高效液相色谱法测定动植物油脂中苯并_a_芘的方法改进

粮油食品科技第20卷2012年第6期

质量控制

高效液相色谱法测定动植物油脂中

苯并(a)芘的方法改进

伍先绍，凌海，柳永英，邱文胜

(广西壮族自治区粮油质量监督检验站，广西南宁530031)

摘要:采用GB/T24893—2010《动植物油脂多环芳烃的测定》中的液液萃取方法提取动植物油

脂中的苯并(a)芘，用中性氧化铝固相萃取柱净化，用反相高效液相色谱法—荧光检测器定量检测试样中的苯并(a)芘含量。实验结果表明植物油的平均加标回收率为91．44%，动物油的平均加标回收率为91．69%。以茶油为试样，测定结果的相对标准偏差(RSD)为1．48%(n=7)。改进方法简单、操作易控制、方法精密度好、回收率高，适合测定动植物油脂中的苯并(a)芘含量。关键词:苯并(a)芘;反相高效液相色谱法;动植物油脂;液液萃取;固相萃取

中图分类号:TS207．3文献标识码:A文章编号:1007－7561(2012)06－0049－05

ImprovementonHPLCtodeterminebenzo(a)pyreneinanimal

andvegetablefatsandoils

WUXian－shao，LINGHai，LIUYong－ying，QIUWen－shen

(GuangxiGrain＆OilQualitySupervisionandInspectionStation，NanningGuangxi530031)Abstract:Thebenzo(a)pyrenewasextractedfromanimalandvegetablefatsandoilsbyliquidphaseex-tractionaccordingtoGB/T24893－2010Animalandvegetablefatsandoils－Determinationofpolycyclicaromatichydrocarbons，whichwaspurifiedbysolidphaseextractionofneutralaluminacolumn，andde-terminedbyreverse－phasehighperformanceliquidchromatography－fluorescencemethod．Theresultsindicatedthattheaveragerecoveryrateforvegetablefatsandoilswas91．44%，andthatforanimalfatsandoilswas91．69%．Therelativestandarddeviationwas1．48%(n=7)forthedeterminationresultsofteaseedoil．Thisrevisedmethodwassimpleandeasytooperate，hadgoodprecisionandhighrateofre-coveries．Thustherevisedmethodwasfitfordeterminationofbenzo(a)pyrenecontentinanimalandveg-etablefatsandoils．

Keywords:benzo(a)pyrene;reversed－phasehighperformanceliquidchromatography(RP－HPLC);animalandvegetablefatsandoils;liquidphaseextraction;solidphaseextraction多环芳烃化合物(PolycyclicAromaticHydrocar-bons，PAHs)是广泛存在于环境中的化学污染物，种类很多，美国环境保护署将其中主要的16中化合物列为严加控制的物质，其中部分具有致癌性，如苯并(a)芘，苯并(a)蒽等。其中苯并(a)芘作为多环芳烃中毒性最大的一种强致癌物，虽不导致急性中毒，但具有强致癌性和致畸性，是世界三大强致癌物之一。因此，受到国内外学者的广泛关注和深入研究。苯并(a)芘可以由煤炭、石油、天然气、木材等不完全燃烧而产生，也可以在有机物质中产生。动植物

收稿日期:2012－04－09

1983年出生，作者简介:伍先绍，男，江西吉安人，硕士，工程师．1963年出生，通讯作者:柳永英，女，高级工程师．

油脂在高温条件下生产加工以及烹调油炸食品都会

产生苯并(a)芘，特别是反复煎炸食品的动植物油［1］

脂。由于苯并(a)芘脂溶性的特点，动植物油脂很容易受到污染。

2010年3月，国家质检总局在风险监测时发现一批生产的茶油中苯并(a)芘含量超过国家标准限量值的数倍，部分茶油的苯并(a)芘含量也严重超标，原因可能是作为茶油原料的油茶籽因加热烘烤产生苯并(a)芘而污染了成品油。根据GB2716—

