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隐蔽型脱氧雪腐镰刀菌烯醇的研究进展

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隐蔽型脱氧雪腐镰刀菌烯醇的研究进展

粮油食品科技第20卷2012年第6期

质量控制

隐蔽型脱氧雪腐镰刀菌烯醇的研究进展

1,212

程亮,管军军,常晓娇

(1.河南工业大学生物工程学院,河南郑州450001;2.国家粮食局科学研究院,北京100037)要:隐蔽型脱氧雪腐镰刀菌烯醇(maskedDON)是由脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)与极性较强

的化合物结合而形成。与DON相比有不同的极性及溶解度,因此不能用常规检测方法检测出来。摘

隐蔽型DON在体内会水解为毒素单体,具有潜在危害能力。就隐蔽型DON发现、人工合成和生物转化、污染状况、污染样品中隐蔽型DON的提取、净化、检测进行了综述,并就粮食行业需求提出了建议。

关键词:隐蔽型脱氧雪腐镰刀菌烯醇;形成;转化;污染;检测中图分类号:TS201.3

文献标识码:A

文章编号:1007-7561(2012)06-0061-04

Researchprogressonmaskeddeoxynivalenol

CHENGLiang1,GUANJun-jun1,CHANGXiao-jiao2

(1.CollegeofBioengineering,HenanUniversityofTechnology,ZhengzhouHenan450001;

2.AcademyofStateAdministrationofGrain,Beijing100037)

Abstract:Maskeddeoxynivalenol(maskedDON)isformedbycombiningDONwithamorepolarcom-pound.IthasdifferentpolarityandsolubilitycomparedwithDON,thereforecannotbedetectedwithroutinedetectionmethods.Ithashazardpotentialafterhydrolysistotoxinmonomer.Theformation,arti-ficialsynthesisandbiotransformation,pollution,extractionfrompollutedobject,purificationanddetec-tionofmaskedDONweresummarized.Thesuggestionswereputforwardtomeettheneedsofgrainindus-try.

Keywords:maskeddeoxynivalenol;formation;transformation;contamination;detection全球每年约有25%的农作物被真菌毒素污染,约2%的农作物因污染严重而失去营养和经济价值,造成数千亿美元的经济损失

[1]

DON还具有很强的细胞毒性和胚胎毒性,外,已被

联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)确定为最危险的自然发生食品污染物之一,列入国际

[3]

研究的优先地位。DON对人和动物危害的程度与膳食摄入量和机体的健康状况有关,且毒素的生物效应总是随着剂量的增加而加大,存在一个较为固定的剂量效应关系,但对动物和人DON中毒爆发的调查研究结果显示,虽然饲料和膳食中的毒素水平较低,中毒症状却较重,这种毒素摄入量与中毒症状间的非剂量反应关系导致了隐蔽型DON(maskedDON)的发现。目前国内对隐蔽型DON的研究较少,本文就隐蔽型DON发现、人工合成和生物转化、污染状况、污染样品中隐蔽型DON的提取、净化、检测进行了综述。1

隐蔽型DON的发现

DON,即脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivaleol),7α,15-三羟基-12,13-环氧单端化学名称为3α,

孢酶-9-烯-8-酮,属单端孢霉烯族化合物,又名呕吐毒素(Vomitoxin),分子式为C15H20O6,分子结

。真菌毒素是真

菌在生长过程中产生的次级代谢产物,据估计,世界

上有300种真菌的代谢产物对人类和动物有毒,目前已知200多种。较常见的真菌毒素大部分来源于曲霉菌(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)、青霉菌属(Penicillium)等。谷物中常见的禾谷镰刀霉(Fu-sariumgraminearum)和黄色镰刀霉(Fusariumculmo-rum)可以产生黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、单端孢霉烯族毒素、伏马菌素、赭曲霉毒素和杂色曲霉毒素,其中DON是分布最广泛单端孢霉烯族毒素之[2]

一。DON是谷物赤霉病的重要指标性毒素,其毒性作用主要是致呕吐,猪对其最敏感。动物中毒后的症状主要表现为拒食、恶心、呕吐、腹泻等消化系统症状和头痛头晕等神经系统症状,同时DON可能

IgA肾病、与人类食管癌、克山病和大骨节病有关

收稿日期:2012-08-15

1987年出生,作者简介:程亮,男,硕士.

通讯作者:管军军,男,副教授,硕士生导师.

