芍药种子cDNA-AFLP体系的建立

园艺学报，2015，42 (3)：576–584.

Acta Horticulturae Sinica 576 doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0699；http：//www. ahs. ac. cn 芍药种子cDNA-AFLP体系的建立

孙晓梅1,*，杨盼盼1，陆秀君1，周文强2，王 丹2，杨宏光1

（1沈阳农业大学林学院，沈阳 110866；2沈阳市植物园，沈阳 110163）

摘 要：以芍药品种‘粉玉奴’与‘粉中楼’的杂交种子为试材，通过对影响cDNA-AFLP反应的重

要因素进行优化，建立了适合于芍药种子的cDNA-AFLP分析体系，并对打破上胚轴与下胚轴休眠前后的

种子基因表达差异进行了初步分析。结果表明：使用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒提取的RNA

较完整；cDNA利用EcoRⅠ和MseⅠ进行双酶切37 ℃ 4 h，65 ℃ 20 min，酶切充分；连接产物稀释10

倍用于预扩增；预扩增产物稀释10倍，取5 μL作为选择性扩增的模板，得到了较为清晰可辨的

cDNA-AFLP谱带；打破下胚轴休眠前后约有3 700条差异条带，打破上胚轴休眠前后约有1 600条差异

条带。

关键词：芍药；种子；休眠；cDNA-AFLP

中图分类号：S 682.1+2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）03-0576-09

Establishment of cDNA-AFLP System of Paeonia lactiflora Seed

SUN Xiao-mei1,*，YANG Pan-pan1，LU Xiu-jun1，ZHOU Wen-qiang2，WANG Dan2，and YANG Hong-guang1

（1College of Forestry，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China；2Shenyang Botanical Garden，Shenyang 110163，China）

Abstract：The research established a cDNA-AFLP analysis system which suited Paeonia lactiflora seed by using hybrid seeds of P‘.Fenyunu’and P‘.Fenzhonglou’as materials and optimizing the important factors which affect the reaction of cDNA-AFLP. In addition，we made a preliminary analysis on the expression difference of gene under the conditions of before and after breaking epicotyl and hypocotyl dormancy. The results indicated that total RNA was isolated from Paeonia lactiflora seeds using the RNAprep Pure Plant Kit according to the manufacturer’s instruction. Doubled-stranded cDNA was digested completely with EcoRⅠand MseⅠat 37 ℃ for 4 h and at 65 ℃ for 20 min. The ligated products should be diluted 10 times with sterilized distilled water for the pre-amplification. Then relatively clear and differentiable bands were obtained after the pre-amplified products were diluted 10 times，and 5 μL were taken as a template for selective amplification. About 3 700 differential bands were visualized between before and after breaking hypocotyl dormancy and about 1 600 differential bands were visualized between before and after breaking epicotyl dormancy.

Key words：Paeonia lactiflora；seed；dormancy；cDNA-AFLP

收稿日期：2014–11–24；修回日期：2015–02–09

基金项目：国家自然科学基金项目（31240028，31470696）

* E-mail：xiaomei7280@126. com

孙晓梅，杨盼盼，陆秀君，周文强，王 丹，杨宏光.

芍药种子cDNA-AFLP体系的建立.

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基于cDNA的扩增片段长度多态性指纹图谱（cDNA-based amplified fragment length polymorphism fingerprinting，cDNA-AFLP）是Bachem等（1996）在AFLP技术的基础上发明的一种用于研究基因表达差异的RNA指纹分析技术。该技术无需预先知道序列信息，具有假阳性低、重复性好、可靠性高、所需设备简单、检测基因多、模板用量少以及能够检测较低浓度的mRNA表达等优点（Money et al.，1996），是目前筛选差异表达基因最有效的方法之一，在文心兰（龚茂江 等，2011）、菊花（Huang et al.，2012）、海棠（李志红 等，2008）等观赏植物的差异研究中得到了广泛应用。但以种子为材料的cDNA-AFLP研究相对较少（李驰 等，2007；Lang et al.，2014），而关于种子休眠与萌发分子机制的研究也鲜有报道（de Diego et al.，2006）。

