植物病害研究法——答案

植物保护专业专业课植物病害研究法的期末考试复习题

植物病害研究法

1. 列举五个你熟悉的中英文文献检索数据库。

中文：维普、万方、CNKI三大期刊知识库，超星、书生之家书籍库。

英文：Pubmed、SD、EBSCO、Springer、NPG、Ei Village、CAS、Kluwer、ProQuest、Ovid。

2. 谈谈如何做好文献检索工作。

（1）根据题目确定关键词，随着对题目的深入了解，增加关键词，保证文章的查全率。

（2）选择合适的数据库，常用的中文数据库有……英文数据库有……

（3）使用相应的检索技术，如布尔逻辑算符、位臵检索、截词、优先算符等，来提高检索的效率，另外，需要注意of、the、in、she、he、to be、as、because、if、when等为禁用词，在检索时自动忽略。

（4）将检索到的文献进行筛选和归类：分精读与速读两类；只保留重要的资料；精细分类，并录入数据库。

（5）科学合理使用文件管理软件，如Endnote和Reference Manage。

（6）学会走进文献、走出文献，从文献中发现Idea。

3. 谈谈文献检索工作对科研工作者的重要性。

第一，有助于利用和掌握文献资料，缩短查找文献资料所花费的时间。在科学研究活动中，搜集、掌握足够的文献资料是研究工作的重要组成部分，往往要耗费较多的时间，而文献数量的成倍增长，各学科的相互渗透导致的文献交叉与分散化，使查找所需文献更加固难。在这种情况下，文献检索的功能和作用，恰恰能解决众多繁杂的文献与研究者特定需要之间的矛盾，能帮助研究者从浩如烟海的文献中迅速、准确地查找出所需专用文献，达到节省时间和精力的目的。

第二，有助于获取最新知识，及时了解研究课题内容所涉及的专业和相关学科的发展动态，指导课题研究的顺利进行。

第三，有助于开阔视野，扩大知识面，借鉴他人之法，指引治学门径，解决研究过程中的疑难问题。通过文献检索，不仅能够较快地获得所必须了解和掌握的知识，获得大量的情报信息，而且还能够比较有关文献的异同优劣，明确学术源流，达到正确鉴别、准确选择所需文献资料的目的。

第四，科学研究是文献检索的主要动机和目的。科学研究工作是探求客观事物的本质规律的活动，是人类能动地认识和改造世界的过程，科学研究一开始就包括了文献检索的环节在内，就要求通过文献检索方法和手段获取所需的情报信息。从科学研究的具体过程讲，要使研究工作取得有创造性价值的成果和有突破性的重大进展，就不能不通过文献检索，了解、掌握前人和今人在某一领域内所进行的探索、所取得的成果和所发生的失误。

4. 谈谈你对科技论文写作的认识。

科技论文是科学技术人员或其他研究人员在科学实验（或试验）的基础上，对自然科学、工程技术科学、以及人文艺术研究领域的现象（或问题）进行科学分析、综合的研究和阐述，进一步的进行一些现象和问题的研究，总结和创新另外一些结果和结论，并按照各个科技期刊的要求进行电子和书面的表达。

在进行植物病毒提纯中，作为病毒繁殖寄主应具备哪些条件条件？

（1）能产生较高浓度的病毒；（2）不含有大量的抑制病毒或不可逆的沉淀病毒的物质，如酚类化合物、有机酸、粘液和胶质等；（3）各种寄主成分的大小和物理性质与病毒粒体显著不同，不影响病毒的分离与提纯，也不吸附在病毒粒体表面；（4）易培养，生长迅速；（5）在温室条件下不感染其他病害，对杀虫剂等不敏感；（6）系统发病；（7）病毒易接种与感染。

5. 列出植物病毒提纯的一般程序？

（1）病毒繁殖。作为病毒繁殖寄主应具备以下几个条件：①②③④⑤⑥⑦

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（2）病毒汁液的抽提。选择合适的提取缓冲液：缓冲液是一种含有一种弱酸和它的盐，或是一种弱碱