［2］

2005《食用植物油卫生标准》和GB2762—2005

［3］

《食品中污染物限量》要求，我国动植物油脂中苯并(a)芘的限量值为10μg/kg。国外的限制更加严格，如欧盟的限量值为2μg/kg。目前我国测定动

瑒瑩

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植物油脂中苯并芘含量的国标方法有GB/T5009．

［4］

27—2003《食品中苯并(a)芘的测定》和GB/T22509—2008《动植物油脂苯并(a)芘的测定反相高

［5］

效液相色谱法》。GB/T5009．27—2003植物油试样前处理方法，存在着步骤繁琐、费时费力、耗试剂和试剂毒性大、对操作人员的技能要求高、回收率和测定结果不稳定等缺陷。GB/T22509—2008规定的前处理方法虽然简单，适用于动植物油脂，但是存在试样称取量小、自行制备中性氧化铝层析柱的活性难控制、常出现净化不完全、回收率偏低等问题，也影响测定结果的准确性。因此，探讨研究测定步骤简单，回收率稳定，定量准确的动植物油脂中苯并(a)芘含量测定新方法，对提高各级检测机构分析动植物油脂中的苯并(a)芘含量的工作效率有极大的促进作用。1材料与方法1．1实验材料

动植物油脂样品:大豆原油，依次编号A—001、A—002、A—003;大豆油(浸出一级)，依次编号B—001、B—002、B—003;花生油(压榨一级)，依次编号C—001、C—002、C—003;花生调和油，依次编号D—001、D—002、D—003;茶油，依次编号E—001、E—002、E—003;火麻油，F—002、依次编号F—001、F—003;棕榈油，G—002;鱼油，依次编号G—001、

H—002、H—003、H—004;起酥依次编号H—001、

I—002。油，依次编号I—001、

中性氧化铝固相萃取柱:CleanertBaP固相萃取22g/60mL(P/N:BaP2260)，100～200目，柱，

Brockmann活度Ⅳ级(在室温下避光保存):天津博纳艾杰尔科技有限公司。1．2

实验试剂

乙腈、丙酮、正己烷、环己烷、甲醇均为色谱纯，

N—二甲基甲酰胺石油醚(沸程30℃～60℃)和N，

为分析纯。实验用水符合GB/T6682—2008规定的一级水要求。20μg/mL的苯并(a)芘标准物质:农业部环境保护科研监测所。1．3

主要实验仪器和用具

Agilent1260高效液相色谱仪，配自动进样器，荧光检测器:安捷伦科技有限公司;B5500S－DTH超声波清洗器:上海必能信超声有限公司;800型离心沉淀器:原上海手术器械厂;KL512氮吹仪:北京康林科技有限责任公司;XK96—A涡旋混合器:江苏姜堰市新康仪器厂;电热恒温水浴锅(控温范围:常温至100℃):汕头医疗器械厂;冰箱:西门子。

10mL具塞离心管;10mL具塞比色管;150mL圆底烧瓶;100mL量筒等用具，均用色谱纯的正己烷洗涤三次。瑠瑓

1．4

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色谱条件

250mm×色谱柱:ZORBAXEclipsePAH柱，

4．6mm，粒径5．0μm，加PAH保护柱:12．5mm×4．6mm，粒径5．0μm;流动相及组成:甲醇—水(体积比为95∶5);流速:1．2mL/min;检测器:荧光检测器;检测波长:激发波长365nm，发射波长410nm，PMT增益为12;进样量:10μL;柱温:35℃。1．5建立标准工作曲线

用甲醇稀释20μg/mL的苯并(a)芘标准物质配制成10ng/mL的标准工作使用液，进样量分别为3、5、9、11、13、15μL即相当于3、5、9、11、13、15ng/mL的系列标准工作使用液各进样10μL。苯并(a)芘标准物质的色谱出峰图如图1，出峰时间为17．167min。以苯并(a)芘含量为横坐标和峰面积为纵坐标建立标准工作曲线方程为:y=1．6922x+

