鸡减蛋综合症EDS76油乳剂灭活苗免疫效果对比试验

２００９年第３期

Ｓａ５抑菌作用最强，对Ｓａ３和Ｓａ４次之，对Ｓａｌ和Ｓａ２的抑菌作用最弱。说明黄连水提取物对同种菌不同株的抑菌效果不同。

３．２黄连醇提取物对耐药金黄色葡萄球茵的作用

黄连醇提取物对Ｓａｌ、Ｓａ２、Ｓａ３、Ｓａ４和Ｓａ５的抑菌圈直径（ｍｍ）分男０为１７．７５±１．５、１４．２５±１．２５、１３．２５±０．９５、２６±１．４１和２６．７５±１．５；极敏菌株为Ｓａ４和Ｓａ５；高敏菌株为Ｓａｌ；中敏菌株为Ｓａ２和Ｓａ３；黄连醇提取物对Ｓａｌ、Ｓａ２、Ｓａ３、

Ｓａｔ和Ｓａ５的ＭＩＣ分别为０．０１６ｇ／ｍＬ、０．０３ｇ／ｍＬ、０．０１６ｇ／ｍＬ、

０．００８

３．４

中药ＭＩＣ测定方法探讨

本试验中采用葡萄糖酚红ＬＢ液体培养基代替普通液体

培养基，利用了细菌发酵葡萄糖产酸，使酚红指示剂变为黄色的特性，解决了中药ＭＩＣ不易判定的难题，使试验结果便于直观判定。判定结果时，若药液透明可以直接读取，若混

浊吸取０．１ｍＬ涂布琼脂培养基，３７℃培养１８ｈ后观察结

果。以无菌生长的最低稀释度为该中药粗提物的ＭＩＣ。

４结论

试验结果显示，黄连提取物对耐氟喹诺酮类药物的金黄色葡萄球菌有抑制作用，但对不同株型抑菌效果有差异，对ＳａＣ和Ｓａ５抑菌作用最强，对Ｓａ２抑菌作用最弱。参考文献：

［１］中华人民共和国药典编委会．中华人民共和国药典 一

部［ｓ］．北京：中国化工出版社，２００５：２１３．

［２］韩文瑜，冯书章．现代分子病原细菌学［Ｍ］．长春：吉林

人民出版社，２００３．

ｇ／ｍＬ和０．００８ｇ／ｍＬ；黄连醇提物对Ｓａｔ和Ｓａ５抑菌作

用最强，其次是Ｓａｌ和Ｓａ３。对Ｓａ２抑菌作用最弱。

实验结果表明，黄连水提物和醇提物抑菌圈直径和ＭＩＣ虽然存在差异。但差异不大。这可能是因为黄连的主要化学成分小檗碱在热水和热乙醇中均溶解的原因。据报道，黄连中４种主要的生物碱——小檗碱、药根碱、黄连碱和巴马亭的敏感菌范围相同，但抑菌活性不同，其中小檗碱的抑菌活性最大，黄连碱和巴马亭次之，药根碱最小。说明小檗碱是起抑菌作用的主要成分，对耐药菌株有较好的抑制作用。

