高水平耐环丙沙星淋病奈瑟菌gyrA和parC基因突变研究

中华检验医学杂志!##"年%#月第!,卷第%#期;:*/0WG1X?UY，Z3P4XU(!##"，[4&!,，=42%#?%#$+?

?病原检测和药敏试验?

高水平耐环丙沙星淋病奈瑟菌67(8和91(:基因突变研究

路荣忠;于红

;;国外对以环丙沙星为代表的喹诺酮类药物的耐药菌株研究发现，淋病奈瑟菌（淋菌）除了在低水平耐药株的基因突变位点较为稳定外，在不同国家和地区，高水平耐药株突%2"%株淋菌对环丙沙星的?@:结果："%株淋菌有F株（%%2+FJ）敏感（?@:T%2#"6A5&），其余均耐药，其中?@:为%2#"6A5&的%"株，>2#"6A5&的%F株，,2#"6A5&的%#变位点和突变方式差异巨大，研究各个地区的耐药基因突变情况，可以设计针对本地区的耐药基因探针和采用其他方法，对本地区耐药菌株作出快速诊断。而我国在这方面的研究特别是从基因水平上的研究较少。因此针对环丙沙星原始靶位是细菌的<=8螺旋酶和拓扑异构酶!，我们从编码两种酶的67(8、91(:基因变异着手，研究高水平耐环丙沙星淋菌的耐药机理。

一、材料和方法

%2标本来源：淋菌临床分离株"%株，全部来源于!##$—!##>年山东侨联医院和淄博市中心医院皮肤性病门诊就诊男性病人。选取?@:.!>2#"6A5&所有菌株共$#株。

!2主要仪器、试剂及来源：BC!>##基因扩增仪：美国BC公司；D1E酶、模板<=8提取液均购自上海复华生物医学工程有限公司。

$2试验方法：（%）细菌培养和鉴定依据卫生部医政司编写的《临床检验操作规程》，以野生型淋菌8D::$%>!F标准菌株做质控。（!）?@:测定：采用=::GH推荐的I:培养基加%J生长补充剂，采用琼脂平板稀释法及其药敏试验解释标准，测定?@:K#。质控菌株是淋菌8D::>K!!F。（$）引物设计：参照有关文献方法。67(8基因：上下游引物分别是"LM%F#

:II:I:ID8:DID8:I:I8DI:8

%,!

M$L和"LM>$,

88DID:

DI::8I:8DDD:8DIDI8I8>%$M$L。针对91(:基因，上下游引物分别为"LM%FF8DI:I:I8D8DIIIDDDI8:%,"M$L和"LM>!#II8:88:8I:88DD::I:88>#%

M$L。扩增产物包括抗喹诺酮药物决定区（NO<O）的全部氨基酸序列。（>）扩增方法：反应混合物包括!""&D1E聚合酶缓冲液，#2""&引物（!"954&A"&），!2#"&>种碱基（%#554&AG），#2!"&D1E酶（!"954&A"&），!2""&D(/P40QM%##（!56A5&），!2#"&<=8模板。反应条件：K$R$#.，"!RF#.和+!RF#.，共$"个循环。（"）引物合成和扩增产物序列分析均由上海博亚生物技术公司完成，使用8S@BO@H?生物分析工具。

二、结果

作者单位：!""#$%淄博，山东侨联医院检验科青岛大学医学院在读研究生（路荣忠）；青岛大学医学院微生物教研室（于红）

通讯作者：路荣忠，电子信箱：&’()*+,,,-./012345

株，%F2#"6A5&的$株，$!"6A5&的%株。

!2淋菌耐药菌株67(8和91(:基因序列分析结果：对环丙沙星高度耐药（?@:.!>2#"6A5&）的$#株淋菌普遍发生67(8和91(:基因变异，且均在67(8基因的K%位和K"位密码子发生了双重突变，分别是HU(MK%"B*U（!,株，?@:在>2#V$!2#"6A5&之间）和D7(（!株，?@:均为,2#"6A5&），8.9MK""I&7（!,株，?@:在>2#V$!2#"6A5&之间）、8&1（"株，?@:在>2#V%F2#"6A5&之间）和8.0（!株，?@:均为,2#"6A5&），在91(:基因的突变情况较为复杂，本研究发现在第,F、,+、,,、K%位均有可能突变或同时发生!重或$重突变，突变方式分别是8.9M,F"8.0（!>株）、HU(M,+"8.0（$株）、HU(M,,"B(4（$株）、I&’MK%"G7.（%株），GU’M%$%发生点突变（%,株）：:"I。

三、讨论

针对喹诺酮类药物的原始靶位<=8回旋酶8亚单位67(8基因和拓扑异构酶!:亚单位91(:基因，多位学者研究表明，67(8基因多在+"、K%、K"发生突变；而91(:基因则在,"、,F、,+、,,、K%、%%F位点发生突变。一般认为对于耐喹诺酮类淋菌，I7(8基因发生突变是最基本的和最重要的，91(:突变参与高水平的喹诺酮耐药性。本研究结果发现67(8基因均在HU(MK%和8.9MK"发生基因编码氨基酸替代，突变位点与多数报道相同，但其替代方式有差别。在91(:基因，分别在8.9M,F"8.0、HU(M,+"8.0、HU(M,,"B(4、I&’MK%"G7.发生基因突变，

GU’M%$%发生点突变：:"I，与国外报道也有差异。表明各个国家和地区确实有不同的耐药基因变异情况。

淋菌产生耐药，是一个复杂的受多种因素影响的过程。直到近几年，仍有耐药性较低的国家和地区，对于不同的药物，会产生不同的基因突变；在不同国家、不同地区即使对于同一种药物，也会产生不同的基因突变；在同一地区，同一种药物，也与使用药物的量和次数有关。研究不同地区临床淋菌分离株耐药情况，发现当地流行株特定的突变模式，可进一步明确其耐药机制，对临床药物的选择和新一类抗生素的开发，无疑具有重要现实意义。

（收稿日期：!##>M%#M!!）

（本文编辑：毛家都）