柑橘抗逆基因NAC83的克隆与表达分析

园艺学报，2015，42 (3)：445–454.

Acta Horticulturae Sinica doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-1006；http：//www. ahs. ac. cn 445 柑橘抗逆基因NAC83的克隆与表达分析

郭文芳*，刘德春*，杨 莉，庄 霞，张涓涓，王书胜，刘 勇**

（江西农业大学农学院，南昌 330045）

摘 要：以柚[Citrus maxima（Burm.）Merr.]、枳[Poncirus trifoliata（L.）Raf.]和柠檬[C. limon（L.）

Burm. f.]实生苗为试材，使用电子克隆和RT-PCR的方法从中克隆到3个新的NAC蛋白基因，分别命名

为CmNAC83、PtNAC83和ClNAC83；并用qRT-PCR技术检测了该基因在ABA、干旱、低温和高盐胁迫

处理下的时空表达。结果显示：CmNAC83、PtNAC83和ClNAC83 的cDNA序列全长均为841 bp，都含

有750 bp的开放阅读框（ORF），编码249个氨基酸；推测其蛋白分子质量分别为24.18、28.00和28.15 kD，

等电点分别是9.02、9.31和9.30，且均含有NAC家族的N端保守结构域；系统进化树分析表明，该3个

蛋白均属于SENU5亚族，与苹果NAC22亲缘关系较近。实时定量qRT-PCR分析显示，NAC83基因能被

ABA、干旱、低温和高盐胁迫诱导表达，且在不同的柑橘种类中存在表达差异。可见柚CmNAC83、枳

PtNAC83和柠檬ClNAC83是NAC基因家族的成员，可能在柑橘响应非生物胁迫的过程中起了重要作用。

关键词：柚；枳；柠檬；NAC83；基因克隆；基因表达

中图分类号：S 666 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）03-0445-10

Cloning and Expression Analysis of New Stress-resistant NAC83 Gene from Citrus

GUO Wen-fang*，LIU De-chun*，YANG Li，ZHUANG Xia，ZHANG Juan-juan，WANG Shu-sheng，and LIU Yong**

（College of Agronomy，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China）

Abstract：In the present study，three novel NAC genes，CmNAC83，PtNAC83 and ClNAC83，were cloned by in silico cloning and RT-PCR approaches from seedlings of pomelo[Citrus maxima（Burm.）Merr.]，trifoliate orange[Poncirus trifoliata（L.）Raf. ]and lemon[Citrus limon（L.）Burm. f.]. The expression patterns of these genes were analyzed by Real-time quantitative PCR（qRT-PCR）under the stress of ABA，drought，cold and salt. The results showed that the full length of cDNA sequence of all the three genes were 841 bp and the open reading frame（ORF）were 750 bp which encoded three polypeptides of 249 amino acids. The molecular weight of the three proteins were 24.18，28.00 and 28.15 kD，with isoelectric point about 9.02，9.31 and 9.30 respectively. The three novel proteins contained N-terminal conserved domains of NAC family. The phylogenetic analysis showed that the three proteins have the highest similarity with NAC22 from Malus × domestica，and Its belongs to the SENU5 subfamily in NAC 收稿日期：2014–12–19；修回日期：2015–02–12

基金项目：国家自然科学基金（地区科学基金）项目（31260468）；江西省青年自然科学基金项目（20114BAB214006）；江西省自然科学基金项目（20142BAB204008）；江西省教育厅科技计划项目（GJJ14292）；江西农业大学科学研究基金项目（CX201101）

* 共同第一作者

** 通信作者 Author for correspondence（E-mail：liuyongjxau@http://wendang.chazidian.com）

Guo Wen-fang，Liu De-chun，Yang Li，Zhuang Xia，Zhang Juan-juan，Wang Shu-sheng，Liu Yong.

Cloning and expression analysis of new stress-resistant NAC83 gene from Citrus.

446 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (3)：445–454. family. The qRT-PCR analysis indicated that the expressions of three NAC83 genes were induced by stress of ABA，drought，cold and salt，but they were differently expressed in different citrus species. The results of this paper suggested that CmNAC83，PtNAC83 and ClNAC83 were new members of the NAC gene family，and they might play important roles in citrus in response to abiotic stress.

Key words：pomelo；trifoliate orange；lemon；NAC83；cloning；expression analysis

柑橘的抗逆性是一个多基因控制的数量性状，单独转化个别抗逆基因往往效果不显著。而转录因子在植物信号传递与胁迫应答中能够调控下游功能基因的表达，且一个转录因子可以调控多个与同类性状有关的基因表达，是植物逆境应答反应的关键环节（Nakashima & Yamaguchi-Shinozaki，2006）。因此，目前对转录因子的研究是提高植物抗性育种工作的重点之一。

近年来，AP2/EREBP、MYB、NAC、WRKY和bZIP等转录因子在植物逆境中的响应机制被广泛研究（Xu et al.，2011），其中NAC转录因子是目前发现的数量最大的植物转录因子家族之一（Singh et al.，2002）。通过基因组测序发现，拟南芥基因组中有117个NAC家族转录因子，水稻中有151个，葡萄中有79个，白杨中有163个，大豆和烟草中各有152（Rushton et al.，2008；Hu et al.，2010；