芍药（Paeonia lactiflora）的种子具有双重休眠的特性，主要表现为秋季降温时打破下胚轴休眠，长出胚根；冬季低温打破上胚轴休眠，来年春季升温后胚芽萌发出土（李嘉珏，1999）。自然条件下芍药种子从播种到出苗需要6 ~ 7个月的时间，生长周期长，给人工栽培生产和种子检验带来很大的困难。探讨这种特殊的双重休眠机理，对于缩短芍药育种周期，提高育种效率及解决促成栽培难题具有重要意义。

本试验中通过优化反应体系及反应条件，建立了适合于芍药种子的cDNA-AFLP反应体系，为分析芍药种子打破上、下胚轴休眠前后基因的差异表达提供技术支持，以期为进一步分离、定位、克隆芍药种子休眠基因，揭示芍药种子休眠与萌发的分子机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

芍药（Paeonia lactiflora）种子于2012年8月下旬收获自沈阳农业大学植物园，其母本为芍药品种‘粉玉奴’，父本为芍药品种‘粉中楼’。以未经处理的休眠种子（A），经15 ℃沙藏层积后露白的种子（B）和根长达到3 ~ 4 cm的种子（C），以及根长达3 ~ 4 cm后又经4 ℃层积28 d的种子

（D）为试材。取A和B进行打破下胚轴休眠前后基因表达差异分析，取C和D进行打破上胚轴休眠前后差异分析。选取的芍药种子在超净工作台上去除种皮，切成薄片，用锡纸包裹后迅速投入液氮中速冻，于–80 ℃冰箱中保存备用。

RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒（目录号：DP432）、T4 DNA Ligase和Taq DNA Polymerase购自北京TIANGEN公司；cDNA双链合成试剂盒（M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit）购自大连宝生物工程有限公司；EcoRⅠ和MseⅠ购自Fermentes；其余试剂均为国产分析纯。

试验中所需接头和引物（表1）由北京赛百盛基因技术有限公司合成，其中AP代表接头，E00和M00为预扩增的引物；E-NN和M-NN（NN表示两个任意碱基）为选择性扩增的引物。

表1 cDNA-AFLP接头和引物序列

Table 1 The sequences of cDNA-AFLP adapters and primers

名称

Name EcoRⅠ接头及引物序列 The sequences of EcoRⅠadapters and primers 名称

Name MseⅠ接头及引物序列 The sequences of MseⅠadapters and primers

AP1 5′-CTCGTAGACTGCGATCC-3′ AP1 5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′

AP2 3′-CATCTGACGCATGGTTAA-5′ AP2 3′-TACTCAGGACTCAT-5′

E00 5′-GACTGCGTACCAATTC-3′ M00 5′-GATGAGTCCTGAGTAA-3′

E-NN 5′-GACTGCGTACCAATTCNN-3′ M-NN5′-GATGAGTCCTGAGTAANN-3′

Sun Xiao-mei，Yang Pan-pan，Lu Xiu-jun，Zhou Wen-qiang，Wang Dan，Yang Hong-guang.

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1.2 方法

1.2.1 芍药种子总RNA的提取

按照北京TIANGEN公司的RNAprep pure Plant Kit说明书对芍药去皮种子进行总RNA的提取。其中对前两步进行了改良，即：取2个1.5 mL的RNase-free离心管，向每管中加入450 μL RL裂解液和5 μL β–巯基乙醇。将芍药的去皮种子在液氮中迅速研磨成粉末，分装到2个管中，每管加 50 mg左右，在涡旋混合器上剧烈震荡混匀。将两个管中的混合物转移至一个过滤柱中，4 ℃条件

小心吸取收集管中的上清液至一新的RNase-Free离心管中，之后按照下12 000 r · min-1离心5 min，

操作说明进行。提取得到的RNA溶液取1 μL在ES-2型微量紫外可见吸光 · 荧光光度计上检测其纯度和浓度，取5 μL在1.2%的琼脂糖凝胶上检测其完整性。

1.2.2 双链cDNA的合成

参照大连宝生物工程有限公司的M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit说明书以2 μg的模板RNA为材料进行双链cDNA的合成。取3 μL经1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，1 μL进行浓度检测，剩余的cDNA溶液于–20 ℃保存。

