LIUTingting,PENGTao,ZHUHai,WANGHan

222

qing,CAOXu

1*3*

(1.KeyLaboratoryforNatureMedicineofGansuProvince,LanzhouInstituteofChemicalPhysics,ChineseAcademyofSciences,Lanzhou730000,China;2.XinjiangGoldcattleBio.Inc.,Economic&TechnologyDevelopmentZone,Urumqi830026,China;3.XinjiangInstituteofPhysicsandChemistry,ChineseAcademyofSciences,Urumqi830011,China;

4.GraduateSchooloftheChineseAcademyofSciences,Beijing100039,China)

Keywords:Holsteinmilkcow;fibroblast;invitroculture;cryopreservation;livingcellrate;adherencerate

Abstract:ThroughisolationandpurecultureofHolsteinmilkcowearfibroblastsandanalysesresearchonseveralcryopreservationmethodsinthisstuding,theresultsshowthesatisfactoryprimarycultureofHolsteinmilkcowearfibroblastshadbeenobtainedbysmalltissuecubesculturewithcompletemedium(DMEM/F12+20%FCS+100IU/mL(P/S).MostfibroblastscouldbecollectedinthedigestionofprimaryfibroblastmassculturesbyTrypsin

EDTA

(0.25%Trypsin,1mMEDTA.4Na),through2to3subculturesthepurecultureofHolsteinmilkcowearfibroblastscouldbeimplemented.Onthecondi tionsofthesamecryoprotectantandFCSconcentrationHolsteinmilkcowearfibroblastswerecryopreservatedinfivecryopreservationmethods,throughthecontrastandanalysesofcellvigorafterfivemonthscryopreservation,method3(70%cellsuspension+20%FBS+10%DMSO;cryopreservationproce dure:Firstfibroblastswerepre-cooledandbalancedforhalfhourat4!,andsecondhangedingaseousnitrogeninclosetothemouthofnitrogencanisterfor4hours,andfinallysunkintoliquidnitrogen.)wasthebestcryopreservationmethod,itcouldmaintain84.8%oflivingrateaftercellswererevivedandstainedbyTrypanBlueand85.4%ofadherencerateaftercellswererevivedandculturedfor48hours.

(009)