2

0．03229，相关系数R=0．9996，见图2

。

［6］

1．6试样制备1．6．1方法一

按GB/T5009．27—2003《食品中苯并(a)芘的测定》中的5．1．2条款规定的操作步骤提取试样中的苯并(a)芘，提取液在60℃水浴锅中浓缩至约0．5mL，转移至10mL具塞比色管中，用10mL正己烷分三次洗涤，合并转移至10mL具塞比色管中，置于40℃水浴中氮吹浓缩至尽干，然后依次按本文改进方法(1．6．3．2)规定的试样净化和定容测定(1．6．3．3)步骤进行。

同时，按上述步骤制备试剂空白。

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ng/准工作曲线中得到的待测液中苯并(a)芘的浓度，

mL;V—待测液体积，mL;m—试样质量，为g。2结果与分析2．1

三种试样制备方法之间的比较选择B—001大豆油，分别按方法一和方法二规定的试样制备方法提取净化制备试样，实验结果见表1。

方法二

按GB/T22509—2008《动植物油脂苯并(a)芘的测定反相高效液相色谱法》的规定要求称取试样，直接用2mL洗脱溶剂溶解试样(用正己烷作洗脱溶剂时，用正己烷溶解试样。用石油醚作洗脱溶剂时，则用石油醚溶解试样)，然后依次按本文改进方法(1．6．3．2)规定的试样净化和定容测定(1．6．3．3)步骤进行。

同时，按上述步骤制备试剂空白。1．6．3改进方法

1．6．3．1试样提取［7］

称取1g左右的动植物油脂试样(精确至1mg)于10mL具塞离心管中(固态动植物油脂在测定过程中，若凝固则采取60℃水浴加热溶解，应盖好盖并垂直放置，避免溢漏)，加入4mL乙腈—丙酮混合溶液(体积比为6∶4)，用涡旋混合器振荡离心

放入超声波水浴中保持5min，再放入管30s后，

离心机中4000r/min离心5min，然后将离心管放置于2℃冰箱中放置10min，取出放入离心机中4000r/min再离心1min，用移液器小心移取上层上清液，并转移至一支已称重的10mL比色管中。试样中加入4mL乙腈—丙酮混合溶液重复提取

合并上层上清液于10mL比色管中，同时置三次，

于40℃水浴中用氮吹浓缩至尽干。萃取物总量应不大于250mg，若大于250mg，则相应减少试样的称样量。

1．6．3．2试样净化［5］

用30mL正己烷将CleanertBaP固相萃取柱活化，控制流速，不收集流出液。加2mL正己烷溶解10mL比色管中的萃取物，涡旋振荡均匀。当洗脱溶剂液面接近柱顶端时，开始用150mL的圆底烧瓶接收洗脱液，马上添加溶解的萃取物到活化好的CleanertBaP固相萃取柱中，用80mL正己烷洗脱直到完全自然滴出。1．6．3．3定容测定

将收集的洗脱液置于78℃的水浴锅中蒸发浓缩至0．5mL，转移至另一支10mL比色管中，用总计8mL的正己烷分四次淋洗圆底烧瓶，合并淋洗液到10mL比色管中，置于40℃水浴用氮吹浓缩至尽干。添加合适体积的甲醇至氮吹管中，涡旋振荡均匀，用孔径0．22μm微孔滤膜过滤转移至进样瓶中，进样量10μL测定。

同时，按上述步骤制备试剂空白。1．7结果计算

苯并(a)芘含量的计算公式为:

C·V·1000

X(μg/kg)=

m·1000

其中:X—样品的苯并(a)芘含量，μg/kg;C—从标

1．6．2

按方法一规定的试样制备方法制备的试剂空白

和大豆油试样均检出苯并(a)芘。做三个平行加标

82．57%和回收率实验，回收率分别为78．13%、

87．45%。由于方法一规定的操作步骤繁琐复杂，虽然有时也能获得较高的回收率，但是回收率结果不稳定，影响测定结果的准确性。

按方法二规定的试样制备方法制备试样，采用色谱纯的正己烷作为洗脱溶剂时，试剂空白和B—001大豆油试样均未检出苯并(a)芘，加标回收率分

79．70%和81．89%，别为73．35%、结果偏低。分析

原因是按标准规定称取试样，甚至再减少试样的称取量，也还是会出现试样净化不完全，影响测定结果的准确性。当采用分析纯的石油醚作为洗脱溶剂时，试剂空白和B—001大豆油试样均能检出苯并(a)芘，加标回收率不稳定，结果之间差别很大，原因是分析纯石油醚本身含有较高的苯并(a)芘含量而干扰测定结果。方法二规定分析纯的石油醚作为洗脱溶剂应重蒸，不仅增加操作步骤，而且结果质量难控制。因此，比较可以得出，直接采用色谱纯的正己烷作为洗脱溶剂能消除试剂对测定结果带来的干扰。

表1方法名称

样品名称试剂空白

大豆油本底

方法一加标40ng

加标40ng

加标40ng试剂空白大豆油本底加标3ng加标4ng加标3ng试剂空白大豆油本底加标3ng加标4ng加标5ng

按方法一与方法二制备试样的测定实验结果

试样量/(m/g)/20．051220．023220．041120．0406/0．30940．40090．30680．3009/0．30550．31890．21520．2039

石油醚(分析纯)正己烷(色谱纯)试剂环己烷(色谱

N，N—二纯)、

甲基甲酰胺(分析纯)

定容体积苯并(a)芘含加标回V/mL量C/(ng/mL)收率/%0．52．65438/0．55550．30．30．50．50．80．30．30．40．40．8

6．052326．854567．210737．60054NDND4．801266．375643．071001．581061．907077．6842812．1262310．27815

/78．1382．5787．45//73．3579．7081．89//83．39106．96153．01

方法二

注:ND表示未检出。

选择E—001茶油和E—002茶油，按改进方法

和方法二分别规定的试样制备方法制备试样，实验结果见表2。对于同一个样品，按方法二制备的试样测定结果比按改进方法制备的试样测定结果要低

瑓瑡

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且不稳定，原因是按改进方法制备试样能使试样净化完全。

表2方法名称改进方法方法二改进方法方法二

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按改进方法与方法二制备试样的测定实验结果测定试样量次数/(m/g)1

1．02871．15780．30330．30021．05361．06360．31770．3064

正己烷(色谱纯)

2121

洗脱溶剂

定容体积苯并(a)芘含测定结果V/mL量C/(ng/mL)X/(μg/kg)220．30．34411

9．3368110．4312415．551714．699687．561988．151577．307788．77037

18．152618．019115．382514．689928．709130．656523．002128．6239

样品名称E—001茶油

E—002茶油

212

综合比较可得出，方法一和方法二的试样制备方法都存在着不同的缺陷，而按改进方法操作提取净化试样并选择色谱纯的正己烷作为洗脱溶剂，能克服这些缺陷并能获得满意的效果(见表3)。

2．2液液萃取时提取温度与萃取物总量之间的关系

由于食用动植物油脂种类多且等级不同，含有

提取浓缩的萃取物总量也的油脂成分和杂质不同，

会不同。当环境温度高于20℃时，油脂中的短链脂

［7］

肪酸的溶解度会增加。因此，可能导致提取浓缩的萃取物总量超过固相萃取柱的柱容量而出现净化不完全，不能获得准确的测定结果。

表3

前处理方法之间的比较

方法

名称

不同点

试样量

提取方法

提取耗试剂量

改进方法与方法一和方法二之间的比较相同点

测定结果之间的比较

试剂空白

净化效果

是否受试结果的剂干扰稳定性

回收率范围70%～90%

综合评价

净化方法

净化耗试剂量

方法一

340mL环己

Cleanert120mL正常温环境下，在

20．0～120mLN，烷、

BaP固相己烷(色能检出分液漏斗中进

25．0gN－二甲基甲

行液液分配。萃取柱谱纯)