和它的盐溶液，能强烈抵抗周围环境中pH值的改变，而且缓冲液之间成分和溶液中的化学成分不起化学反应。添加合适的保护剂：防止病毒被一些多酚氧化酶等物质氧化而钝化，保护病毒粒子的完整性和侵染性；常用的保护剂有亚硫酸钠、巯基乙醇、二硫苏糖醇、半胱氨酸、抗坏血酸、巯基乙酸等还原剂，还有二乙氨二硫代氨基甲酸等多酚氧化酶抑制剂。

（3）提取液的澄清。从感病组织中获得粗汁液后，提纯过程中第一步是澄清提取液，在整个提纯过程

中是最重要的步骤。澄清的目的是为了使病毒粒体和细胞组分分开而获得尽可能少含杂质的病毒沉淀。 澄清汁液的有机溶剂，有些是水溶性的，如乙醇和正丁醇；另一类是水溶性很低的，如乙醚、四氯化碳、乙醚和四氯化碳的等量混合液（20-50%）和氯仿（10%-50%）等。针对具体的病毒可选择TritonX-100作为澄清剂。

（4）浓缩及精提纯。病毒的浓缩：当稳定的病毒达到最大限度澄清后，病毒浓缩过程可以进一步除去

上清液中大量非专一的寄主材料；一种方法可用20-55%蔗糖垫沉淀病毒，能保护病毒粒体完整；另一种有效的方法是病毒沉淀到含有聚乙二醇（PEG）溶液中。病毒的精提纯：粗提纯的病毒样品中仍有少量的寄主球蛋白粒子，和一些与病毒粒子大小相似的寄主细胞内含物；要获得高纯度的病毒制品，则需要在粗提纯样品的基础上，进行植物病毒的精提纯；病毒精提纯最常用的是密度梯度离心法和差速离心法。

（5）产量和质量的测定。

影响植物病毒提纯的因素：内在因素（病毒在植物体内的浓度、病毒形态和大小、株系、稳定性）、外

在因素（缓冲液种类、浓度及PH、附加成分、澄清剂、离心力和密度梯度离心方式的选择等）。

6. 植物病毒提纯的原理？

在研究植物病毒时，往往需要把病毒从寄主组织内提取出来加以纯化以用于研究病毒的理化性质、分

子生物学特性及制备抗血清等。

由于病毒既不能像其他微生物那样用培养基来培养，更不能像细菌那样在培养基上测定他们的生理生

化特性。因此，必须将病毒组分从寄主组织中分离纯化出来。

植物病毒的提纯主要指理化提纯，即利用各种理化方法，根据病毒和寄主细胞组分的理化特性差异使

病毒与植物中的其他组分分开，得到具有侵染力的浓度和纯度较高的病毒。

简述ELISA检测植物病毒的基本原理。

①酶联板表面具有吸附大分子的能力;②抗原和抗体具有特异性结合能力;③酶标抗体（A蛋白）具有特

异性识别抗体和酶催化作用; ④在酶放大的作用下, 使不可见的分子识别反应变为可见的颜色变化；⑤抗原的数量正比于酶的数量即颜色的深浅，从而进行抗原的定性或定量。

7. ELISA检测植物病毒的常用方法有哪几种？以其中的一种方法为例，列出其具体步骤。

间接法、双抗体夹心法、竞争法。

双抗体夹心法：（1）首先以已知抗原包被酶标板，吸附一定时间后，洗涤未结合的可溶性抗原成分。（2）

在吸附有抗原的酶标板中，加入待测血清，孵育一定时间，使待测血清中的特异性抗体与包被抗原充分反应、结合，之后充分洗涤未与抗原结合的游离抗体成分。（3）在吸附有抗原抗体复合物的酶标板中，加入针对待测抗体来源种属的酶标二抗。（4）酶标二抗吸附一定时间后，充分洗涤，去除未结合成分。（5）加入标记酶的相应底物，孵育一定时间后显色。