。根据生物信息学对转录组测序数据分析，推测有20% ~ 25%Nuruzzaman et al.，2010；Le et al.，2011）

的NAC基因对至少一种或几种胁迫有响应作用（Fujita et al.，2004；Kawaura et al.，2008）。前人的研究也不断证实了许多NAC转录因子在植物抵御逆境胁迫中起着重要作用，如Jiang和Deyholos（2006）分析了拟南芥NAC基因家族对高盐胁迫的响应机制，从盐胁迫处理后的拟南芥植株根部组织中发现33个NAC基因的表达发生改变，其中26个上调表达，7个下调表达；茄子SmNAC1在受GA、低温和高盐诱导后表达上调，且在根中优先表达（邵帅 等，2014）；毛白杨PtoNAC157能响应低温、高盐、干旱和ABA胁迫，在幼根、茎和叶中均有表达，且在茎中的表达量最高（张杰伟 等，2014）；从小麦中分离得到TaNAC基因受干旱诱导强烈表达，过量表达TaNAC的转基因烟草表现出明显优于野生型对照的抗旱功能（刘美英 等，2010）；玉米NAC结合膜转录因子基因ZmNTL1转化到拟南芥植株，发现在盐胁迫条件下过表达株系种子萌发率高于野生型，根系也较长，土培植株的存活率也高于野生型，说明ZmNTL1与植物抗盐性密切相关（王敏，2013）；Oliveira等（2011）对柑橘数据库中NAC转录因子进行分析，鉴定出45个含有NAC结构域的蛋白，其中CsNAC1与逆境胁迫响应有关；曹银川（2010）从‘暗柳’甜橙的红肉突变体‘红暗柳’中克隆到NAC转录因子家族的几个成员，分析表明，citNAC和citNAC1都是衰老上调基因，citNAC2是一个抗病相关基因，它的表达能够阻止发病相关基因的表达。

枳是柑橘中常用的砧木，抗逆性强，而柚和柠檬是大规模栽培的柑橘种类，抗逆性相对较弱；若能从抗逆性强的柑橘种类中克隆一些抗逆转录因子基因导入到柑橘栽培品种中，较转入其他外源抗性功能基因更容易获得抗性较强的柑橘新品种。本研究中从枳、柚和柠檬中克隆得到3个新的NAC家族基因，并使用实时定量PCR技术对其在低温、高盐、干旱等逆境胁迫和ABA处理下的时空表达模式做出初步分析，以期为柑橘抗逆分子育种提供候选基因资源和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试材及其处理

2013年10月将柚[Citrus maxima（Burm.）Merr.]、枳[Poncirus trifoliata（L.）Raf.]和柠檬[C. limon

郭文芳，刘德春，杨 莉，庄 霞，张涓涓，王书胜，刘 勇.

柑橘抗逆基因NAC83的克隆与表达分析.

园艺学报，2015，42 (3)：445–454. 447 （L.）Burm. f.]种子分别播种于含有8 g · L-1琼脂，40 g · L-1蔗糖，pH 5.8的MT培养基中，置于江西农业大学农学院园艺系实验室培养箱（25 ℃ ± 1 ℃，16 h光照，12 000 lx，8 h黑暗）中培养。待幼苗长到约25 cm时，移植到Hoagland培养液中预培养5 d，然后分别移到4 ℃培养箱中低温培养，或移到含有100 μmol · L-1 ABA，含有20% PEG6000，含有250 mmol · L-1 NaCl的Hoagland液体培养基中常温培养。每个物种的每个因素处理20 ~ 25个植株，均以室温（25 ℃）下不加处理的Hoagland液体培养植株作对照，分别在处理后0、1、3、6、12和24 h取其叶片，液氮速冻，置于–80 ℃超低温冰箱储存备用。

1.2 柚、枳和柠檬RNA提取及cDNA合成

采用Trizol总RNA提取试剂盒（Invitrogen，美国）分别提取柚、枳和柠檬叶片总RNA。用DNaseⅠ（Promega，美国）去除剩余的基因组DNA，用核酸蛋白仪检测总RNA的浓度，1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。以总RNA为模板，采用Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒（TaKaRa，日本）合成cDNA，存于–20 ℃冰箱作为基因克隆和实时定量PCR的模板备用。

1.3 CmNAC83、PtNAC83和ClNAC83基因克隆

通过检索HarvEST-Citrus数据库（http：//harvest. ucr.edu/）找到与植物NAC家族基因同源性很高的表达序列标签（EST）序列，数据库自动将这些EST序列拼接成一条一致性序列。基于该一致性序列使用引物设计软件Primer5设计合成一对基因特异性引物QS：5′TGCAAAGACTTTT CGGTTA3′；QA：5′CGCCAATTACTTGTACAGA3′，同时分别使用柚、枳和柠檬叶片第一链cDNA