质量控制

[4]

构如图1。其C12和C13位的环氧基团对于其呕

3-OH基团与其免疫吐毒性起着至关重要的作用,

[5]

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抑制毒性相关。

粮油食品科技第20卷2012年第6期

15-acetyl主要有3-acetyl-DON(3-A-DON)、

-DON(15-A-DON)、DON-3-glucoside(DON-3-G)、DON-15-glucoside(DON-15-G),其中

[9]

以DON-3-G研究较多,见图2。除此之外,玉米赤霉烯酮(ZEN)在植物、霉菌、酵母的新陈代谢中分别被转化为ZON-4-glucopyranoside(Z4G)、ZON-4-sulfate(Z4S)、α-zearalenol(α-ZOL)和

[10-12]

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。β-zearalenol(β-ZOL)

图1DON分子结构式

1983年,Miller等[6]发现小麦感染DON之后,

DON浓度先是达到最大值(580mg/kg),然后降低到某一水平(约430mg/kg)并维持该水平直至收获。19世纪80年代中期,霉菌毒素在动物临床观察中中毒表现和与饲料中检测到的低含量毒素没有

[7]

Young等[8]发现酵母关联而受到关注。1984年,

发酵食品中的DON浓度要远高于小麦面粉原料。根据这些早期的研究结果推测在植物的新陈代谢中形成一种结合型的霉菌毒素,毒素通过化学修饰和(或)结合至细胞基质中从而降低毒素的毒性。结合型毒素可以在动物的消化道中水解为毒素源,再进一步转变成毒素单体而发挥毒性作用。这种毒素摄入量与中毒症状间的非剂量反应关系导致了隐蔽型DON的发现。目前文献已经报道的隐蔽型DON

图2DON-3-G的分子结构式

2

隐蔽型DON的人工合成与生物转化

隐蔽型毒素要比毒素单体更有极性,用普通溶剂很难提取,并且(或)在冲洗过程中很容易流失,

[13]

因此不能用常规方法检测出来。在早期的研究中没有现成的标准品,因此需要使用化学合成法合

[14]

成相关的DON衍生物。1991年Savard首次人工合成DON的葡萄糖和脂肪酸结合物。随后2003

BerthillerF等[15]在前人的基础上修改了DON年,

葡萄糖苷的合成方法,使用两步法并结合离子交换法合成DON-3-G和DON-15-G,见图3。

图3DON-3-G的合成

植物对生物异源物质的反应机制一般分为物理

区室化和化学区室化,物理区室化将化学物质隔离在特殊的细胞器、组织中,从而最大限度降低对植物的正常代谢的影响。而化学区室化则是将毒素与其他的功能基团或与其他的细胞组成成分相结合,结合后

[16-17]

。这些在生物体内都需的毒素具有更低的毒性

要经过很多复杂的生物化学反应,目前对于DON的生物体内转化研究较多的是DON的糖基化。

在生物体内,多种化合物的生物合成都需要经过包括糖基化、羟基化及甲基化等在内的多种修饰而保

[18]

证细胞内物质的动态平衡。糖基化是指在糖基转

GTs,EC2.4.x.y)的作用移酶(Glycosyltransferases,

下,通过将供体糖基转移至受体分子以调节受体活性。所以,糖基转移酶在生物体内起着非常重要的生

[19-20]

。尿苷二磷酸糖基转移酶(UDP-gly-物学作用

cosyltransferases,UGTs)属于糖基转移酶家族中的家族1(Family1)。UGTs可能是通过糖基化激素和次级代谢产物而参与了植物对生物及非生物胁迫的抗

[21-22]

。2003年,PoppenbergerB[23]等利用一性过程

个对DON敏感的酵母ABC转运蛋白突变株对拟南芥cDNA文库进行筛选时分离到一个UGT基因(DOGT1,UGT73C5)。该基因编码的蛋白能将UDP-glucose的葡萄糖基转移到DON分子C3位置的羟基上形成DON-3-G,麦胚提取物转录/翻译偶联系统荧光素活力结果表明DON-3-G的毒素要远远小于DON;同时,它还可以降低15-A-DON的毒性,过量表达该基因提高了拟南芥对DON的抗性。2005年,LemmensM[24]等从模式植物Arabidopisthali-ana中鉴别出一种葡萄糖基转移酶,并且发现小麦对DON抗性的主要位点与小麦赤霉病抗性的主效QTL位点Qfhs.ndsu-3BS紧密连锁,在抗性材料中DON

[25]

被转化为DON-3-G。2008年,林凡云等通过同源克隆的方法分离到两个小麦UGTs(TaUGT1和TaUGT2)。TaUGT1受赤霉病抑制表达,TaUGT2受

粮油食品科技第20卷2012年第6期

质量控制

[13,32]

。实际研究中均采用此比例做为萃取剂

常用于净化DON的固相萃取柱(SPE)主要有Mycosep225和226型。SPE对玉米和小麦中的多种真菌毒素均有非常高的回收率,但对DON-3-G的回收率仅12.75%,说明净化柱并不适合DON-3-G的净化。直接膜过滤法回收DON-3-G的效果要比SPE柱效果要好,但仍达不到理想效果,在直接膜

诱导表达。

3污染状况

DON广泛存在于小麦、大麦、玉米等粮谷类农作物中,在世界范围内存在着较高的污染率,已被联合国粮农组织和世界卫生组织确定为最危险的自然发

[26-27]

。欧盟成员国先后按照国际通用生食品污染物

的危险性评估模式分别对本国居民的膳食暴露量进行了评估,并制订了相应的粮食和饲料中DON毒素的限量标准值。国内外对DON的污染状况的研究较多,如百奥明公司每年发布全球霉菌毒素调查报告,但对隐蔽型DON的污染研究则相对不足。