酰胺

120mL己烷(

Cleanert

谱纯)

BaP固相

120mL

萃取柱

油醚(析纯)

正

色未检出石

分能检出

完全是不稳定

操作繁琐、耗试剂、测定结果受试剂本底干扰、回收率不稳定、定

。量不准确

操作简单、试样量小、

试样净化不完全、回收率偏低、结果重现性差、定量不准确。操作简单、与方法二相比，试样量增大、试样能净化完全、回收率高、结果重现性好、定量准确。

方法二

不完全否不稳定

70%～85%/

0．4g//

不完全是不稳定

改进方法

1．0g

振荡、超声液液萃取，低温环境放置后离心分层，取上层清液。

16mL乙腈－

Cleanert120mL正

丙酮混合溶液

BaP固相己烷(色未检出

(体积比为6∶

萃取柱谱纯)

4)

完全否稳定

90%～95%

为了考察液液萃取时提取温度对萃取物总量的影响，本文比较了常温环境和将离心管离心后置于2℃冰箱中放置10min这两种操作条件对萃取物质总量的影响。在本方法规定的试样量和常温环境下，选择有代表性的各种类和级别的动植物油脂进行实验，结果见表4。从实验结果可以看出，常温下大豆原油和火麻油的萃取物总量远大于250mg，有的大豆油(浸出一级)和花生调和油样品的萃取物总量略高于250mg。选择表1中萃取物总量偏高的试样，将离心管离心后置于2℃冰箱中放置10min，只有火麻油的萃取物总量略高于250mg，结果见表5。实验结果表明，低温环境能在很大程度上降低萃取物总量。因此，在固相萃取柱柱容量一定的情况下，低温环境下操作降低萃取物的总量既可以增加试样的取样量而增加试样的代表性，也可以相应地减少固相萃取柱的上样量而提高固相萃取柱的净化效果，提高测定结果的重现性。瑢瑓

表4常温下不同动植物油脂的萃取物总量实验结果

编号A—001

A—002A—003B—001B—002B—003C—001C—002C—003D—001D—002E—001E—002E—003F—001F—002G—001G—002H—001H—002H—003H—004I—001I—002

试样量/g1．02191．01141．01801．00101．00411．03231．04311．00591．03061．00431．01441．01241．00741．00431．00481．00221．04681．02930．80900．81640．80630．82670．79870．8109

萃取物所占总量/mg比例/%373．036．50325．332．16341．833．58287．228．69191．719．09286．627．76225．121．58221．822．05204．819．87274．527．33241．023．76197．719．53182．418．11176．717．59457．045．48457．445．64162．915．56174．116．91231．428．60239．129．29140．617．44260．631．52161．320．20143．217．66

样品

名称大豆原油大豆原油大豆原油大豆油(浸出一级)大豆油(浸出一级)大豆油(浸出一级)花生油(压榨一级)花生油(压榨一级)花生油(压榨一级)