8. ELISA检测植物病毒有哪些突出优点？

（1）灵敏度高，检测浓度可达1-10ng／ml；

（2）快速，结果可在几个小时内得到；

（3）专化性强，重复性好；

（4）检测对象广，可用于粗汁液或提纯液，一般不受抗原形态的影响；

（5）适用于处理大批样品，所用基本仪器简单，试剂价格较低，且可较长期保存。

9. 请列出琼脂免疫双扩散实验检测植物病毒的步骤？

（1）取1g琼脂糖假如100mL磷酸缓冲液（PB）至琼脂完全融化，加蒸馏水至100mL，放在热水浴中待

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用。

（2）将融化的琼脂倒入玻璃培养皿约2mm厚，室温下防止30min使凝固。

（3）制备病毒样品，如为球形病毒，1g新鲜叶组织加10mL缓冲液研磨；如为长条病毒，1g新鲜叶组织加10mL缓冲液再加1mL3%SDS研磨。将职业放入微量离心管中3000rpm离心2min备用，根据需要，办提纯样品液也可作为样品。

（4）用生理盐水稀释抗血清为三个浓度1:2,1:4,1:16。

（5）用打孔器在凝固的琼脂板上打孔，课有各种大小及排列形式，常用为1～５ｍｍ直径和梅花状排列，用镊子、针头或抽吸器去掉孔中凝胶。

（6）加样时因实验的目的不同而有不同的组合方式，常用的为中心孔加抗血清，周围孔加抗原及键株对照，加样量以满面而不溢出为度。

（7）25℃下保存孵育24～48h，观察沉淀线的形成，记录结果。

10. 假如你在田间发现一感染白菜病毒病的植株，请设计一实验方案检测该病株的病原物。

（1）观察病害的症状，对病原病毒的种类做出初步判断

（2）植物病毒的提纯：①白菜病原病毒的毒源繁殖②病毒汁液的抽提，注意添加合适的保护剂，选择合适的提取缓冲液③提取液的澄清④病毒浓缩和精提纯⑤产量和质量的测定

（3）植物病毒的鉴定：①生物学实验②电子显微镜技术③血清学技术④分子生物学方法

11. 简述病原真菌的单孢分离常用的方法。

（1）琼胶平板稀释纯化法；（2）稀释纯化法；（3）琼胶平板表面单孢子挑取法；（4）玻璃毛细管分离法；（5）干孢子分离法；（6）显微操作器分离法。

12. 简述文献检索中的5S检索新理念。

Select---选择合适的数据库

Search---如何精确查找文献

Sort---文献的筛选与归类

Systematize---文献管理软件的使用

Strategy---如何从文献中发现idea?

13. 怎样运用柯赫氏法则对某一植物病害进行诊断？

(1)在病植物上检测到一种病原微生物存在；

(2)将该微生物在离体的或人工培养基上分离纯化而得到纯培养；

(3)将纯培养接种到相同品种的健株上，出现症状相同的病害；

(4)从接种发病的植物上再分离到其纯培养，性状与接种物相同。

14. 植物病毒的检测与鉴定方法主要有哪些？

（1）生物学实验。鉴别寄主谱

（2）电子显微镜技术

（3）血清学技术。①琼脂免疫双扩散②点免疫印迹分析（DIBA）③酶联免疫吸附反应（Enzyme-linked immuno-sorbent assay,ELISA）

（4）分子生物学方法。①聚合酶链式反应（PCR）：逆转绿PCR（RT-PCR）、实时荧光定量PCR（real-time PCR）。②核酸杂交:斑点杂交（spot blot hybridization）、凝胶电泳印迹转移杂交（Southern blot hybridization）、原位杂交（in-situ hybridization）。③核酸定量分析。

