间接原位RT-PCR法检测辣椒叶组织中辣椒轻斑驳病毒的分布

园艺学报，2015，42 (3)：489–495.

Acta Horticulturae Sinica doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0791；http：//www. ahs. ac. cn 489 间接原位RT-PCR法检测辣椒叶组织中辣椒轻斑驳病毒的分布

杨洪一1，郭世辉1，李丽丽2,*

（1东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040；2黑龙江省林业科学研究所，哈尔滨 150081）

摘 要：为了了解辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus，PMMoV）在辣椒组织中的分布特点，

探索利用间接原位RT-PCR技术对病毒在辣椒组织中进行定位。利用改进的CTAB法从辣椒叶片中提取总

RNA，利用RT-PCR技术扩增出PMMoV的特异片段，并经克隆测序，证明其为PMMoV的特异片段。

利用PCR技术，制备出了地高辛标记的特异cDNA探针。对原位RT-PCR反应体系进行优化，经过切片

、制备（切片厚度7 μm、应用Superfrost plus正电荷防脱载玻片）、预处理（1 mg ? L-1蛋白酶K消化5 min）

RT-PCR（37 ℃反转录2.5 h、PCR退火温度为58 ℃）、杂交检测，建立了应用间接原位RT-PCR技术检

测PMMoV在辣椒组织中分布的方法。原位RT-PCR结果显示，叶片组织中PMMoV阳性信号主要分布于

栅栏组织，其次是海绵组织，表皮组织中也有少量阳性信号。此外，叶柄中可见少量阳性信号，主要位

于表皮组织。

关键词：辣椒；辣椒轻斑驳病毒；原位RT-PCR；地高辛；组织定位；cDNA

中图分类号：S 641.3 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）03-0489-07

Analysis on the Distribution of Pepper mild mottle virus in Leaf Tissues of Peppers with Indirect in situ RT-PCR

YANG Hong-yi1，GUO Shi-hui1，and LI Li-li2,*

（1College of Life Sciences，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China；2Institute of Forestry Science of Heilongjiang Province，Harbin 150081，China）

Abstract：The aim of this study was to analyze the characterization of distribution of Pepper mild mottle virus（PMMoV）in tissue of peppers，and an in situ RT-PCR system was developed to locate PMMoV in tissue of peppers. Total RNA was extracted from pepper leaves with a modified CTAB method. The specific fragment was amplified by RT-PCR using total RNA as a temple，and it was testified that the fragment was PMMoV-specific one on the basis of cloning and sequencing. A specific digoxin-labeled cDNA probe of PMMoV was generated according to PCR labeling technique. A system for localization of PMMoV in tissue level was developed with indirect in situ RT-PCR，via optimization of in situ RT-PCR including section preparation（7 μm sections in the Superfrost plus positively charged slides），pre-treating（1 mg · L-1 protease K digested for 5 min），RT-PCR（performing 2.5 h in 37 ℃ for reverse transcription 收稿日期：2014–11–17；修回日期：2015–01–26

基金项目：中央高校基本科研业务费项目（DL13EA06-3）

* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：hyi01@http://wendang.chazidian.com）

Yang Hong-yi，Guo Shi-hui，Li Li-li.

Analysis on the distribution of Pepper mild mottle virus in leaf tissues of peppers with indirect in situ RT-PCR.

490 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (3)：489–495. and annealing in 58 ℃ for PCR），and detection of hybridization. The technique，which can analyze the distribution of PMMoV in tissue of peppers，was developed. The result of in situ RT-PCR showed that PMMoV-positive signals were the best in palisade tissues of pepper leaves，and it had lots of PMMoV-positive signals in palisade tissues. Epidermis had also few positive signals. In addition，few positive signals located mostly in epidermis could be found in petioles.