３．３

［３］陈友梅．中药化学［Ｍ］．济南：山东科学技术出版社，

１９８８．

实

打孔法［４］陈琦．常用药理实验中药制剂的制备方法［Ｍ］．北京：

人民卫生出版社．１９８８．

［５］杨建江。韩文瑜，杜锐，等．３０种中草药对耐药性猪链

球菌的抑菌试验［Ｊ］．中兽医医药杂志，２００４（２）：１４—

１６．

验

技术

打孔法测定结果与抑菌圈直径和ＭＩＣ测定结果相符合。Ｓａ３、Ｓａ４、Ｓａ５抗生素孔和中药孔中间均未见细菌生长，Ｓａｌ、Ｓａ２抗生素孔和中药孔之间长有细菌，进一步说明黄连提物对ＳａＣ和Ｓａ５抑菌作用最强，对Ｓａ３抑菌效果亦比较强，对Ｓａｌ、Ｓａ２作用最弱。采用打孔法可以确定中药对耐药菌有元抑制作用，凡抗生素孔和中药孔之间未见细菌生长者确定中药对耐药菌有抑制作用，抗生素孔和中药孔之间有细菌生长者判定中药对细菌无抑制作用。通过采用平板挖孔法，将中药和抗生素在同一琼脂板上进行联合作用，可以较方便地从众多中药中筛选出抗生素的耐药抑制剂。

［６］武佳，谭桂莲，杨红．黄连中盐酸小檗碱提取工艺探

究［Ｊ］．时珍国医国药，２００７，１８（２）：４３７．

［７］徐叔云，卞如濂，陈修．药理实验方法学［Ｍ］．北京：人

民卫生．１９８２：１０６３—１０６７．

【８］韩文瑜．病原细菌检验技术［Ｍ］．长春：吉林科学技术出

版社。１９９２．

鸡减蛋综合症（ＥＤＳ一７６）油乳剂灭活苗免疫效果对比试验

陈智华１，贺奋义１”，郭慧琳２，陈伯祥２

（１．甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州７３００７０；２．甘肃省畜牧兽医研究所）

中图分类号：￥８５８．３１

文献标识码：Ａ

文章编号：１０００—６３５４（２００９）０３—００３６一０３

鸡减蛋综合症（ＥＤＳ一７６）是２０世纪７０年代后期发现的一种病毒性传染病，既可水平传播，又能垂直传播。不同年龄的肉鸡、蛋鸡均可感染本病，６—８日龄母鸡处于发病危险期。本病可使产蛋率下降１０％一３０％，最高达４ｌ％，蛋的破损率达３８％一４０％，无壳蛋、软壳蛋可达１５％。是导致养鸡业巨大经济损失的五大病毒性传染病之一。笔者等在对甘肃省鸡减蛋综合症引起的损失进行调查分析的基础上，对防

制本病的灭活疫苗进行了比较系统的研究。通过ＥＤＳ一７６鸭胚尿囊液、羊水、尿囊膜（包含羊膜）的含毒量测定，对ＥＤＳ一７６四元材料病毒油乳剂灭活苗、尿囊液毒油乳荆灭活苗、羊水毒油乳剂灭活苗和尿囊膜（包含羊膜）毒油乳剂灭活苗免疫效果进行了对比。

１材料与方法

１．１病毒

ＥＤＳ一７６标准毒株Ｋ—１１，购自中国兽医药品监察所。

１．２

鸭胚

来自未感染ＥＤＳ一７６病毒的健康鸭群的种蛋。

警中箕厘压荔毒点。可＠凹咖

２００９年第３期

１．３标准抗原

购自中国兽医药品监察所，效价１：６４０。１．４红细胞来源

日龄雏鸡ｌＯ只。与空白对照组同条件下隔离饲养，每ｌ一２对雏鸡称重，观察疫苗对雏鸡生长的影响。１．９对比试验

ｄ

健康成年伊莎褐公鸡。１．５试验方法

将基础种毒用灭菌生理盐水按１：１０稀释，经尿囊腔接

种９日龄发育良好的鸭胚，每胚０．１ｍＬ，收获４８—１２０ｈ死亡的鸭胚尿囊液和１２０ｈ有病变的活胚尿囊液。连续盲传５

用尿囊膜（包含羊膜）制成的疫苗（Ｉ号苗）、尿囊液制成的疫苗（Ⅱ号苗）、羊水制成的疫苗（Ⅲ号苗）和四元材料制成的疫苗（Ⅳ号苗）分别进行同剂量下免疫效果对比试验。每种疫苗选用伊莎褐鸡２００只，随机分成２组，每组１００只，一组用来作疫苗同剂量抗体消长水平测定，另一组用来作疫苗的免疫持续期测定；每个试验设一非免疫空白对照组，伊莎褐鸡１００只。免疫后每隔１—２月监测一次鸡血清中的ＥＤＳ一７６抗体效价。