15. 在植物病毒提纯过程中应注意哪些事项？

16. 列举五种以上常用的培养基。

LB培养基、White培养基、MS培养基、PDA培养基、N6培养基、营养琼脂培养基（NA培养基）。

17. 制备好的培养基保藏时的注意事项。

（1）防尘

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已经灭好菌的培养基要注意防尘。如果培养基在卫生条件差的地方贮存，依附在尘埃中的细菌、真菌等会落在培养瓶表面，使用前若不进行表面灭菌处理，在接种时就容易随着气流进入容器，使其受到污染，影响组织培养工作的顺利进行，因此培养基必须放在干净、卫生的接种室内。

（2）避光

用培养基应贮于光线较暗的房子里面，因为吲哚乙酸等某些物质易见光分解。在光照下，一些培养基添加物的成分也会发生变化。在接种室里挂上较厚的窗帘或在培养基的箱子上加盖厚的黑布，这样可以使培养基免受光线的影响。

（3）恒温

培养基冷却后，可以将其放在10℃左右的冰箱中贮藏3～5周；在大批量生产中可以放在装有空调的接种室内，摆放2周左右，温度控制在20℃以内；若摆放时间为2～5d，温度不超过28℃即可。但是在培养基摆放过程中温度不应过高，同时还应避免温度有较大幅度的变化，随着贮藏室气温的升高或降低，装有培养基容器内的空气会跟着膨胀或缩小，带来菌类进入培养基，造成贮藏期间培养基的大量污染。

（4）定期更新

培养基不宜长期贮存，特别是固体培养基。随着时间的推移，培养基里的水分以气态选出，培养基的含水量便逐渐降低，使培养基的浓度和理化性状发生改变，对以后的外植体培养或植株的继代转接及生根培养均不利；培养基贮存过长，空气中夹杂的细菌、真菌也可能降落到培养基表面引起污染；当贮藏含有吲哚乙酸、椰乳等物质的培养基时，环境中的光线会使吲哚乙酸发生光解，也会使椰乳所含的一些成分发生变化。因此结合生产任务做好培养基的配制和使用计划十分必要，一般情况下培养基贮存时间不应超过1周。

18. 以一种植物真菌病害为例，叙述病原菌的分离、纯化和保存的方法。

（1）分离前的准备工作

①工作环境的分离和消毒

分离培养一般在超净工作台上进行，使用前用紫外线灯照射30分钟灭菌，用70%酒精擦手消毒。

②分离用具的消毒

凡是和分离材料接触的器皿(刀、剪、镊、针等)都要随时(至少在使用时)保持无菌，将这些用具浸于70%酒精中，使用时在灯焰上灭菌烧去酒精，如此2-3次(刀、剪、镊等不宜在灯焰上烧时过长，以防退火)。再次使用时必须重复灭菌。培养皿、试验等要经过干热灭菌。培养基及洗涤或稀释用蒸馏水都需要事先经过高压蒸气灭菌。

③分离材料的选择

用新发病的玉米大斑病植株叶片做为分离材料，可以减少腐生菌的污染。任何植物坏死部分的内部或表面，都可能有腐生微生物的孽生，所以一般斑点病害应从邻近健全组织，即从病、健组织交界处获得分离材料。

（2）植物病原菌的分离

将病斑部分剪成边长2 ～ 3 mm 的正方形小块，如病斑过大，则可以只剪下部分病健交接处。然后在超净台内，将病斑小块用75%乙醇消毒30 s 后，用无菌水清洗3 次。之后用镊子夹起病斑小块，臵于灭菌后的滤纸上吸干其多余水分，然后平臵于PDA 培养基平板中，放于25℃的培养箱中黑暗培养。

（3）制备适宜浓度的孢悬液

已培养5 d 左右并已充分产孢的玉米大斑病菌从培养箱中取出，在超净工作台上用接种铲划取一小块培养基，臵于灭菌后的空试管中，加入3 ～ 4 ml 的无菌水，并盖上棉塞，用手振荡数次后制成孢悬液。在此步骤中，要避免振荡力度过大造成菌丝从培养基上脱落以及培养基解体，从而造成孢悬液杂质过多。用灭菌的玻棒蘸取一滴制备好的孢子悬浮液于载玻片，并在显微镜下镜检计数，将孢子浓度调节到4 × 10 倍下每视野1 个孢子左右，以备平板涂布用。