Key words：Capsicum；Pepper mild mottle virus；in situ RT-PCR；digoxin；location in tissue cDNA

辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus，PMMoV）是一种严重危害辣椒生产的种传病毒。PMMoV最早在美国发现，其后在西班牙、德国、澳大利亚等国均有报道，对英国、美国一些保护地辣椒曾造成毁灭性危害（Antignus et al.，2008）。PMMoV属于烟草花叶病毒属（Tobamovirus），

2007）。PMMoV病毒粒体直杆状，为正单链RNA病毒，基因组由6 357个核苷酸组成（Hiroyuki et al.，

可通过带毒种子、植株残体传播，在植物残体中可存活数年，可随辣椒制品进入人体，随粪便排出后仍具有侵染活性（Colson et al.，2010）。中国于1994年首次在新疆辣椒上发现PMMoV，后来山东青岛、河北保定、宁夏惠农等地区先后有该病毒发生的报道，目前该病害危害日益严重（Wang et al.，2009；王亚南 等，2010）。传统观点认为，植物病毒在植株体内分布不均一，但病毒的具体分布规律不详（Hull，2007；Matsushita et al.，2011）。病毒侵入植物，经过复制及长距离转运扩散至植物各组织，在此基础上，进一步复制增殖，从而干扰植物正常生理活动，因而了解病毒分布是了解病毒转运及病理作用的一扇窗口。为了了解病毒的分布特点，一些组织定位手段被开发。早期主要通过电子显微镜、免疫印迹、免疫胶体金、免疫荧光、原位杂交等技术进行病毒的组织定位（Kelley & Cameron，1986；Nass et al.，1998；Aparicio et al.，1999；Tzanetakis et al.，2004；Genda et al.，2005），但灵敏度较低。尽管原位杂交灵敏度高于免疫学方法（陈珏，2010），但多适于检测组织内高滴度病毒，而低滴度病毒需则利用原位RT-PCR技术进行检测（Bates et al.，1997）。

原位RT-PCR技术是近年来发展起来的病毒组织定位新技术，Hasse等（1990）首次报道了原位PCR扩增技术，简称原位PCR（in situ PCR），其结合了传统PCR技术的高效扩增和原位杂交技术的细胞定位的优点，既能够在组织切片、细胞样品中检测到低拷贝的RNA或DNA，又能特异地确定其细胞来源和细胞定位。原位PCR主要用于医学研究，近年来在植物学研究中也有所应用（Johansen，1997；Matsuda et al.，1997）。Silva等（2003）首次将原位RT-PCR技术应用于植物病毒学研究，在杏树组织中发现了大量李矮缩病毒（Prune dwarf virus，PDV）。之后陆续有报道应用原位RT-PCR技术对植物病毒进行组织定位的报道。在草本植物中，目前仅有关于草莓叶片中的草莓斑驳病毒组织定位的报道（Yang et al.，2011）。在木本植物中，已有利用原位RT-PCR技术对苹果、梨、杏、葡萄中的病毒、类病毒进行了组织定位的研究，显示叶片中的病毒主要分布于叶肉细胞；而葡萄、梨茎尖分生组织尖端未能检测到病毒（赵英和牛建新，2008；Zhao et al.，2009；王钰婷 等，2013）。为了进一步了解PMMoV在辣椒组织中的分布特点，本研究中探索利用间接原位RT-PCR技术对病毒在叶片和叶柄组织中进行定位。

1 材料与方法

1.1 材料

8株感病辣椒植株于2011年9月分别采自黑龙江哈尔滨、吉林九台辣椒田，移栽入花盆，保存

杨洪一，郭世辉，李丽丽.

间接原位RT-PCR法检测辣椒叶组织中辣椒轻斑驳病毒的分布.

园艺学报，2015，42 (3)：489–495. 491 于东北林业大学微生物学实验室。利用Agdia公司的DAS-ELISA试剂盒对感病植株及阴性对照样品进行了检测，确认感病植株为PMMoV阳性；RT-PCR检测显示其未受黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）和马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）感染（Dai et al.，2012）。

大肠杆菌DH5α菌株为本实验室保存。反转录酶M-MLV为Invitrogen公司产品，PCR产物纯化试剂盒、dNTPs购于生工生物工程（上海）股份有限公司，Taq DNA聚合酶、RNasin、pMD 18-T载体、DNA Marker购自TaKaRa公司。DIG DNA标记及检测试剂盒购自深圳莱伯克生物科技有限公司。其它药品为国产分析纯。引物序列为：5′-CGATATAATGCCGTGCTAGAT-3′（上游引物），5′-GCCATCATGTTTAAGGAGTTGT-3′（下游引物）。引物由大连宝生物公司合成。