２结果

代，当第５代鸭胚尿囊液血凝价达１５ｌ０９２以上，作为生产种毒，一８０℃保存。将生产种毒稀释５０—１００倍，经尿囊腔

接种于９Ｅｔ龄鸭胚，每胚０．１ｍＥ，置３７℃温箱培养，弃去

４８

ｈ内死胚，分别收获４８—１２０ｈ死亡鸭胚的尿囊液、羊水、

尿囊膜（包含羊膜）和１２０ｈ有病变的活胚尿囊液、羊水、尿

２．１疫苗的检验

２．１．１无菌检验经常规检验，无杂菌生长。

２．１．２安全性检验检验结果见表１。由表１可见该疫苗是安全的。

囊膜（包含羊膜）。当血凝价达１５ｌｏ萨以上，即为ＥＤＳ一７６

制苗用毒。

１．６病毒的灭活

将收获的鸭胚尿囊膜（包含羊膜）反复冻融后研磨。按ｌ：５的比例加入灭菌的生理盐水，洗涤３次，离心３次取上清液加入双抗过夜后，加入终浓度为０．１％的甲醛，２０℃

灭活４８ｈ，为制苗的抗原基础液Ｉ，备用。

表ｌ灭活苗对鸡安全性试验

疫苗ＩｌＩ

ｉｌｌ

剂量／ｍＬ

１．Ｏ／１．５１．０／１．５１．０／１．５１．０／１．５

鸡数

１０／１０１０／１０１０／１０１０／１０

日龄

３５３５３５３５

观察天数

１４１４１４１４

临床反应．’

无无无无

实

将收获的尿囊液、羊水分别离心，加双抗过夜后，加入

０．１％甲醛，２０℃灭活４８ｈ，为制苗抗原基础液Ⅱ、Ⅲ，备用。

验

技术

Ⅳ

将收获的鸭胚液离心。加双抗过夜后，加Ｏ．１％的甲醛，

２０℃灭活４８ｈ。与抗原基础液Ｉ混合组成抗原基础液Ⅳ，备用。

１．７油乳剂苗的配制

２．２急性毒性试验

通过油乳剂灭活疫苗对１日龄雏鸡急性毒性试验表明，该疫苗均无急性毒性作用。２．３对比试验

结果见表２、３。表２结果表明，４种疫苗在同剂量下免疫抗体消长水平基本一致。从表３中可以看出，免疫１２个月后，ＥＤＳ一７６的Ｈｌ抗体效价均在５．９ｌｃＩ萨以上，同时证明这４种油乳剂苗的免疫持续期基本一致。

３小结

将抗原基础液Ｉ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分别调整到配苗所需抗原量，在抗原液中加入４％灭菌Ｔｗｅｅｎ一８０，摇匀，成为Ｉ、ⅡⅢ、Ⅳ号制苗水相，待用。将轻质药用白油、司本８０和

硬脂酸铝按照９４ｍＬ＂６ｍＬ：１．７５ｇ的比例配制油相（混合物），高压灭菌１５ｒａｉｎ，备用。油相８０００—１００００ｒ／ｒａｉｎ搅

拌的同时，按１：１的比例分别缓慢加入Ｉ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ号水相，

乳化３ｒａｉｎ，在终止搅拌前加０．Ｏｌ％硫柳汞溶液，即成为乳白色Ｉ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ号油乳剂苗。