（4）平板涂布

将上述制备好的孢悬液涂布在WA 平板上。在此步骤中，因为孢悬液中还含有断裂的菌丝和培养基中其

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他杂质，所以在涂布前应将孢悬液静臵1 ～ 2 min，尽量只使用试管上半部分的孢悬液进行涂布。同时，在涂布时为防止污染以及简化操作，可以直接将孢悬液倒于WA 平板上，稍后再将培养基中多余孢悬液倒出，在超净工作台上开盖，并用无菌风吹干。之后臵于25 ℃培养箱中培养10 h 左右，待其萌发后用于单孢的分离。

（5）单孢分离

经孢悬液涂布后并在28 ℃黑暗培养条件下的WA 培养基上，玉米小斑病菌孢子已经萌发，但未形成大面积菌丝以及孢子与孢子间菌丝交叠的情况，此时便可以进行单孢分离。首先用解剖刀将（4）中制备的涂布有玉米大斑病孢悬液的WA平板切成1.5cm × 5.0 cm 左右的方块，然后将整块转移至已灭菌的载玻片上，并臵于4 × 10倍显微镜下观察并调节视野，保证已经萌发的玉米大小斑病孢子位于视野中央，而未有其他孢子出现在此视野中。之后用解剖刀在WA平板上切块，此时不需移动载玻片以及显微镜，使解剖刀直接在载物台上进行操作。最后用接种针挑取切得的琼脂块，转移至PDA 试管中保存备用。

（6）再纯化

重复步骤（3）（4）（5）

（7）斜面低温保存

将菌种接种在适宜的PDA斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用封口膜包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。

19. 在对植物病害进行诊断时，应注意哪些事项？

（1）症状的复杂性和多变性

同症——不同病原物在同一寄主上表现相同的症状。如由缺素引起的黄化、根部线虫的危害和病毒侵染引起的症状很难区分。属同症。

异症——在不同寄主上、或同一寄主的不同部位、不同生育期或不同环境条件下，症状表现不同。如苹果锈果病（国光、青香蕉上为锈果型，祝光、花红上为花脸型，元帅、倭锦为混合型）、小麦—小檗锈病（小麦上夏孢子堆——黄粉，和冬孢子堆——铁锈状粉）、苹果腐烂病（小枝干腐，大枝湿腐）、白粉病（生育前期白粉，后期黑色小颗粒状物）等。

复合症状（复合侵染）——两种以上病原所致，可各自表现，也可只表现一种。如白粉病和锈病复合侵染，各自表现；病毒和线虫危害只表现黄化等。

潜伏侵染——侵染了但未表现症状，带毒现象；隐症现象（高温隐症）。

（2）病害与虫害的区分

虫害有虫孔、取食后的伤痕、缺刻，排泄物，隧道等。

（3）病原物与腐生物的区分

腐生物大量存在，多易生在死亡组织和腐烂、水分多的部位。这就要一方面分离培养鉴定，另外作病征观察时，注意病征出现的（普遍性、一致性和大量性）特点。但有时仍很难判断，就需要柯赫氏法则进一步验证。

（4）并发性病害和续发性病害

并发性病害：一种病害发生的同时，伴随着另一种病害的发生。例如，柑橘线虫病发生同时，常伴随着衰退病发生。

续发性病害：当植物发生一种病害后，可继而发生另一种病害，后者称续发性病害。例如，梨裂果病，常续发霉心病、青霉病等。

20. 假如你在田间发现一株表现明显某一病害症状的水稻，请你设计一实验方案以明确该病株的病原。

（1）对田间病害症状进行观察及样本采集

（2）病原菌的分离、培养、致病性测定和形态观察 ：按照常规的方法对采集的水稻叶片和茎杆、谷粒 样本进行分离和培养： 分别切取约5 mm×5 mm 的小块病组织， 经过70％乙醇和0.1％升汞消毒、灭菌水