1.2 RNA提取及RT-PCR

取0.05 g辣椒叶片，利用改进CTAB法提取总RNA（Yang & Zhang，2007），最后溶解于50 µL

、dNTPs（1 mmol · L-1）、DEPC水中。在0.2 mL Eppendorf 管中加入随机9mer引物（0.25 µmol · L-1）

1 µL总RNA、RNasin 0.3 µL、反转录Buffer 4 µL、2 µL DTT、0.5 µL M-MLV反转录酶（200 U · µL-1）及9 µL超纯水，终体积20 µL，混匀。之后进行反转录反应，对反转录温度（37、42 ℃）及时间（0.5、1.0、2.5 h）进行优化。反转录结束后70 ℃ 15 min，最后4 ℃保温。

取1 µL反转录产物进行PCR反应。反应体系中含2 µL 10× Buffer，1.5 mmoL · L-1 MgCl2，0.2 mmol · L-1 dNTPs，0.2 µmol · L-1引物，0.5 U Taq酶，用水补足至20 µL。

对PCR反应中的退火温度（53 ~ 60 ℃）进行优化，最终反应程序为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，35个循环；最后72 ℃延伸5 min。

1.3 克隆测序

以PCR产物纯化试剂盒回收DNA片段，与pMD 18-T载体连接，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。经蓝白斑筛选，挑取白色菌落培养，提取质粒，通过PCR鉴定阳性克隆（Yang & Zhang，2007）。测序工作委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行，双向测序。

1.4 探针制备及点杂交

参照地高辛标记试剂盒说明，利用PCR技术合成探针。利用点杂交对RT-PCR产物进行检测，具体操作参见文献（Wang et al.，2009）。

1.5 冰冻切片的制作及预处理

分别取8株感病植株及阴性对照样品，每株分别取2个叶片或叶柄样品，剪成1.0 cm × 0.5 cm小段，投入固定液（4%低聚甲醛、4%蔗糖和2.5%戊二醛）中固定1 ~ 2 h，然后浸入15%蔗糖磷酸溶液中，置于4 ℃过夜。将包埋剂倒入锡箔纸盒内，用液氮将材料迅速冷冻，然后放入温度为–20 ℃的冰冻切片机样品台上迅速冷冻固定。先将样品切取需要的部位，然后拿出来室温放置25 s，使包埋块稍微变软。回温后的材料放入机箱内切片。用镊子小心夹取组织切片，平展于载玻片上，室温放置10 min使切片稍变干。

用3× PBS和1× PBS分别冲洗组织，并温育5 min。然后按顺序以30%、60%、80%和100%乙醇依次冲洗切片进行室温脱水，每次2 min。将载有固定样品的载玻片置于105 ℃加热2 min。放入含0.3% H2O2 PBS中，于37 ℃或室温放置过夜，然后用PBS洗1遍。将载玻片浸于1 mg · L-1蛋白

Yang Hong-yi，Guo Shi-hui，Li Li-li.

Analysis on the distribution of Pepper mild mottle virus in leaf tissues of peppers with indirect in situ RT-PCR.

492 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (3)：489–495. 酶K（1× PBS稀释）中，温浴10 min后进行原位RT-PCR扩增。

1.6 原位RT-PCR

将反转录溶液加于切片上，盖上原位杂交专用盖玻片，密封，之后放于原位PCR仪上进行反转录反应。反转录反应结束后，将PCR反应混合液加到切片上，密封后放置原位PCR仪上进行PCR扩增。反转录体系、PCR体系组成、反应程序与上述RT-PCR反应相同。利用地高辛标记的探针对组织切片进行杂交检测，最后利用倒置显微镜进行观察并采集图像。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR检测系统的优化