1.2.3 cDNA的双酶切体系

采用EcoRⅠ和MseⅠ酶切组合对合成的双链cDNA进行双酶切，通过对酶切模板、酶的用量及酶切时间进行优化，最终确定的酶切体系为：双链cDNA 350 ng，10 × Tango buffer（with BSA）2 µL，EcoRⅠ（10 U · μL-1）0.5 µL，MseⅠ（10 U · μL-1）0.5 µL，ddH2O补足至20 µL。短暂离心混匀后在PCR仪中进行如下反应：37 ℃酶切4 h，65 ℃酶切20 min，立即置于冰上冷却2 min，之后进行连接反应。

1.2.4 连接体系

5 pmol · L-1 EcoRⅠ接头的制备：取已稀释至100 μmol · L-1的EcoRⅠ接头的上链和下链各1.5 μL，加入ddH2O稀释至30 μL，混匀后在PCR仪上：94 ℃ 3 min；65 ℃ 10 min；37 ℃ 10 min；25 ℃ 10 min。–20 ℃保存备用。

取已稀释至100 μmol · L-1的MseⅠ接头的上链和下链各15 μL，50 pmol · L-1 MseⅠ接头的制备：

混匀后在PCR仪上：94 ℃ 3 min；65 ℃ 10 min；37 ℃ 10 min；25 ℃ 10 min。–20 ℃保存备用。

连接反应：向1.5 mL离心管中加入酶切产物20 μL，EcoRⅠ接头（5 pmol · L-1）1 μL，MseⅠ

1 μL，10 × T4 DNA Ligation buffer 3 μL，T4 DNA Ligase（3 U · μL-1）1 μL，ddH2O接头（50 pmol · L-1）

补足至30 µL。混匀后放于金属浴中，16 ℃连接过夜，70 ℃水浴10 min。–20 ℃保存备用。

1.2.5 预扩增体系的优化

以芍药休眠种子的连接产物为模板，以E00和M00为预扩增引物，对连接产物的稀释倍数进行了优化，分别以连接产物未稀释，稀释5倍、10倍、15倍和20倍作为模板进行预扩增，预扩增反应体系为：稀释10倍的酶切连接产物5 μL，10 × Taq buffer 2.5 μL，dNTPs（10 mmol · L-1）0.5 μL，E00 1 μL，M00 1 μL，Taq DNA Polymerase（2.5 U · μL-1）0.5 μL，ddH2O 14.5 µL。按以下PCR反应程序进行扩增：94 ℃3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃1 min，30个循环；72 ℃5 min。取5 μL预扩增产物，用1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，其余产物保存于–20 ℃冰箱中备用。

1.2.6 选择性扩增体系优化

选择性扩增所用的引物组合为E-NN和M-NN，反应体系为：稀释10倍的预扩增产物5 μL，10 × Taq buffer 2 μL，dNTPs（10 mmol · L-1）0.4 μL，E-NN 0.8 μL，M-NN 0.8 μL，Taq DNA Polymerase

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（2.5 U · μL-1）0.4 μL，ddH2O 10.6 µL。为了确保试验的可重复性和准确性，将预扩增产物进行不同倍数的稀释（10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、150倍和200倍），且设置2次重复。在PCR中进行选择性扩增，反应程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s（–0.7 ℃/cycle），72 ℃ 1 min，13个循环；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，24个循环；72 ℃ 7 min。 1.2.7 选择性扩增产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

向20 μL选择性扩增产物中加6 μL溴酚蓝，混合均匀后置于PCR仪上95 ℃变性5 min，然后立即置于冰上。取变性的产物3 μL上样于点样孔。设置电压为2 000 V，电流为100 mA进行电泳。电泳至二甲苯氰距胶下缘2/5处停止，银染显色。在灯箱上对检测结果进行观察，分别读取芍药种子休眠和露白间的差异条带及根长3 ~ 4 cm和根长3 ~ 4 cm后4 ℃层积28 d的差异条带。

2 结果与分析

2.1 芍药种子总RNA的提取

从未经处理的休眠种子、露白的种子、根长达3 ~ 4 cm的种子和根长达3 ~ 4 cm后4 ℃层积28 d的种子中提取总RNA，经1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测显示，总RNA的28S rRNA和18S rRNA两条带完整且清晰，28S rRNA的亮度基本是18S rRNA的两倍（图1），表明提取的RNA完整性较好。

经ES-2型微量紫外可见吸光 · 荧光光度计检测，OD260/OD280的值在1.8 ~ 2.1之间，OD260/OD230的值大于2，RNA的浓度在200 ~ ，说明提取获得的总400 ng · μL-1之间（表2）