获得CmNAC83、PtNAC83为模板与PCR扩增试剂TIANGEN® 2× Taq PCR MasterMix进行PCR扩增，

和ClNAC83基因全长序列。PCR扩增程序如下：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃再延伸10 min；4 ℃保存。分别将PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，利用DNA回收试剂盒（天根生化科技有限公司）将PCR目的片段经回收、纯化，与

，蓝白斑筛选，经pMD®18-T载体（TaKaRa）连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α（TIANGEN）

菌液PCR鉴定均为阳性克隆后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.4 CmNAC83、PtNAC83和ClNAC83的实时定量PCR

利用BIO-RAD CFX96实时荧光定量PCR仪对柚、枳和柠檬各胁迫取样点的cDNA模板进行荧光相对定量分析。荧光染料SYBR®Premix Ex TaqTM购买于大连宝生物公司；3个目的基因的扩增引物均为NAC-F：5′TTGGGATTTGCCAGGTGATG3′、NAC-R：5′GCCTTCCAATAACCAGACCC3′；均以柑橘Actin基因为内参基因，Actin的扩增引物为Actin-F：5′ACTCATCGTACTCAGCCTTTG3′、Actin-R：5′TGCACCCTGTTCTTCTTACTG3′。qRT-PCR反应采用25 μL反应体系，12.5 μL SYBR® Premix Ex Taq、0.5 μL PCR Forward Primer、0.5 μL PCR Reverse Primer、9.5 μL ddH2O、2 μL cDNA模板。qRT-PCR反应程序采用两步法，程序如下：95 ℃30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。每处理样品设3个生物学重复。利用2-ΔΔCT方法进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 CmNAC83、PtNAC83和ClNAC83的cDNA序列分析

通过电子克隆和RT-PCR方法，分别从柚、枳和柠檬中克隆到CmNAC83（GenBank登录号：

Guo Wen-fang，Liu De-chun，Yang Li，Zhuang Xia，Zhang Juan-juan，Wang Shu-sheng，Liu Yong.

Cloning and expression analysis of new stress-resistant NAC83 gene from Citrus.

448 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (3)：445–454. KM268906）、PtNAC83（KM589037）和ClNAC83（KM589038）3个新基因。测序和生物信息学分析结果表明：3个新基因cDNA序列全长均为841 bp，含有750 bp的开放阅读框（Open Reading Frame，ORF），编码249个氨基酸的蛋白质；预测蛋白分子量依次分别为28.14、28.00和28.15 kD，等电点分别为9.02、9.31和9.30；碱基序列比对结果（图1）显示，3个基因序列的相似性达到99.37%，有16个碱基位点存在差异。

图1 柚CmNAC83、枳PtNAC83和柠檬ClNAC83碱基序列比对

Fig. 1 Alignment of predicted base sequence of CmNAC83 of Citrus maxima，PtNAC83 of Poncirus trifoliate

and ClNAC83 of Citrus limon

2.2 CmNAC83、PtNAC83、和ClNAC83的同源性及进化分析

借助NCBI数据库将碱基序列翻译成氨基酸序列，用DNAman对CmNAC83、PtNAC83

和

郭文芳，刘德春，杨 莉，庄 霞，张涓涓，王书胜，刘 勇.

柑橘抗逆基因NAC83的克隆与表达分析.

园艺学报，2015，42 (3)：445–454. 449 ClNAC83进行氨基酸序列比对，3条序列相似性达到98.93%，共计8处存在差异，分别在第5、114、154、183、188、197、198、211位氨基酸位点（图2中▼标注的位置）。与其他物种NAC家族蛋白进行多重序列比对分析表明，3个新蛋白均有NAC家族共有特点，即N端都包含一段保守的氨基酸序列，约160个氨基酸残基，保守域包含 A、B、C、D、E 5个亚结构域。利用InterPro Scan在线分析CmNAC83、PtNAC83和ClNAC83蛋白结构功能域，结果表明：3个蛋白中均在10 ~ 169位点存在NAC结构域，其中14 ~ 138包含NAM（No apical meristem）结构域。

CmNAC83、PtNAC83和ClNAC83编码的氨基酸序列具有较高的同源性。以柚CmNAC83基因为例，利用NCBI中的Blast程序对CmNAC83编码蛋白与其它已知植物中NAC结构域蛋白进行同源性分析，结果表明蛋白CmNAC83与麻疯树NAC011（GenBank序列号AGL39667.1）、橡胶树NAC2（AHF27223.1）、可可NAC（XP_007043870.1）、茶NAC（AGT01909.1）、苹果NAC22（NP_001281000.1）、大豆NAC14（NP_001238078.1）和拟南芥NAC083（NP_196822.1）等NAC蛋白同源性依次为77%、76%、74%、74%、71%、67%和62%。证明克隆出的3个基因属于植物NAC转录因子家族。

图2 各种植物NAC蛋白氨基酸序列比对

▼表示CmNAC83、PtNAC83和ClNAC83蛋白序列的氨基酸差异位点，A ~ E表示该蛋白的保守结构域。

Fig. 2 Sequence alignment of NAC proteins from different plant species

▼ Indicate the different sites of amino acid sequences of protein CmNAC83，PtNAC83 and ClNAC83，

A–E are the conserved domains of these proteins.