３．１通过尿囊膜（包含羊膜）、羊水、尿囊液和四元材料四种疫苗的安全性检验与急性毒性试验分析表明，这４种疫苗性能基本一致。

３．２通过四元材料混合苗、尿囊液毒苗、羊水毒苗、尿囊膜（包括羊膜）毒苗在免疫抗体消长水平和免疫持续期的对比试验，结果表明差异不显著，表明四元材料苗与目前广泛使用的尿囊液毒苗在性能上是一致的。

１．８疫苗的检验

１．８．１无菌及安全检验按常规方法检验霉菌和杂菌。每批疫苗选用５周龄的易感鸡（ＨＩ抗体≤１：５）２０只，每组ｌＯ只，分别胸肌注射疫苗１．０ｍＬ和１．５ｍＬ。观察１４ｄ，检查注

射部位和全身反应情况。

１．８．２急性毒性试验每种疫苗以１个使用剂量皮下注射ｌ

裹２

‘｜痉苗

、

４种疫苗免疫抗体消长水平测定结果

鸡数

／其

Ｉ

ＩＩ

１００１００１００１００１００

剂量

／ｍＬ０．５０．５０．５０．５

１１０．６１０．８１０．５１１．２

２１０．４１０．６１０．３１０．７

３９．６１０．１９．５１０．５

４

叁壅旦至旦堕塑！星！曼竺！坚！垫堡垄垩！！哩！

５８．８９．５８．７９．８

６８．５９．０８．３９．２

７８．１８．５８．０８．６

８７．６７．７７．１８．０

９６．８６．９６．７７．２

１０６．６６．７６．５６．８

１１６．０６．１６．２６．４

１２５．８６．０５．９６．０

９．２９．９９．１１０．０

．：

ｊ

Ⅲ１Ｖ对照组

２００９年第３期

表３

里空兰堡堡垩童墨竺！竺兰竺

剂景

免疫前ＨＩ

鸡数

免疫后不两时问（月）Ｈｌ抗体水平（Ｉ０９２）

…

４种疫苗免疫持续期测定结果。。

盐。。

。［竺生

０．５Ｏ．５Ｏ．５０．５

垄兰！！鳇堡

１．２１．３１．３１．２１．４

』星

１００１００Ｉｏｏ１００１００

ｌⅡ皿Ⅳ

竺一。。！竺一。．！！

１０．６１０．７１０．４１０．８

１０．５１０．６１０．３ｌＯ．７

１０．２１０．４１０．２ｌＯ．６

。一！

９．９１０．１９．８ｌＯ．２

。

！一一

９．２９．５９．１９．８

垒一．。。！一。！。＿＆

７．２７．３７．０７．６

６．４６．５６．２６．７

６．０６．０５．９６．２

对照组０试验期均在２．０以下

自拟中草药复方对奶牛乳房炎致病菌体外抑菌试验

喻华英，陈

伟，单俊娟

（塔里木大学动物科技学院，新疆阿拉尔８４３３００）

中图分类号：￥８５３．７４

文献标识码：Ａ

文章编号：１０００—６３５４（２００９）０３—００３８—０３

缩至生药含量ｌｅ，／ｍＬ，１０００ｒ／ｒａｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液，１１５℃蒸汽灭菌１０ｍｉｎ。后置４℃冰箱中保存备用（３ｄ用完）。

奶牛乳房炎是危害奶牛养殖业最常见的疾病，引起奶牛乳房炎的病原菌很多，主要致病菌为金黄色葡萄球菌、表皮

实

葡萄球菌、停乳链球菌、无乳停乳链球菌和大肠杆菌等…。应用抗菌药物治疗乳房炎是国内外普遍采用的主要措施之一，但随着抗菌剂长期大剂量的广泛使用，细菌耐药性和抗菌药物乳中残留问题被普遍关注。中药作为天然药物，不仅不存在药物残留带来的公共卫生问题，而且许多中药还是很好的免疫调节剂，因此，用中药治疗奶牛乳房炎的研究成为近年来的热门课题。一些中药复方制剂和中药提取物制剂。已经在奶牛乳房炎的防治方面发挥了重要作用。笔者在前人研究基础上，自拟了５帖中草药方剂，对塔里木地区奶牛乳房炎主要致病菌表皮葡萄球菌、克雷伯氏菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等进行体外抑菌试验，为该地区奶牛乳房炎防治提供理论依据。