以感病辣椒叶片组织为试材，利用改进

CTAB法提取总RNA，利用PMMoV特异引物

扩增病毒基因组部分外壳蛋白（Coat Protein，

CP）基因区域。最终优化的反转录程序为37 ℃

2.5 h；最优退火温度为58 ℃。利用优化

RT-PCR反应程序，最终扩增出了与预期片段

大小一致的PCR产物（约250 bp）（图1）。

利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对扩增产物进

行胶回收，连接至载体后进行测序，测序结果

显示该序列为246 bp；与GenBank中所报道的

PMMoV CP基因的序列同源性为91% ~ 98%，显示该序列为PMMoV特异序列。

2.2 间接原位RT-PCR法检测PMMoV在辣椒组织中的分布

2.2.1 探针制备及其有效性分析

以质粒DNA为模板，利用地高辛标记试剂盒，以DIG-dUTP为底物，用随机渗入法对DNA进行标记，制备了地高辛的探针，经电泳显示探针大小与预期相符。为了确定探针的有效性，利用制备的探针对感染PMMoV样本的RT-PCR产物进行斑点杂交检测（图2），杂交后加入抗地高辛的碱性磷酸酶标记的抗体，利用碱性磷酸酶和化学底物的作用检测杂交靶DNA，该探针可与RT-PCR产物产生明显杂交信号，而阴性对照中未见杂交信号，说明制备的探针及整个杂交体系是有效的。

图1 利用RT-PCR检测PMMoV M：DL2000 Marker；1：PMMoV阳性样本；2：阴性对照。 Fig. 1 Detection of PMMoV by RT-PCR M：DL2000 Marker；1：Sample infected PMMoV；2：

Negative control.

图2 PMMoV探针的斑点杂交反应结果

Fig. 2 The result of spots hybridization of PMMoV probe

2.2.2 冰冻切片制备及蛋白酶处理过程优化

将辣椒组织利用包埋剂进行包埋，利用液氮将辣椒组织冷冻，在冰冻切片机上将辣椒组织制成

杨洪一，郭世辉，李丽丽.

间接原位RT-PCR法检测辣椒叶组织中辣椒轻斑驳病毒的分布.

园艺学报，2015，42 (3)：489–495. 493 冰冻切片。对切片厚度进行了优化（5 ~ 30 µm），最终最优的切片厚度为7 μm。切片过薄则不能保持细胞形态的完整性，导致杂交显色后组织形态模糊，且后续试验中组织易碎。切片过厚则背景颜色太深，杂交后的显色不明显，不利于观察，也易导致样品吸附力降低，与载玻片结合不牢固。将切片展片到Superfrost plus正电荷防脱载玻片上，在显微镜下可清晰观察到叶片内部组织形态（图3）。

图3 辣椒叶片组织冰冻切片（放大200×）

Fig. 3 Frozen tissue section of pepper leaf（magnifying 200×）

在切片预处理过程中，还对蛋白酶的消化时间进行了优化。蛋白酶消化主要是为了增加细胞的通透性，利于反应溶液进入细胞内部。切片的最佳消化时间为5 min（蛋白酶K浓度为1 mg ? L-1），时间过长会导致细胞膜完整性受到破坏，细胞组织形态模糊；时间过短则细胞通透性不好，反应不稳定，易出现假阴性。

2.2.3 间接原位RT-PCR技术检测PMMoV的结果

经过优化反应体系，建立了间接原位RT-PCR技术检测PMMoV的技术体系。以辣椒叶片、叶柄为试材，制备冰冻切片，切片厚度为7 μm，置于Superfrost plus正电荷防脱载玻片上；切片预处理过程采用蛋白酶K（1 mg ? L-1）消化5 min；之后在原位PCR仪中进行RT-PCR反应，反转录程序为37 ℃ 2.5 h、PCR反应退火温度为58 ℃；之后利用地高新标记的探针对RT-PCR产物进行分子杂交检测；最后将切片置于倒置显微镜下进行镜检，感染PMMoV辣椒组织中可见一些紫黑色斑

图4 PMMoV的组织定位（放大200×）

A：叶片组织；B：叶柄组织。EP：表皮组织；PA：栅栏组织；SP：海绵组织；V：病毒粒子；CO：皮层；

BS：维管束鞘。黑色箭头标示阳性信号密集聚集区。

Fig. 4 Location of PMMoV in tissue of pepper （magnifying 200×）

A：Leaf tissue；B：Petiole tissue；EP：Epidermis；PA：Palisade tissue；SP：Sponge tissue；V：Virus；CO：Cortex；

BS：Bundle sheath. Strong positive-sign regions were signed with black arrow.