RNA样品纯度高，无DNA、蛋白质、多糖等杂质的污染，符合合成双链cDNA的模板要求，能满足cDNA-AFLP试验的需要。

表2 总RNA的紫外检测 Table 2 UV detection of total RNA

材料代号

Material symbol A B C D

阶段 Stage

休眠种子 Dormancy seed 露白种子 Dehiscent seed

根长3 ~ 4 cm的种子Seed with 3–4 cm root length 根长达3 ~ 4 cm后4 ℃层积28 d的种子

Seed with stratification for 28 d at 4 ℃ after root length reaching to 3–4 cm

OD260 OD260/OD230 OD260/OD280 5.864 2.022 5.651 2.146 8.798 2.266

9.831 2.208

1.980 2.076 1.816

1.972

RNA/

（ng · μL-1）234.56 226.04 351.92

393.24

图1 总RNA电泳图

A：休眠种子；B：露白种子；C：根长达3 ~ 4 cm的种子；

D：根长达3 ~ 4 cm后4 ℃层积28 d的种子。 Fig. 1 Electrophoresis result of total RNA

A：Dornancy seed；B：Dehiscent seed; C:Seed with 3–4 cm root

length；D：Seed with stratification for 28 d at 4 ℃

after root length reaching to 3–4 cm.

2.2 双链cDNA的合成

合成的双链cDNA大小在300 ~ 2 000 bp之间，呈弥散状（图2），说明其质量较好。经ES-2 型微量紫外可见吸光 · 荧光光度计对cDNA浓度检测，均大于20 ng · μL-1，符合后续酶切试验要求。

Sun Xiao-mei，Yang Pan-pan，Lu Xiu-jun，Zhou Wen-qiang，Wang Dan，Yang Hong-guang.

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图2 双链cDNA电泳图

M：DL2 000 marker；A：休眠种子；B：露白种子；C：根长达3 ~ 4 cm的种子；D：根长达3 ~ 4 cm后4 ℃层积28 d的种子。

Fig. 2 Electrophoresis result of dscDNA

M：DL2 000 marker；A：Dornancy seed；B：Dehiscent seed；C：Seed with 3–4 cm root length；

D：Seed with stratification for 28 d at 4 ℃ after root length reaching to 3–4 cm.

2.3 预扩增体系的优化

2.3.1 连接产物稀释倍数对预扩增的影响

预扩增反应在cDNA-AFLP体系中起承上启下的作用，既可以反映酶切和连接的效果，又为选择性扩增提供模板，影响选择性扩增的结果。不同稀释倍数的连接产物扩增后经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示所有预扩增均可获得100 ~ 1 000 bp的弥散条带（图3），可见酶切反应充分且接头连接效果好，可用于cDNA-AFLP试验分析。

其中以连接产物稀释10倍的预扩增产物的信号最强，所以试验选择以稀释10倍的连接产物进行预扩增反应。 2.3.2 预扩增产物的电泳检测

分别将休眠种子、露白种子、根长达3 ~ 4 cm的种子和根长达3 ~ 4 cm后4 ℃层积28 d的种子的酶切连接产物稀释10倍进行预扩增。经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，条带呈弥散状，主要分布在100 ~ 1 000 bp之间，扩增信号较强，而且可以看到某些清晰的条带（图4），证明预扩增反应成功，得到的预扩增产物可用于下一步的选择性扩增。

2.4 预扩增产物的稀释倍数对选择性扩增的影响

以预扩增产物为模板进行选择性扩增时，预扩增产物的稀释倍数影响较大。为得到清晰稳定的条带，试验中将稀释10 ~ 200倍的预扩

图4 预扩增产物的电泳图

M：DL2 000 marker；A：休眠种子；B：露白种子；C：根长达3 ~ 4 cm的种子；D：根长达3 ~ 4 cm后4 ℃层积28 d的种子。 Fig. 4 Electrophoresis result of pre-amplification products M：DL2000 marker；A：Dormancy seed；B：Dehiscent seed；C：Seed with 3–4 cm root length；D：Seed with stratification for 28 d at

4 ℃ after root length reaching to 3–

4 cm. 图3 连接产物稀释不同倍数预扩增的电泳结果

Fig. 3 The pre-amplified result with template diluted differently

from ligation products M：DL2 000 marker.