１材料与方法

１．１

１．３．２培养基的制备血清琼脂平板、普通琼脂平板、血清琼脂斜面、普通琼脂斜面、普通肉汤、血清肉汤，均按常规方

法配制。

验

技术

１．３．３测试菌液的制备在已分离鉴定的保存菌株中挑取

２—３接种环，接种于含５ｍＬ营养肉汤中（停乳链球菌接种于

血清肉汤中），置３７℃培养箱中培养２４ｈ后，取１ｍＬ于普通

琼脂平板上培养８—１２ｈ（停乳链球菌接种于血清琼脂平板中

培养１２—１８ｈ），用Ｌ棒刮下菌苔，用１０ｍＬ灭菌生理盐水稀

释，与标准麦氏比浊管比浊。根据比浊管所含的细菌浓度稀释

成所需的菌悬液浓度，即细菌悬液中细菌数为１×ｌｏ＇ＣＦＵ／ｍＬ。１．３．４抑菌试验一打孔法１．３．４．１琼脂浓度的筛选

为了寻求对中草扩散最好的琼

脂浓度。分别取琼脂浓度为１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％，以１．４％浓度琼脂对中药扩散最好。１．３．４．２平板的厚度平板所用培养基都在１３—１５

ｍＬ。

中药

复方ｌ：连翘、蒲公英、金银花等。复方２：金银花、蒲公英、连翘、黄连等。复方３：金银花、连翘、黄芩等。复方４：黄芩、黄柏、丹参、等。复方５：金银花、野菊花、连翘、蒲公英等。

１．２茵株

１．３．４．３打孔法取供试菌液１ｍＬ，倾于普通琼脂平板表面（停乳链球菌需ＴＨＢ琼脂平板），涂布均匀，置无菌操作

台内３—５ｍｉｎ（试菌液充分被琼脂吸收），并用打孔器打孔（６ｍｉｌｌ）；在酒精灯上烘烤封底，每孔加满药液（５０斗Ｌ，不能溢出），３７℃培养２４ｈ，观察并记录复方中药对各种菌抑茵

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、停乳链球菌、蜡样芽胞杆菌、克雷伯氏菌，由塔里木大学动物科技学院微生物实验室及传染病实验室鉴定、提供。

１．３１．３．１

圈直径的大小（ｍｍ），每种药做３个重复旧】。１．３．５中药对病原菌抑菌浓度的测定方法

中药对病原菌

方法

中药的制备

中药的制备采用水提法，以复方ｌ

最小抑菌浓度（ＭＩＣ）和最小杀菌浓度（ＭＢＣ）的测定方法，以大肠杆菌对复方１的敏感性为例，将灭菌的装有１ｍＬ普通肉汤（停乳链球菌培养于血清肉汤中）的试管编号。在第ｌ管内

加１ｍＬ药液，混匀后吸取１ｍＬ至第２管，依次类推至第９管弃去ｌｍＬ；第ｌＯ管为不含药液的肉汤对照，第１１管为含药物而不含肉汤的药物对照，然后，向每管加入含１

ｘ

为例。取已称好的复方１．置于烧杯中，加５一ｌＯ倍纯化

水浸泡４ｈ后煎煮，武火加热至沸后文火维持３０ｍｉｎ，用４

层纱布过滤，滤渣按上述方法再煎煮１次，合并２次滤液，浓

１０５亿

个／ｍＬ的菌液。第ｌ一９管药物浓度分别为５００、２５０、１２５、

６２．５、３１．３、１５．７、７．８、３．９、２．０ｍｇ／ｍＬｏ“。