2005年,BerthillerF[13]等在小麦扬花期喷洒禾谷镰孢或黄色镰孢孢子悬液或用DON处理麦穗,收获后研磨整麦穗,经提取净化后使用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析。对所有经DON处理小麦样品(n=52)同时检测DON和DON-3-G。小麦穗中

DON-3-G的的DON浓度范围为77~574mg/kg,

浓度范围为81-455mg/kg,有22个样品中的DON

-3-G浓度高于非衍生DON浓度。在喷洒孢子悬

过滤法基础上改进的先离心再过膜法对DON-3-G的回收率有大幅提高,且随加标浓度增加回收率提高,当加标浓度为600μg/kg时回收率达到84.1%[32],可以满足谷物及食品中的DON-3-G的检测需要。

目前检测DON及其隐蔽型的常用方法是LC-MS/MS法。LC-MS/MS对谷物及其制品中真菌毒素检测具有预处理简单、检测速度快、灵敏度高的优点,可适用于复杂基质样品中多组分真菌毒素的确认和准确定量检测。质谱电离方式主要有大气压化学

电离(APCI)和电喷雾电离(ESI)。两者在负离子模

SulyokM式下均可以检测出DON-3-G。2006年,

[33]

液和自然条件下受禾谷镰刀菌浸染的玉米和小麦中等用一步法提取后不经过净化,在负离子模式下

3-A-DON、15-A-DON和使用乙腈/水/乙酸:79/20/1直接用LC/ESI-MS/同时检测到了DON、

DON-3-G,且DON-3-G浓度要普遍高于DONMS检测玉米和小麦中的39种真菌毒素。2011年,

[34]

乙酰化的浓度。DON-3-G的污染水平随着DONTranST等使用三氟甲烷磺酸(Trifluoromethane-污染水平的升高而加重,呈现出正的剂量反应关系。sulfonicacid,TFMSA)水解小麦和玉米中的结合态这说明隐蔽型DON的污染水平在评估人类DON实DON,用ELASE和GC—MS法检测样品中初始自由际膳食暴露量时具有重要指导作用。国内的李凤琴态DON含量和水解后自由态DON含量,结果表明在[9]

等利用高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/玉米和小麦中结合态DON含量分别占DON含量的

[32]

MS)检测了7个省市的玉米、小麦、大米样品中的毒8%~70%和7%~75%。国内相关研究对样品中素污染,检测出乙酰化DON和DON-3-G,表明谷不同组分真菌毒素协同检测做了条件优化,选用甲醇物在田间生长过程已经受到镰刀菌的浸染,不同的气-0.1%甲酸水作为ESI源的流动相,在色谱柱温为候因素会导致禾谷镰刀菌不同化学型的地域分布差40℃,样品温度为5℃,进样量5μL条件下建立了异,因此污染水平存在较大地域差异。欧盟正在考虑流速、梯度洗脱等参数,协同检测的14种真菌毒素在将目前执行的单一DON限量标准修订为DON及其优化的条件下通过单通道提取可以完全分离。衍生物(包括隐蔽型)之和。紧跟国际新标准,将我5展望国现行食品中针对DON单一的限量修订为DON及隐蔽型DON的种类繁多、性质复杂、潜在危害其衍生物之和为大势所趋。但由于我国玉米和小麦大,但我们对隐蔽型毒素的认识相对不足,对相关形中DON及其衍生物的污染水平及膳食消费量均不成机理和基因研究不健全,因此要加大对隐蔽型毒素同,因此应在风险评估的基础上分别制定限量标准。的相关研究,建立毒素及隐蔽型毒素的协同检测平4隐蔽型DON的提取、净化、检测台,增加谷物及饲料中的隐蔽型毒素的含量监测,系

由于隐蔽型DON较DON的极性大,使常规分析统评估隐蔽型毒素对人和动物的潜在危害。JECFA方法不能检测出隐蔽型DON,因此不能反应谷物中真(联合国粮农组织和世界卫生组织下的食品添加剂

[28]

实的DON水平。检测谷物样品中的DON含量需联合专家委员会JointFAO/WHOExpertCommittee要经过样品的粉碎过筛、有机溶剂萃取、过滤、净化和onFoodAdditives)在2010年4月第72次会议上决

[29]

检测分析。目前研究的报道指出,提取隐蔽型DON定,将原来针对DON的PMTDI(每日最大允许摄入的溶剂主要集中于甲醇/水、乙腈/水以及甲醇/二氯甲量)改为针对DON及其乙酰化衍生物(3-A-DON烷,不同比例组分较多。相关研究表明乙腈/水:84/16及15-A-DON)化合物组的PMTDI(1μg/kg)。因

[30-31]

,此我国谷物及饲料中的毒素检测国家标准势必会增的比例对DON和DON-3-G的提取效果更好

质量控制

加隐蔽型毒素的检测标准。利用LC-MS/MS或UP-LC-TOF/MS技术建立谷物及饲料样品中的隐蔽型真菌毒素的提取、净化、协同多组分检测平台是未来的发展趋势;开发新型抗体以建立灵敏、快速的隐蔽型真菌毒素的酶联免疫和荧光检测法国家标准具有很好的前景和实际应用价值。参考文献:

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