花生调和油花生调和油

茶油茶油茶油火麻油火麻油棕榈油棕榈油鱼油鱼油鱼油鱼油起酥油起酥油

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表5

低温下不同动植物油脂的萃取物总量实验结果

编号A—001B—001C—001D—001E—001F—001F—002G—002H—001H—004I—001I—002

试样量/g1．00021．02841．00481．00381．03061．02091．02361．02261．02131．00491．05161．0335

萃取物所占总量/mg比例/%230．8189．4138．7189．1112．6277．6282．7150．4146．3196．9122．4131．1

23．0818．4213．8018．8410．9327．1927．6214．7114．3219．5911．6412．69

测定结果

D—003C—001花生调和油花生油0．590．630．616．56

5．264．955．116．07

质量控制

结果表明，植物油的加标回收率平均值为91．44%，动物油的加标回收率平均值为91．69%。因此，本方法的回收率高且稳定。2．5样品检测分析

为了验证改进方法在实际检测工作中的可行性，按照改进方法制备试样检测样品的苯并(a)芘含量，测定结果见表8。在浓缩萃取物重量不超过250mg的情况下，过固相萃取柱后试样均能净化完全，平行试验结果的相对误差都在10%之内，能满足检测工作的要求。

表8

样品中苯并(a)芘含量的测定结果

样品名称E—001茶油27．1928．6227．915．12

H—002F—003鱼油火麻油1．181．131．164．31

1．601．731．677．81

样品

名称大豆原油大豆油(浸出一级)花生油(压榨一级)

花生调和油

茶油火麻油火麻油棕榈油鱼油鱼油起酥油起酥油

2．3

方法精密度测定

选择含有苯并(a)芘的E—001茶油，重复测定7次，测定结果见表6。从测定结果中可以得出E—001茶油的苯并(a)芘含量测定结果平均值为18．114μg/kg，相对标准偏差(RSD)为1．48%。因此，本方法有满意的精密度结果。

表6

样品名称

方法精密度测定实验结果

定容苯并(a)测定测定结果相对标

测定试样量

体积芘含量结果的平均值准偏差

m/g次数

V/mLC/(ng/mL)X/(μg/kg)/(μg/kg)(RSD)/%12

E—001茶油

34567

1．02871．15781．00031．02131．01890．99411．0166

2222221

9．3368110．431248．849049．233229．283469．2385718．34406

18．152618．019117．692818．081318．222518．586818．0445

18．114

1．48

平行1/(μg/kg)平行2/(μg/kg)平均值/(μg/kg)相对误差/%

3

2．4

方法回收率测定

H—001鱼油和I—001分别选择E—001茶油、

起酥油，用加标后的苯并(a)芘含量测定值扣除试样的本底值，计算加标回收率。试样中均添加5ng苯并(a)芘标准物质，方法回收率测定结果见表7。

表7

样品本底值测定名称/(μg/kg)次数

12

E—001

18．114

茶油

3456

H—001鱼油I—001起酥油

ND

1212

方法回收率测定实验结果试样量m/g1．02231．01531．01331．05451．02121．03881．00190．99971．03341．0325

定容苯并(a)体积芘含量V/mLC/(ng/mL)2222220．50．50．50．5

11．5213011．4780111．4203711．8569311．6293611．649299．237329．126829．137409．17250

回收率

回收率

的平均/%

值/%90．4991．3089．7292．2595．2189．6492．3791．2791．3791．73

91．6991．44

结论

苯并(a)芘含量作为动植物油脂质量监督和风险监测中一项非常重要的卫生指标，建立方法简单、操作省时省力、定量准确的检测方法能极大地降低检测成本和提高工作效率。本文采用液液萃取方法提取和固相萃取柱净化的方法建立的测定动植物油脂中苯并(a)芘含量的改进方法，方法简单，精密度好，回收率高，同时能消除试剂带来的测定干扰，能最低限度地减少操作人员对有毒物质的暴露和对环境的污染，过固相萃取柱后试样均能净化完全也有利于延长色谱柱的使用寿命，克服和解决了GB/T5009．27—2003《食品中苯并(a)芘的测定》和GB/T22509—2008《动植物油脂苯并(a)芘的测定反相高效液相色谱法》检测过程中存在的问题，适合于动植物油脂中苯并(a)芘含量的测定。参考文献:

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注:ND表示未检出。

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